一種結核分枝桿菌的檢測試劑盒及應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種結核分枝桿菌的檢測試劑盒及應用，一種結核分支桿菌的檢測試劑盒，包括包被液；洗滌液；封閉液；終止液；抗原Rv1040c；抗原Rv2309A。本發(fā)明所述試劑盒具有操作簡便、成本低、精確度高、操作者友好、設備簡便等優(yōu)點，本發(fā)明利用混合抗原進行包被，克服了單一抗原在進行診斷時，存在很大的個體差異性的問題，并且，混合抗原的檢測效果在靈敏度，精確性和特異性方面都要優(yōu)于單獨抗原。與目前市售的同類試劑盒相比，無論是在特異性、假陽性率或是檢出率上，優(yōu)勢更明顯，本發(fā)明所述的試劑盒在檢測結核分枝桿菌上具備廣闊的應用前景。
【專利說明】-種結核分枝桿菌的檢測試劑盒及應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于免疫檢測【技術領域】，具體涉及一種結核分枝桿菌的檢測試劑盒，同時 還涉及該試劑盒在檢測結核病藥物中的應用。

【背景技術】
[0002] 結核病是一種嚴重的傳染性疾病，是當今世界面臨的主要公共健康問題之一，曾 在世界范圍內(nèi)出現(xiàn)過大流行。它的病原體是結核分枝桿菌，屬分支桿菌屬。隨著比較有效的 抗結核藥物的出現(xiàn)，結核病的發(fā)展在全球得到過充分的抑制，但是近些年來由于結核分枝 桿菌多重耐藥菌株的出現(xiàn)，使結核病的發(fā)病率又再度回升，全球結核病形勢出現(xiàn)了惡化趨 勢。據(jù)W冊統(tǒng)計，全球約有1/3的人口（約20億）被結核分支桿菌感染。據(jù)我國在2000年 的第四次全國結核病流行病學的抽樣調(diào)查結果估算，我國約有450萬活動性肺結核病人， 每年有13萬人死于肺結核，是全球22個結核病高負擔國家之一，結核病人數(shù)為世界第二。
[0003] 早期的診斷治療對于結核病的預防和治療有著非常重要的作用，現(xiàn)階段的診斷包 括姨涂片法、姨結核菌培養(yǎng)、X線檢查和血清學檢測等方法。其中，血清學檢測由于其操作 簡便、成本低、精確度高、操作者友好、設備簡便等優(yōu)點，在對結核病的檢測方面應用前景非 常廣闊，但是現(xiàn)在所使用的抗原存在著特異性差、假陽性率高的缺點，并且現(xiàn)在的一些商業(yè) 試劑盒檢出率低、假陽性率高，因此急需研發(fā)出更為有效的特異性抗原來提高血清學檢測 的效果。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是在于提供了一種結核分枝桿菌的檢測試劑盒，本試劑盒由一對混 合抗原組成，為Rvl040c和RV2309A，其序列分別為SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3所示。單 一抗原在進行診斷時，會存在很大的個體差異性，而混合抗原的出現(xiàn)可W克服該一缺點。并 且，混合抗原的檢測效果在靈敏度，精確性和特異性方面都要優(yōu)于單獨抗原。
[0005] 本發(fā)明的另一個目的是在于提供了一種結核分枝桿菌試劑盒在制備檢測結核 分枝桿菌試劑中的應用，本試劑盒與商業(yè)試劑盒TB-DOT相比，其靈敏度，精確性和特異 性都要優(yōu)于TB-D0T。和商業(yè)試劑盒TB-CHECK-I相比，在靈敏度和精確度方面都要優(yōu)于 TB-C肥CK-I。
[0006] 為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用W下技術措施：
[0007] 本發(fā)明通過基因工程手段，將結核分枝桿菌Rvl040c和RV2309A蛋白在體外表達、 純化，并將Rvl040c和RV2309A蛋白混合制備混合抗原及抗原檢測試劑盒，本試劑盒能特異 性的檢測結核分枝桿菌的抗體，能區(qū)分經(jīng)卡介苗免疫的健康人群和被結核分枝桿菌感染的 患結核病的人群。可用于結核病的臨床血清學檢測。
[0008] -種檢測結核分枝桿菌的試劑盒，它包括W下組份：
[0009] 包被液；〇. 〇5MpH9. 6的碳酸鹽緩沖液；
[0010] 洗涂液：含0. 05% (v/v)吐溫-20的PBS溶液；
[00川封閉液：含5% (w/v )脫脂牛奶的洗涂液；
[0012] 終止液；2MH2S04;
[0013] 抗原Rvl040c，其序列為SEQ ID NO. 2所示；
[0014] 抗原RV2309A，其序列為SEQ ID NO. 3所示。
[0015] 一種結核分枝桿菌基因表達載體組氨酸標簽融合表達載體祀T甜a的構建方法， 其步驟如下：
[0016] (1)將商業(yè)購買的載體祀T28a上的甜a I酶切位點消除，獲得一個中間載體 pET28a-A X ;
[0017] (2)將步驟（1)獲得的載體祀T28a-AX用限制性內(nèi)切酶Nde I和化O I進行消 化；
[0018] (3)利用極端嗜熱古菌S. solfataricus的cdc62基因作為第一個媒介基因，通過 PCR的方法從極端嗜熱古菌S. SOlfatari州S基因組中擴增獲得末端含有Nde I和化0 I酶 切位點的cdc62媒介基因；
[0019] (4)將步驟（3)獲得的媒介基因cdc62用限制性內(nèi)切酶Nde I和化0 I進行消化；
[0020] (5)將步驟（2)獲得的載體和步驟（4)獲得.的媒介基因在16C連接過夜，得到第 二個中間載體祀T28a-62 ;
[0021] (6)將步驟（5)獲得的載體祀T28a-62用限制性內(nèi)切酶EcoR I和化O I進行消 化；
[0022] (7)利用極端嗜熱古菌S. solfataricus的微型染色體維持基因MCM作為第二個媒 介基因，通過PCR方法獲得末端含有EcoR I和化O I限制性酶切位點的MCM媒介基因； [002引（8)將步驟（7)獲得的MCM媒介基因用EcoR I和化O I限制性內(nèi)切酶消化；
[0024] (9)將步驟（6)獲得的載體祀T28a-26和步驟（8)獲得的媒介基因MCM在16C連 接過夜。
[0025] 通過W上方式獲得的表達載體祀T甜a,其大小為6526bp (專利號： 化200910060952. 1)，序列為SEQ ID NO. 1所示。它還包括一個適用于克隆結核分枝桿菌所 編碼基因的多克隆位點。
[0026] 上述步驟（3)中的cdc62基因擴增所用引物對的序列如下：
[0027] 正向引物；GCGCGGCATATGAGAATTCATGAGTGATATAATTGATGAG,
[0028] 反向引物；ATATGACTCGAGTACTCCAGAGATCAGCAAACCT ;
[0029] 上述步驟（7)中MCM基因擴增所需的引物對的序列如下：
[0030] 正向引物；GAGCGAATTCGTTGGAAATTCCTAGTAAAC，
[0031] 反向引物；GGATGGCTCGAGTCTAGACTTTTTTGTAACAT。
[0032] Rvl040c和RV2309A抗原表達載體的構建方法，其步驟是：
[0033] (1)根據(jù)GeneBank提供的結核分枝桿菌冊7Rv基因組序列，查出Rvl040c和 RV2309A的序列并設計引物，通過PCR得到上述兩個基因。PCR結果見圖1。
[0034] (2)將PCR產(chǎn)物分別酶切，用同樣的方法酶切表達載體祀T甜a,之后將Rvl040c和 RV2309A分別和酶切過的pET表達載體連接，分別轉化大腸桿菌D冊a，制備質(zhì)粒。質(zhì)粒電 泳結果見圖2。
[00巧]一種結核分枝桿菌蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的外源表達和蛋白質(zhì)的純化，其步驟是：
[0036] 將得到的祀T-Rvl040c和祀T-Rv2309A轉化化21 (DE3)菌株，從轉化的培養(yǎng)皿上 挑取單菌落分別進行誘導表達，純化。蛋白質(zhì)試表達結果見圖3,蛋白質(zhì)純化結果見圖4。最 終得到Rvl040c和RV2309A抗原，其序列分別為SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3所示。
[0037] -種結核分枝桿菌試劑盒在制備檢測結核病試劑中的應用，其步驟是：
[0038] 包被液；0. 05M、pH9. 6的碳酸鹽緩沖液（化2〇)3 ;1. 59g;NaHC〇3 ;2. 93g;加蒸觸水定 容至1L);
[0039] 洗涂液：含0. 05%(v/v)吐溫-20的PBS溶液（PBS配方參見《分子克隆技術操作指 南》）；
[0040] 封閉液：含5% (w/v )脫脂牛奶的洗涂液；
[00川 終止液；2M恥04 ;
[0042] 具體實施步驟：
[0043] 1.包被；用包被液將混合抗原稀釋，再用微量移液器吸取稀釋好的樣品加 入化ISA板內(nèi)，每孔IOOy 1，4 C過夜；在每孔中加入的IOOy 1包被液中，每孔中含有 Rvl040c37 y mol,含有 Rv2309A:28 y mol。
[0044] 2.洗涂；次日從4°C取出步驟I的ELISA板，甩干內(nèi)容物，向孔內(nèi)加入洗涂液，每孔 200 y 1，靜置3分鐘，甩干，再加洗涂液，如此泡洗H次，最后一次甩干后，將化ISA板朝下放 在濾紙上反復拍打干凈；
[004引 3.封閉；向步驟2的ELISA板中加入封閉液，每孔200 ill, 37C溫育SOmin ;
[004引 4.洗涂；同步驟2的方法；
[0047] 5.加入一抗反應；向步驟4的化ISA板中加入結核病人血清(湖北省武漢市結核 病防治所）稀釋液稀釋400倍，每孔100 y 1，37C溫育30min ;血清排列方式見表5 [004引 6.洗涂；同步驟2的方法；
[0049] 7.加入二抗反應；向步驟6的化ISA板中加入二抗(購自武漢意德生物技術有限 公司）稀釋液稀釋5000倍，每孔IOOy 1，37°C溫育30min ;
[0050] 8.洗涂；同步驟2的方法；
[005。 9.顯色；向步驟8的ELISA板中加入TMB底物(購自武漢意德生物技術有限公司） 顯色，每孔100 y 1，避光30min ;
[0052] 10.終止反應；向步驟9的ELISA板中加入終止液終止顯色反應；
[005引11.結果讀?。豪妹笜藘x讀取0045。的值，
[0054] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有W下優(yōu)點：
[00巧]1.單一抗原在進行診斷時，會存在很大的個體差異性，本發(fā)明利用混合抗原進行 包被，的出現(xiàn)可W克服該一缺點。并且，混合抗原的檢測效果在靈敏度，精確性和特異性方 面都要優(yōu)于單獨抗原。
[0056] 2.操作簡便，成本低廉，高通量，能提高結核病檢測的靈敏度和精確性。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0057] 圖 1 為一種 Rvl040c 和 RV2309A 的 PCR 圖片
[0058] 從左至右；第一泳道為Marker,第二為Rvl040c第H為Rv2309A。
[0059] 圖2為一種Rvl040c和Rv2309A質(zhì)粒PCR示意圖。
[0060] 從左至右；第一泳道為Marker,第二為Rvl040c第H為Rv2309A。
[0061] 圖3為一種Rvl040c和Rv2309A蛋白質(zhì)試表達示意圖。
[0062] 從左至右；第一泳道為Marker,第二泳道為Rvl040c誘導前的菌體，第H泳道 為Rvl040c誘導后的蛋白質(zhì)表達情況，第四泳道為RV2309A誘導前的菌體，第五泳道為 RV2309A誘導后的菌體.
[0063] 圖4為一種Rvl040c和RV2309A蛋白質(zhì)表達示意圖。
[0064] 第一泳道為 Marker,第二為 Rvl040c 第H為 RV2309A.
[0065] 圖5為一種TB-DOT試劑盒示意圖。
[0066] 圖6為一種TB-C肥CK-I試劑盒示意圖。

【具體實施方式】
[0067] 本發(fā)明說如未特別提及，所用引物均有由Invitrogen公司合成；所有未特別說明 的實驗方案或條件均為常規(guī)。
[0068] 實施例1 :
[0069] 一種檢測結核分枝桿菌的試劑盒，它包括W下組份：
[0070] 包被液；〇. 05M pH9. 6的碳酸鹽緩沖液（化2〇)3 ;1. 59g;NaHC〇3 ;2. 93g;加蒸觸水定 容至1L);
[0071] 洗涂液：含0. 05% (v/v)吐溫-20的PBS溶液；
[007引封閉液：含5% (w/v)脫脂牛奶的洗涂液；
[0073] 終止液；2M恥〇4 ;
[0074] 抗原Rvl040c，其序列為SEQ ID NO. 2所示；
[00巧]抗原RV2309A，其序列為SEQ ID NO. 3所示。
[0076] 實施例2 :
[0077] 結核分枝桿菌基因Rvl040c和RV2309A的PCR擴增：
[0078] W結核分枝桿菌(來自武漢市醫(yī)療救治中也）提取冊7Rv的總基因組(登錄號為 NC000962)的DNA，提取方法如下：
[0079] 1)將結核分枝桿菌菌液Iml分裝到1. 5ml離也管，12000rpm/min離也Imin。
[0080] 。去上清，加入Iml單蒸水，于金屬加熱器上IOOC煮IOmin。
[0081] 3) 12000巧m/min離也Imin,吸取上清，上清即含冊7Rv總基因組，備用。
[0082] W提取的總基因組為模版、，根據(jù) Rvl040c (gene bank ID :888533)和 RV2309A (gene bank ID :3205076)設計的引物進行PCR，擴增出所需基因。
[008引其中，引物設計方法為；應用BioEdit軟件，根據(jù)編碼基因內(nèi)部的酶切位點，選擇 基因內(nèi)部沒有的酶切位點組合來設計引物，二個基因都選取EcoR I和甜a I的組合，引物 具體如下：
[0084] Rvl040c f:ATCG GAATTC GC ATGTCATTCCTCAAGACAGT
[0085] Rvl040c r:TATATA TCTAGA CTAGACGGTTGCTGGCTTGG
[0086] Rv2309A f:ATAT GAATTC AT TTGGCCACCAGTAGCGACGA
[0087] Rv2309A r:TATATA TCTAGA TCATGGGCCGACAGGAAGCT
[0088] 表 IPCR 體系
[0089]

【權利要求】
1. 一種檢測結核分枝桿菌的試劑盒，包括以下組份： 包被液：〇. 05M PH9. 6的碳酸鹽緩沖液； 洗滌液：含〇. 05% v/v吐溫-20的PBS溶液； 封閉液：含5% w/v脫脂牛奶的洗滌液； 終止液：2M H2S04 ; 抗原Rvl040c，其序列為SEQ ID NO. 2所示； 抗原Rv2309A，其序列為SEQ ID NO. 3所示。
2. 權利要求1所述試劑盒在制備檢測結核分枝桿菌試劑中的應用。
【文檔編號】G01N33/569GK104237508SQ201310244272
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2013年6月19日 優(yōu)先權日:2013年6月19日
【發(fā)明者】何正國, 張曙光 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學