一種檢測肺癌的液相芯片試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測肺癌的液相芯片試劑盒，包括包被微球，生物素標記的檢測抗體，鏈霉親和素-藻紅蛋白，反應(yīng)緩沖液和稀釋緩沖液，所述包被微球包括包被CRP捕獲抗體的微球、包被Prolactin捕獲抗體的微球、包被CEA捕獲抗體的微球、包被NSE捕獲抗體的微球、包被CK19捕獲抗體的微球、包被Axl捕獲抗體的微球和包被ADAM8捕獲抗體的微球中的至少兩種，其中包被不同捕獲抗體的微球具有不同的顏色編碼；所述檢測抗體與捕獲抗體相對應(yīng)。本發(fā)明的液相芯片試劑盒的敏感度、準確度高，檢測快速，穩(wěn)定性好，成本低廉。
【專利說明】一種檢測肺癌的液相芯片試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測肺癌的液相芯片試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來，我國癌癥的發(fā)生率呈明顯上升趨勢，占死亡原因的20%以上，居各類死因之首。世界衛(wèi)生組織預(yù)測，到2020年，將有2000萬新發(fā)癌癥病例，其中死亡人數(shù)達1200萬，且絕大多數(shù)發(fā)生在發(fā)展中國家。如果不采取任何有效的預(yù)防與控制措施，預(yù)計到2020年，我國每年的新發(fā)生癌癥總數(shù)和癌癥死亡總數(shù)將達300萬左右，患病總數(shù)將達660萬。
[0003]肺癌目前是全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤。近20年來，由于大力推行戒煙，歐洲和美國等西方國家男性肺癌的發(fā)病率已開始下降，但女性肺癌的發(fā)病率卻持續(xù)上升。我國是香煙生產(chǎn)和銷售大國，不論男性還是女性，肺癌的發(fā)病率均呈持續(xù)上升趨勢，尤以女性發(fā)病率上升更快。臨床研究表明，原位癌治愈率接近100%，I期肺癌患者的5年生存率達60%?90%，而IIIb和IV期患者的5年生存率僅5%?20%，因此，早期診斷早期發(fā)現(xiàn)，早期治療是降低肺癌死亡率，延長生存期的關(guān)鍵。然而，由于缺乏理想的早期診斷方法，肺癌的早期診斷率僅14%左右。因此，如何提高肺癌早期診斷水平已成為肺癌防治工作者面臨的嚴肅而緊迫的任務(wù)。
[0004]至今，對肺癌的檢測仍依賴于CT、MR、PET等影像檢測儀器，但實際上這些影像手段一般只能發(fā)現(xiàn)l_2cm以上的腫瘤，而腫瘤從病變到生長至l-2cm，一般要經(jīng)過2_5年甚至更長的時間，因此，癌癥早期漏診率高達80-90%。
[0005]目前，早期診斷癌癥的最新、最有效的方法是通過驗血尋找腫瘤標志物，特別是其中的蛋白標志。所謂腫瘤標志物，指在腫瘤發(fā)生和增殖過程中，由腫瘤細胞生物合成、釋放或者是宿主對癌類反應(yīng)性的一類物質(zhì)，這類物質(zhì)可能是循環(huán)物質(zhì)，可在細胞、組織或體液中出現(xiàn)，人們能利用化學、免疫、分子生物學等技術(shù)對病人血液或分泌物定性或定量地檢測。通過對這類物質(zhì)的分析，為腫瘤的預(yù)測、診斷、治療和轉(zhuǎn)移等提供信息和決策依據(jù)。
[0006]血清腫瘤標志物的測定方法主要有放射免疫分析、酶免疫分析、化學發(fā)光免疫分析、電化學發(fā)光免疫分析等。然而，這些方法都是單指標的檢測方法，而對腫瘤進行單一標志物的檢測始終存在著特異性不強、靈敏度低等不足，導致對早期腫瘤的檢出率不高，因此可能會造成部分患者漏診。若想避免這種情況，則需要對每份標本進行多指標分析，不僅費用昂貴，而且需要的血清量較大。
[0007]肺癌中常用的腫瘤標志物有神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、癌胚抗原(CEA)、細胞角蛋白19片段(Cyfra21-1)以及前胃泌素釋放肽(ProGRP)等。
[0008](I)神經(jīng)特異性烯醇化酶(NSE):烯醇化酶是一種糖酵解酶，普遍存在于哺乳動物的組織中，以系列同工酶二聚體的形式存在(α α、α β、β β、和Y Y )。NSE為含Y亞基的同工酶，存在于神經(jīng)內(nèi)分泌細胞和神經(jīng)源性腫瘤中(如小細胞肺癌、神經(jīng)母細胞瘤、腸癌等)。小細胞肺癌(SCLC)是一種起源于神經(jīng)內(nèi)分泌細胞的腫瘤，因此NSE與SCLC關(guān)系密切，是小細胞肺癌的標記物。SCLC患者NSE陽性率約為60%?80%，非小細胞肺癌患者陽性率〈20%。因此，NSE有助于SCLC的診斷及其與NSCLC的鑒別診斷。NSE還是肺癌化療效果觀察和隨訪的有效指標，對化療產(chǎn)生反應(yīng)后此酶水平會下降，病情完全緩解后其可達正常水平。
[0009](2)細胞角蛋白19片段(CK19，Cyfra21_l):Cyfra21_l是分子量約30kDa的上皮細胞角蛋白的可溶性成分之一，是一種非常好的鑒別肺良惡性疾病的標志物，尤其對肺鱗癌的檢測效果更好。Cyfra21-1是相對較新的腫瘤標志物，臨床上采用夾心酶聯(lián)免疫吸附法，聯(lián)合應(yīng)用兩種特異性單克隆抗體(ksl9.1和bml9.21)檢測血清中的細胞角蛋白19片段。Cyfra21-1存在于上皮起源的腫瘤細胞的胞漿中，當腫瘤細胞壞死后，可釋放到血清中。免疫組織化學研究表明，肺癌中富含細胞角蛋白19片段，Cyfra21-1是NSCLC最靈敏的腫瘤標志物。因為Cyfra21-1只代表細胞角蛋白19 一個片段，因此Cyfra21_l比組織多肽抗原(TPA)具有更高的特異性。研究表明，Cyfra21-1在肺鱗癌中的陽性率可高達80%，而且對肺癌的診斷有較高的特異性，它在肺良性疾病和健康人群血中的濃度很低，與性別、年齡以及吸煙習慣無關(guān)。Cyfra21-1的敏感性與腫瘤的組織學類型存在著一定的相關(guān)性，如肺鱗癌的敏感性為最高達76.5%、腺癌為47.8%、小細胞肺癌僅為42.1%。血清中Cyfra21_l的含量與肺鱗癌患者的病程呈正相關(guān)，根據(jù)肺癌的?m分期，I?IV期患者的敏感性分別為 60.0%,88.8%、80%和 100%。
[0010](3)前胃泌素釋放肽(ProGRP) =ProGRP是一個相對穩(wěn)定的激素胃泌素釋放肽(GRP)的前體。人類的GRP主要存在于胃腸道、呼吸道以中樞神經(jīng)系統(tǒng)中。一些研究認為，小細胞肺癌的腫瘤細胞釋放GRP，并且GRP可能會刺激SCLC細胞生長。ProGRP作為SCLC的標志物，具有敏感性高(75.5%)、特異性強(97%)的特點。ProGRP水平和治療反應(yīng)也有較好的相關(guān)性，治療后腫瘤完全消失的病人，ProGRP降至正常值范圍，甚至測不出來長達一個月以上。國內(nèi)外的研究表明，ProGRP對小細胞肺癌檢測的敏感性、特異性和可靠性方面均優(yōu)于NSE，敏感性和特異性高，陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值在90%以上，對局限期病變的陽性率也比NSE高，一定程度上提高了早期診斷可能性，而且對化療后反應(yīng)、療效的評價、病程中病情監(jiān)測和預(yù)后判定都提供了有價值的信息。
[0011](4)癌胚抗原(CEA):CEA是一種存在于多種腫瘤細胞中的腫瘤抗原，肺癌細胞能直接產(chǎn)生CEA。CEA是最早發(fā)現(xiàn)的肺癌腫瘤標志物，也是目前肺癌診斷中最具代表性的腫瘤標志物，在腺癌與鱗癌中升高較明顯。原發(fā)性肺癌患者血清CEA水平明顯升高，對肺癌的診斷陽性率為40%?60%，特別在肺腺癌中，陽性率及特異性較高。另外，CEA在肺癌早期的病人中陽性率較低，在腫瘤中晚期才有較顯著的升高，因此CEA水平的動態(tài)變化能較好的反映患者對治療的反應(yīng)和預(yù)后。
[0012](5)CRP(C反應(yīng)蛋白):CRP作為一種急性時相蛋白，受年齡、免疫狀況、藥物等因素影響較小，其對臨床各種急、慢性感染，組織損傷等疾病的診斷、療效觀察及預(yù)后判斷的意義已被人們所認識。目前，其在腫瘤方面的運用亦越來越受到重視。研究表明，在腫瘤組織存在時CRP明顯升高，可達正常時的10?100倍。癌癥患者血清CRP水平增高可能是由于癌癥患者血清腫瘤壞死因子和IL-6水平增高直接刺激肝臟合成CRP所致。國內(nèi)外報道肺癌患者血清CRP水平較健康對照者明顯升高。
[0013](6) Dkk-1 =Dkk-1是一種分泌型糖蛋白，通過結(jié)合細胞表面受體LRP5/6、KremenI/2在Wnt通路中起負調(diào)控作用。Dkk-1的表達受p53、MYCN> b-catenin等基因調(diào)控。Dkk-1在細胞內(nèi)的異位表達能抑制多種腫瘤細胞的增殖，但有時能在促凋亡因子存在時誘發(fā)凋亡。Dkk-1在一些腫瘤中低表達，而在另一些腫瘤中高表達。Dkk-1的高表達被證明可以成為多種腫瘤預(yù)后差的標志，如肝細胞癌、食道癌、骨肉瘤、肺癌、卵巢上皮癌和多發(fā)性骨髓瘤。
[0014](7)Axl:又被稱為UFO，ARK，and Tyro7，最早是在白血病中作為一個轉(zhuǎn)化基因被發(fā)現(xiàn)的。該蛋白由894個氨基酸組成，分子量為140KD，大致均勻分布在細胞膜的兩側(cè)。Axl的配體是Gas6蛋白，這個蛋白在生長受阻的細胞中表達量很高。Axl和Gas6蛋白的細胞學功能還不完全清楚，比較復雜。例如，在非腫瘤細胞中Axl可以阻止血清缺乏的作用，即可以誘導細胞增殖。在乳腺癌、結(jié)腸癌和甲狀腺癌細胞系中Axl高表達，并且研究顯示Axl在腫瘤中的功能與細胞進入細胞周期、細胞存活和細胞轉(zhuǎn)化(腫瘤生成)有關(guān)。
[0015](8) ADAM8:解整合素-金屬蛋白酶(a disintegrin and metalloproteases,ADAMs)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類與細胞膜結(jié)合糖蛋白家族，參與細胞-細胞的黏連、細胞-基質(zhì)的黏連、細胞融合、細胞外基質(zhì)的降解及信號傳導等過程，科學家推測其參與了人類腫瘤形成和轉(zhuǎn)移的病理過程。ADAM8是新近發(fā)現(xiàn)的腫瘤標志物，文獻報道其在腦部腫瘤、胰腺癌、腎癌等腫瘤存在表達。
[0016](9) Prolactin:泌乳素，為垂體前葉分泌的一種多肽蛋白激素，也叫催乳素(PRL)，在正常男性和女性非妊娠期血清中的含量極低，接近零。但是惡性腫瘤普遍產(chǎn)生異位激素的現(xiàn)象，比如部分肺癌患者內(nèi)分泌異常，引起泌乳素分泌增多，促使乳頭、乳房脹大，分泌乳汁。研究發(fā)現(xiàn)肺癌患者血清濃度為21.4±11.48μ g/L，遠高于對照組13.75±6.44 μ g/L ο
[0017]液相芯片技術(shù)是20世紀90年代中期發(fā)展起來的被譽為后期基因組時代的芯片技術(shù)，也稱為flexible mult1-analyte profiling(XMAP) ? XMAP技術(shù)是集流式技術(shù)、突光微球、激光、數(shù)字信號處理和傳統(tǒng)化學技術(shù)為一體的新型生物分子高通量檢測技術(shù)。它有機地整和了編碼微球、激光技術(shù)、應(yīng).用流體學、最新的高速數(shù)字信號處理器和計算機運算法則，造就了其無與倫比的檢測特異性和靈敏度，可廣泛應(yīng)用于免疫分析、核酸研究、酶學分析、受體和配體識別分析等研究，也是目前唯一得到權(quán)威機構(gòu)和醫(yī)學界共同認可用于臨床診斷的生物芯片平臺。這種技術(shù)將流式檢測與芯片技術(shù)有機地結(jié)合在一起，使生物芯片反應(yīng)體系由固相反應(yīng)改變?yōu)榻咏锵到y(tǒng)內(nèi)部環(huán)境的完全液相反應(yīng)體系，檢測速度極快，其設(shè)計理念亦體現(xiàn)了計算機芯片的并行處理和高密度集成、高通量的精髓，因此也被稱為液相芯片技術(shù)，又稱多功能懸浮點陣。
[0018]與其它傳統(tǒng)的臨床分析方法相比，液相芯片的獨特設(shè)計使得它擁有常規(guī)的蛋白質(zhì)檢測方法所不具備的特點。①通量大:可對同一微量樣本中的100種不同目的分子同時進行快速的定性、定量分析，在35-60分鐘內(nèi)可對96個不同樣本進行檢測；②靈活性好:適用于各種蛋白質(zhì)以及核酸分析，可以接受實驗室已有的實驗方案，使用者可以自行設(shè)計分析方案，也可使用成套試劑盒；③液相環(huán)境更有利于保持蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象，也更有利于探針和被檢測物的反應(yīng)；④靈敏度高，信噪比好，只需要微量的樣品即可進行檢測(最低檢測濃度可達到2pg/mL)，線性范圍寬(可達4個數(shù)量級)；⑤操作簡便，不需洗滌，耗時短。
[0019]因此，如何能夠合理的應(yīng)用液相芯片的技術(shù)平臺，選擇有效的血清標志物，克服交叉反應(yīng)，提高檢測的準確性對肺癌的早期診斷具有重要的意義。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0020]本發(fā)明提供了一種檢測肺癌的液相芯片試劑盒，可以聯(lián)合檢測多個肺癌血清標志物，敏感度高，重復性好且診斷準確率高，能夠高通量的實現(xiàn)肺癌的早期診斷。
[0021]一種用于檢測肺癌的液相芯片試劑盒，包括包被微球，生物素標記的檢測抗體，鏈霉親和素-藻紅蛋白，反應(yīng)緩沖液和稀釋緩沖液，
[0022]所述包被微球包括包被CRP捕獲抗體的微球、包被Prolactin捕獲抗體的微球、包被CEA捕獲抗體的微球、包被NSE捕獲抗體的微球、包被CK19捕獲抗體的微球、包被Axl捕獲抗體的微球和包被ADAM8捕獲抗體的微球中的至少兩種，其中包被不同捕獲抗體的微球具有不同的顏色編碼；
[0023]所述檢測抗體包括CRP檢測抗體、Prolactin檢測抗體、CEA檢測抗體、NSE檢測抗體、CK19檢測抗體、Axl檢測抗體和ADAM8檢測抗體中的至少兩種，且與捕獲抗體相對應(yīng)。
[0024]其中，捕獲抗體和檢測抗體均能特異的與相應(yīng)的肺癌血清標志物(即CRP、Prolactin、CEA、NSE、CK19、Axl或ADAM8)結(jié)合，而鏈霉親和素-藻紅蛋白能夠與生物素高度特異性的結(jié)合，因此，最終可以形成針對肺癌血清標志物的“微球-捕獲抗體+血清標志物+檢測抗體+鏈霉親和素-藻紅蛋白”復合物，通過儀器檢測，根據(jù)微球色彩不同確定反應(yīng)類型，以綠色激光激發(fā)藻紅蛋白，測定微球上結(jié)合的報告熒光分子的數(shù)量，用于間接確定微球上結(jié)合的肺癌血清標志物的含量。
[0025]所述的反應(yīng)緩沖液為1%PBSB，所述稀釋緩沖液為1%PBSB。
[0026]優(yōu)選的,所述包被微球包括包被CRP捕獲抗體的微球和包被Prolactin捕獲抗體的微球。通過對CRP和Prolactin兩種標志物進行聯(lián)合檢測，肺癌早期的診斷的準確率可達 86%。
[0027]所述微球可采用常規(guī)制備液相芯片的微球即可。
[0028]為提高檢測的靈敏度和特異性，檢測抗體和捕獲抗體均為單克隆抗體。
[0029]制備包被微球時，捕獲抗體的加入量為20?30 μ g/6.25X IO6個微球，優(yōu)選為25 μ g/6.25 X IO6 個微球。
[0030]每種包被微球的濃度為(1.2?1.8) X IO4個/μ 1，優(yōu)選為1.2Χ IO4個/μ I。
[0031]每種生物素標記的檢測抗體的濃度為0.08?0.12 μ g/ml，優(yōu)選為0.1 μ g/ml。
[0032]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為:
[0033](I)本發(fā)明的液相芯片試劑盒的敏感度高，通過多個標志物聯(lián)合檢測，大大提高了肺癌早期診斷的準確率，且檢測快速，穩(wěn)定性好，能夠?qū)崿F(xiàn)高通量檢測，且成本低廉。
[0034](2)本發(fā)明采用CRP和Prolactin這兩個肺癌檢測的血清標志物，對CRP和Prolactin兩個標志物的聯(lián)合檢測，肺癌早期的診斷的準確率可達86%。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0035]圖1為CRP的標準曲線；
[0036]圖2為Prolactin的標準曲線；
[0037]圖3為肺癌患者和健康血清中的Prolactin檢測含量圖；
[0038]圖4為肺癌患者和健康血清中的CRP檢測含量圖；[0039]圖5為CRP以及Prolactin兩分子檢測的ROC曲線。
【具體實施方式】
[0040]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步闡釋。
[0041]實施例1液相芯片的制備
[0042]1、試劑和溶液
[0043](I) ρΗ6.2,0.1M NaH2PO4:稱量 3.5814g NaH2PO4 于 90mL ddH20 中，NaOH 調(diào)節(jié) pH 至
6.2后,定容至IOOmL, 0.22um濾膜過濾；
[0044](2)pH5.0,0.05M MES:稱量 0.976g MES 于 90mL ddH20 中，NaOH 調(diào)節(jié) pH 至 5.0 后，定容至IOOmL, 0.22um濾膜過濾；
[0045](3)pH6.0,0.1M MES:稱量 1.952g MES 于 90mL ddH20 中，NaOH 調(diào)節(jié) pH 至 6.0 后，定容至IOOmL, 0.22um濾膜過濾；
[0046](4)pH4.5,0.1M MES:稱量 1.952g MES 于 90mL ddH20 中，NaOH 調(diào)節(jié) pH 至 4.5 后，定容至IOOmL, 0.22um濾膜過濾；
[0047](5) PBS:NaCl, 137mM ；KC1,2.7mM ；Na2HP04,8.1mM ；KH2PO4, 1.5mM ；pH7.2-7.4 ；
0.22um濾膜過濾；
[0048](6) 1%PBSB:0.1%PBS 中含 0.02%Proclin300,0.22um 濾膜過濾；
[0049](7) 0.1%PBST:即 0.1%PBS 中含 0.l%tween_20,0.22um 濾膜過濾；
[0050](8) EDC (1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽):ddH20溶解至50mg/mL ；
[0051 ] (9) S-NHS (N-羥基硫代琥珀酰亞胺):ddH20溶解至50mg/mL。
[0052]2、液相芯片試劑盒，包括有:
[0053]I) 7-plex包被微球:含有分別包被了 CRP捕獲抗體、Prolactin捕獲抗體、CEA捕獲抗體、NSE捕獲抗體、CK19捕獲抗體、Axl捕獲抗體、ADAM8捕獲抗體的34#、45#、26#、37#、36#、67#、54#微球，不同種包被微球的濃度相同，均為1.2X IO4個/μ I ；
[0054]2) 7-plex生物素標記檢測抗體:分別用生物素標記的CRP檢測抗體、Prolactin檢測抗體、CEA檢測抗體、NSE檢測抗體、CK19檢測抗體、Axl檢測抗體、ADAM8檢測抗體的混合液，每種生物素標記的檢測抗體的濃度為0.1 μ g/ml ；
[0055]3)鏈霉親和素-藻紅蛋白；
[0056]4)反應(yīng)緩沖液:1%PBSB ；
[0057]5)稀釋緩沖液:1%PBSB ；
[0058]6)封口膜；
[0059]7)96 孔板。
[0060]3、按上述液相芯片試劑盒的組成，每種捕獲抗體包被相應(yīng)的微球，制備方法相同:
[0061](I)取微球懸液(磁性微球，bio-rad)，分別渦旋和超聲約20s后，取200ul (約2.5父106個微球)于干凈離心管(美國，Axygen)中，標記上微球型號和蛋白名稱；
[0062](2) 14000g，室溫(約 25°C )，4min ；
[0063](3)小心吸去上清，為減少損失可殘留少量上清；[0064](4)加入IOOul ddH20，分別渦旋和超聲約20s ；
[0065](5) 14000g，室溫，4min ；
[0066](6)小心吸去上清，為減少損失可殘留少量上清，加入160ul ρΗ6.2，0.1Μ的NaH2PO4，分別渦旋和超聲約20s ；
[0067](7)迅速加入20ul S-NHS，渦旋混勻；
[0068](8)迅速加入20ul EDC，分別渦旋和超聲約20s ；
[0069](9)室溫，避光旋轉(zhuǎn)孵育20min (若發(fā)現(xiàn)微球不呈懸浮狀態(tài)，可每隔IOmin渦旋一次)；
[0070](10) 14000g,室溫，4min ；
[0071](11)小心吸去上清，加入250 μ L0.05Μ MES, ρΗ5.0，分別渦旋和超聲約20s ；
[0072](12) 14000g，室溫，4min ；
[0073](13)小心吸去上清，重復上述洗滌步驟一次；
[0074](14)小心吸去上清，用50ul pH5.0,0.05M的MES重懸微球，分別渦旋和超聲約20s ；
[0075](15)加25ug捕獲抗體于上述微球中，加入pH5.0，0.05M的MES至終體積為500ul，分別渦旋和超聲約20s ；
[0076](16)室溫,避光旋轉(zhuǎn)孵育2h ；
[0077](17) 14000g，室溫，4min ；
[0078](18)小心吸去上清，加入ImL0.01%PBST,分別渦旋和超聲約20s ；
[0079](19) 14000g，室溫，4min ；
[0080](20)小心吸去上清，重復上述洗滌步驟一次；
[0081](21)加入lmLl%PBSB，分別渦旋和超聲約20s ；
[0082](22)室溫避光旋轉(zhuǎn)孵育30min，封閉微球表面殘余的活化羧基位點；
[0083](23) 14000g，室溫，4min ；
[0084](24)小心吸去上清，加入lmLl%PBSB,分別渦旋和超聲約20s ；
[0085](25)小心吸去上清，加入1%PBSB至終體積為200ul，分別渦旋和超聲約20s ；
[0086](26)取2ul于38ull%PBSB中，渦旋20s，超聲20s后，血球計數(shù)板計數(shù)，最終濃度(個/mL) = (4大格總數(shù)/4) X (I X IO4) X稀釋倍數(shù)；
[0087](27)在離心管上標記微球濃度、偶連時間，然后放置4度避光保存。按照上述方法，制備7種捕獲抗體包被微球，分別為包被了 CRP捕獲抗體的34#微球、Prolactin捕獲抗體的45#微球、CEA捕獲抗體的26#微球、NSE捕獲抗體的37#微球、CK19捕獲抗體的36#微球、Axl捕獲抗體的67#微球、ADAM8捕獲抗體的57#微球。
[0088]七種捕獲抗體的購買廠家和產(chǎn)品編號分別為:CRP，R&D systems，貨號，MAB17071 ;Prolactin, R&D systems,貨號，MAB842242 ;CEA, Fitzgerald Industries International,貨號，10-C10D ;NSE，Meridian Life Science,貨號，M86520M ;CK19，Meridian LifeScience，貨號，MAM39-221 ；Axl, R&D systems，貨號，MAB154 ；ADAM8, R&D systems，貨號，DY1031。
[0089]實施例2本發(fā)明液相芯片試劑盒用于檢測肺癌試驗
[0090]1、檢測方法[0091](I)使用前先取出所有試劑，放置平衡至室溫；
[0092](2)_80°C取出患者(早期肺癌患者)和健康人的血清，分別放置在冰上融化后，渦旋混勻，取V型96孔血凝板(96孔板)將血清稀釋20倍，槍頭上下混勻，盡量不產(chǎn)生氣泡；
[0093](3)準備 CRP、Prolactin、CEA、NSE、CK19、Axl 和 ADAM8 標準蛋白(CRP，產(chǎn)品編號為DY2648，R&D system ;Prolactin，產(chǎn)品編號為 DY682，R&D system ;CEA，產(chǎn)品編號為 73/601，NIBSC ；NSE,產(chǎn)品編號為 DENL20, R&D system ；CK19,產(chǎn)品編號為 30R-AC04, FitzgeraldIndustries International ；Axl,產(chǎn)品編號為 DY154, R&D system ；Adam8,產(chǎn)品編號為DY1031, R&D system)各取 8 個 EP 管分別標記上 S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8，進行 2 倍系列稀釋，每一個標準蛋白稀釋后都要渦旋混勻并更換槍頭，具體如下表1:
[0094]表I
[0095]
【權(quán)利要求】
1.一種檢測肺癌的液相芯片試劑盒，包括包被微球，生物素標記的檢測抗體，鏈霉親和素-藻紅蛋白，反應(yīng)緩沖液和稀釋緩沖液，其特征在于， 所述包被微球包括包被CRP捕獲抗體的微球、包被Prolactin捕獲抗體的微球、包被CEA捕獲抗體的微球、包被NSE捕獲抗體的微球、包被CK19捕獲抗體的微球、包被Axl捕獲抗體的微球和包被ADAM8捕獲抗體的微球中的至少兩種，其中包被不同捕獲抗體的微球具有不同的顏色編碼； 所述檢測抗體包括CRP檢測抗體、Prolactin檢測抗體、CEA檢測抗體、NSE檢測抗體、CK19檢測抗體、Axl檢測抗體和ADAM8檢測抗體中的至少兩種，且與捕獲抗體相對應(yīng)。
2.如權(quán)利要求1所述的液相芯片試劑盒，其特征在于，所述的反應(yīng)緩沖液為1%PBSB。
3.如權(quán)利要求1所述的液相芯片試劑盒，其特征在于，所述稀釋緩沖液為1%PBSB。
4.如權(quán)利要求1所述的液相芯片試劑盒，其特征在于，所述包被微球包括包被CRP捕獲抗體的微球和包被Prolactin捕獲抗體的微球。
5.如權(quán)利要求1所述的液相芯片試劑盒，制備包被微球時，捕獲抗體的加入量為20-30 μ g/6.25 X IO6 個微球。
6.如權(quán)利要求1所述的液相芯片試劑盒，每種包被微球的濃度為(1.2?1.8) X IO4個/μ I。
7.如權(quán)利要求1所述的液相芯片試劑盒，每種生物素標記的檢測抗體的濃度為0.08-0.12 μ g/ml。
【文檔編號】G01N33/574GK103439511SQ201310289504
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年7月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月10日
【發(fā)明者】王孝舉, 馬勝林, 吳國君, 王聞?wù)? 夏冰, 陳雪琴 申請人:浙江省醫(yī)學科學院, 杭州市第一人民醫(yī)院, 橫店集團家園化工有限公司