高靈敏度的三磷酸腺苷檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高靈敏度的三磷酸腺苷檢測方法，其包括以下步驟：步驟一，制備氨基化磁性納米粒子；步驟二，制備固定化三磷酸腺苷檢測酶系統(tǒng)；步驟三，對配置好的三磷酸腺苷檢測酶系統(tǒng)進(jìn)行預(yù)處理，清除酶系統(tǒng)中殘留的三磷酸腺苷；步驟四，使用MPI-B化學(xué)發(fā)光檢測儀進(jìn)行三磷酸腺苷測定。本發(fā)明利用納米技術(shù)去除試劑本底殘存的三磷酸腺苷，降低試劑本身的發(fā)光值，從而提高試劑的檢測靈敏度。
【專利說明】高靈敏度的三磷酸腺苷檢測方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種檢測方法，特別是涉及一種高靈敏度的三磷酸腺苷檢測方法。

【背景技術(shù)】
[0002]ATP (三磷酸腺苷)生物發(fā)光法是基于螢火蟲發(fā)光原理，利用熒光素酶-熒光素體系，檢測三磷酸腺苷(ATP)數(shù)量的一種快速有效的方法。ATP生物發(fā)光法的原理是蟲熒光素酶(Iuciferase)在鎂離子存在下,催化蟲突光素(Iuciferin)和ATP形成中間物后氧化成氧化型的熒光素，產(chǎn)生AMP (腺苷一磷酸)，并將化學(xué)能轉(zhuǎn)化成光能，釋放出光子。
[0003]在一定的ATP濃度范圍內(nèi)，此反應(yīng)所釋放出的光強(qiáng)度與體系中存在的ATP數(shù)量成良好的線性關(guān)系。因為三磷酸腺苷(ATP)存在于所有的活體細(xì)胞中，并且各生長期的細(xì)菌都還含有較恒定的ATP量，因此這可以作為一種活體細(xì)胞的指示劑，通過ATP生物發(fā)光法檢測出ATP數(shù)量，并由此推算出體系中細(xì)菌的數(shù)量。與傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)法相比，這種方法能快速得到結(jié)果，并且操作者無需技術(shù)，方法簡便易懂，更容易被普通人群接受，而平板培養(yǎng)法所需時間較長，通常需要培養(yǎng)24-48小時，才能得到最終結(jié)果，并且對操作者的技術(shù)要求較高，操作復(fù)雜。
[0004]隨著研究深入，已有結(jié)果表明ATP生物發(fā)光法有著極高的靈敏度，可檢測到10^17molATP甚至更低，約相當(dāng)于五個細(xì)菌的ATP量，大大滿足了 HACCP快速檢測微生物的要求。近年來，此方法已被食品工業(yè)、醫(yī)藥行業(yè)以及衛(wèi)生監(jiān)督系統(tǒng)等領(lǐng)域采用，如通過ATP生物發(fā)光法對原料奶微生物與體細(xì)胞濃度進(jìn)行檢測，由此監(jiān)測原料奶中微生物數(shù)量以及研究奶牛的健康狀況對牛奶的影響。此外在食品的生產(chǎn)過程中，對設(shè)備衛(wèi)生，環(huán)境衛(wèi)生，個人衛(wèi)生的管理，防止產(chǎn)品的二次污染。此外，這種方法還可用于肉及肉制品雜菌污染的測定、啤酒酵母的活性測定等。
[0005]ATP生物發(fā)光技術(shù)基于其快速，靈敏，簡便的優(yōu)點，將會成為一種快速簡便檢測微生物數(shù)量和檢測食品生產(chǎn)環(huán)境潔凈度的有效方法。
[0006]由于市場上常見的熒光素酶和熒光素都是通過基因工程技術(shù)發(fā)酵生產(chǎn)所得，所以即使經(jīng)過嚴(yán)格的操作，標(biāo)準(zhǔn)的酶液中可能還會含有微量的ATP殘留，因此造成檢測酶液本身的發(fā)光強(qiáng)度較高，試劑本身背景值較高，不利于提高發(fā)光檢測靈敏度。在這種情況下，多數(shù)試劑盒說明書要求在配置好檢測酶液后，在室溫下靜置一段時間以消耗其中的ATP殘留，但長時間在常溫下放置，這勢必會降低檢測酶的活性，最終導(dǎo)致檢測靈敏度降低。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種高靈敏度的三磷酸腺苷檢測方法，其利用納米技術(shù)去除試劑本底殘存的ATP (三磷酸腺苷)，降低試劑本身的發(fā)光值，從而提高試劑的檢測靈敏度。
[0008]本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案來解決上述技術(shù)問題的:一種高靈敏度的三磷酸腺苷檢測方法，其特征在于，其包括以下步驟: 步驟一，制備氨基化磁性納米粒子；
步驟二，制備固定化三磷酸腺苷檢測酶系統(tǒng)；
步驟三，對配置好的三磷酸腺苷檢測酶系統(tǒng)進(jìn)行預(yù)處理，清除酶系統(tǒng)中殘留的三磷酸腺苷；
步驟四，使用MP1-B化學(xué)發(fā)光檢測儀進(jìn)行三磷酸腺苷測定。
[0009]優(yōu)選地，所述步驟一具體包括以下步驟:將1g 1，6_己烷二胺、5g無水醋酸鈉、4g FeCl3WH2O作為鐵源在15ml乙二醇中恒溫50°C劇烈攪拌；反應(yīng)完畢后，將上述溶液轉(zhuǎn)移到特氟龍反應(yīng)釜中，在200°C下加熱1h ;待上述反應(yīng)結(jié)束，對反應(yīng)釜中的磁性納米粒子外加磁場，同時傾去未被磁力吸附的溶液，加入適量去離子水對磁性納米粒子清洗2?3次后，用無水乙醇清洗2?3次，最終可得25nmMNPs的磁性納米粒子。
[0010]優(yōu)選地，所述步驟二具體包括以下步驟:取25%戊二醛與氨基化磁性納米粒子以4:1的比例混合，在恒溫30°C下孵育2個小時，待戊二醛與氨基化磁性納米粒子結(jié)合完畢，用pH7.4的PBS緩沖液清洗2至3次，加入pH7.4的PBS緩沖液，在0°C冰浴下反應(yīng)6小時使三磷酸雙磷酸酶與已連接上羧基的磁性納米粒子結(jié)合，濃度為4U/mL，將三磷酸雙磷酸酶固定在磁性納米粒子上，用去離子水清洗固定化酶，洗去未被固定的三磷酸雙磷酸酶，得到固定化三磷酸雙磷酸酶。
[0011]優(yōu)選地，所述步驟三具體包括以下步驟:將固定化三磷酸酶加入已經(jīng)配置好的熒光素酶-熒光素系統(tǒng)，確保固定化三磷酸雙磷酸酶比例為6:7，在30°C下恒溫震蕩反應(yīng)20min，此時溶液中固定化三磷酸雙磷酸酶分解溶液中殘存的ATP生成AMP和Pi ;待反應(yīng)結(jié)束后，在恒溫4°C環(huán)境下，外加磁場，將溶液中固定化腺苷三磷酸雙磷酸酶分離，將預(yù)處理后的ATP檢測酶系統(tǒng)緩慢傾斜倒出，用于后續(xù)檢測。
[0012]本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于:本發(fā)明利用納米技術(shù)去除試劑本底殘存的ATP(三磷酸腺苷)，降低試劑本身的發(fā)光值，從而提高試劑的檢測靈敏度。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1為未使用固定化三磷酸雙磷酸酶預(yù)處理的ATP檢測試劑與使用固定化三磷酸雙磷酸酶預(yù)處理的ATP檢測試劑對同一組標(biāo)準(zhǔn)ATP梯度溶液檢測結(jié)果比較的示意圖。
[0014]圖2為未使用固定化三磷酸雙磷酸酶預(yù)處理的ATP檢測試劑與使用固定化三磷酸雙磷酸酶預(yù)處理的ATP檢測試劑對同一組大腸桿菌菌懸液檢測結(jié)果比較的示意圖。
[0015]圖3為未使用固定化三磷酸雙磷酸酶預(yù)處理的ATP檢測試劑與使用固定化三磷酸雙磷酸酶預(yù)處理的ATP檢測試劑對同一組雜菌菌懸液檢測結(jié)果比較的示意圖。

【具體實施方式】
[0016]下面結(jié)合附圖給出本發(fā)明較佳實施例，以詳細(xì)說明本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0017]如圖1所示，本發(fā)明高靈敏度的三磷酸腺苷檢測方法包括以下步驟:
步驟一，制備氨基化磁性納米粒子；
步驟二，制備固定化三磷酸腺苷檢測酶系統(tǒng)；
步驟三，對配置好的三磷酸腺苷檢測酶系統(tǒng)進(jìn)行預(yù)處理，清除酶系統(tǒng)中殘留的三磷酸腺苷； 步驟四，使用MP1-B化學(xué)發(fā)光檢測儀進(jìn)行三磷酸腺苷測定。
[0018]步驟一具體包括以下步驟:將1g I, 6-己烷二胺、5g無水醋酸鈉、4g FeCl3.6Η20作為鐵源在15ml乙二醇中恒溫50°C劇烈攪拌；反應(yīng)完畢后，將上述溶液轉(zhuǎn)移到特氟龍反應(yīng)釜中，在200°C下加熱1h ;待上述反應(yīng)結(jié)束，對反應(yīng)釜中的磁性納米粒子外加磁場，同時傾去未被磁力吸附的溶液，加入適量去離子水對磁性納米粒子清洗2?3次后，用無水乙醇清洗2?3次，最終可得25nmMNPs的磁性納米粒子。
[0019]步驟二具體包括以下步驟:取25%戊二醛與氨基化磁性納米粒子以4: l(v/m)的比例混合，在恒溫30°C下孵育2個小時，待戊二醛與氨基化磁性納米粒子結(jié)合完畢，用pH7.4的PBS緩沖液清洗2至3次，加入pH7.4的PBS緩沖液，在0°C冰浴下反應(yīng)6小時使三磷酸雙磷酸酶與已連接上羧基的磁性納米粒子結(jié)合，濃度為4U/mL，將三磷酸雙磷酸酶固定在磁性納米粒子上，用去離子水清洗固定化酶，洗去未被固定的三磷酸雙磷酸酶，得到固定化三磷酸雙磷酸酶。
[0020]步驟三具體包括以下步驟:將固定化三磷酸酶加入已經(jīng)配置好的熒光素酶-熒光素系統(tǒng)，確保固定化三磷酸雙磷酸酶比例為6:7(m/v)，在30°C下恒溫震蕩反應(yīng)20min，此時溶液中固定化三磷酸雙磷酸酶分解溶液中殘存的ATP生成AMP和Pi ;待反應(yīng)結(jié)束后，在恒溫4°C環(huán)境下，外加磁場，將溶液中固定化腺苷三磷酸雙磷酸酶分離，將預(yù)處理后的ATP檢測酶系統(tǒng)緩慢傾斜倒出，用于后續(xù)檢測。
[0021]實施例1
測定標(biāo)準(zhǔn)ATP梯度溶液
配制 I X Kr2 mol/L 的 ATP 溶液，作為 ATP 貯存液。用 25 mmol/L, ρΗ7.4 Tris-HCl 緩沖液(含I mmol/L MgC12)配制反應(yīng)液(含I X 10_6 mol/L蟲熒光素酶和3 X 10_4 mol/L蟲熒光素)，采用固定化三磷酸雙磷酸酶對反應(yīng)液進(jìn)行預(yù)處理，分別測定ATP濃度為I X 10_7、5X10_8、1X10_8、5X10_9、1X10_9、5X10_1Q、1X10_1Q mol/L。取 10 μ L 不同濃度的 ATP 溶液，加入500 μ L反應(yīng)液中，反應(yīng)15 s后測量60 s的發(fā)光值，每個濃度的ATP均重復(fù)3次。
[0022]根據(jù)圖1顯示，按照常規(guī)方法，使用ATP檢測試劑分析標(biāo)準(zhǔn)ATP梯度溶液，在分析檢測低含量的ATP時，其線性不明顯，該曲線的ATP動態(tài)范圍在1Fmol到lOOFmol，當(dāng)ATP量小于1Fmol時，發(fā)光強(qiáng)度與空白的強(qiáng)度相當(dāng)，不易區(qū)分，正是由于檢測限和靈敏度的限制，使得ATP生物發(fā)光法對于某些潔凈度要求較高的場合，如醫(yī)院手術(shù)室，潔凈室等無法使用。而采用固定化三磷酸雙磷酸酶預(yù)處理的ATP檢測試劑，在ATP含量為OFmol到10Fmol的范圍內(nèi)，有良好的線性關(guān)系，R2=0.9942。并且比未處理的對照組有著更高的斜率K=4.7364，哪怕是更低含量的ATP也可以準(zhǔn)確區(qū)分開來，有利于ATP生物發(fā)光法在潔凈度要求較高的場所應(yīng)用。
[0023]實施例2
測定大腸桿菌菌懸液中ATP的量
大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)液:挑單菌(E.Col1.)放入Iml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，取培養(yǎng)后的大腸桿菌培養(yǎng)液Iml轉(zhuǎn)接到40ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)速120r.min—1，培養(yǎng)2h。取0.5ml培養(yǎng)液放入已滅菌4.5ml生理鹽水中，配制成稀釋梯度為10倍的大腸桿菌培養(yǎng)液，并依此法配制稀釋度為12和13倍的大腸桿菌培養(yǎng)液。分別測定各個稀釋倍數(shù)的大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)液中的ATP。
[0024]大腸桿菌菌液的測定步驟為:取1ul大腸桿菌菌液，注射到浸泡過ATP提取劑的拭子頭上，將拭子放入已由固定化三磷酸雙磷酸酶預(yù)處理的熒光素酶-熒光素混合酶液中攪拌數(shù)次，使拭子頭上的ATP被完全洗脫下來，并與酶溶液反應(yīng)，然后將檢測瓶放入MP1-B檢測池內(nèi)檢測。
[0025]根據(jù)圖2顯示，按照常規(guī)方法，使用ATP檢測試劑分析大腸桿菌菌懸液，在分析檢測低細(xì)胞含量菌懸液時，其線性不明顯，當(dāng)細(xì)胞含量小于350個細(xì)胞/mL時，發(fā)光強(qiáng)度與空白的強(qiáng)度相當(dāng)，不易區(qū)分。而采用固定化三磷酸雙磷酸酶預(yù)處理的ATP檢測試劑，能有效降低試劑的背景值，在細(xì)胞含量為15個細(xì)胞/mL時，仍有良好的線性，R2=0.9989。
[0026]實施例3
測定混合菌懸液中ATP量
在本實驗中，選取日常生活中最常見的三種菌種，大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌，作為雜菌菌懸液的三大組成成分。
[0027]雜菌標(biāo)準(zhǔn)液:挑取一環(huán)大腸桿菌放入Iml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基過夜培養(yǎng),取培養(yǎng)后的大腸桿菌培養(yǎng)液Iml轉(zhuǎn)接到40ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)速120r.min—1，培養(yǎng)2h。待培養(yǎng)至0D_為0.3左右時取出備用。以同樣的方法培養(yǎng)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌菌液。從上述三種菌液中各取lml，置于已滅菌的空白試管內(nèi)，充分混勻，使雜菌菌液中三種菌細(xì)胞含量達(dá)到理想的1:1:1的比例。取0.5ml培養(yǎng)液放入已滅菌4.5ml生理鹽水中，配制成稀釋梯度為10倍的雜菌培養(yǎng)液，并依此法配制稀釋度為12和13倍的雜菌培養(yǎng)液。分別測定各個稀釋倍數(shù)的雜菌標(biāo)準(zhǔn)液中的ATP。
[0028]雜菌菌液的測定步驟為:取1ul雜菌菌液，注射到浸泡過ATP提取劑的拭子頭上，將拭子放入已由固定化三磷酸雙磷酸酶預(yù)處理的熒光素酶-熒光素混合酶液中攪拌數(shù)次，使拭子頭上的ATP被完全洗脫下來，并與酶溶液反應(yīng)，然后將檢測瓶放入MP1-B檢測池內(nèi)檢測。
[0029]根據(jù)圖3顯示，按照常規(guī)方法，使用ATP檢測試劑分析雜菌菌懸液，在分析檢測低細(xì)胞含量菌懸液時，其線性不明顯，當(dāng)細(xì)胞含量小于371個細(xì)胞/mL時，發(fā)光強(qiáng)度與空白的強(qiáng)度相當(dāng)，不易區(qū)分。而采用固定化三磷酸雙磷酸酶預(yù)處理的ATP檢測試劑，在降低檢測試劑背景值的同時，也有效得提高了其標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，有利于低細(xì)胞含量的檢出。
[0030]在應(yīng)用ATP生物發(fā)光法檢測物體表面潔凈度時，檢測的并不是單一菌種，而是由多種細(xì)菌組成的雜菌菌群，本實施例，旨在說明在使用ATP生物發(fā)光檢測技術(shù)評價物體表面衛(wèi)生狀況時，采用固定化三磷酸雙磷酸酶預(yù)處理檢測試劑，也同樣可以達(dá)到降低背景值，提高檢測靈敏度的效果，這對于此技術(shù)在實際應(yīng)用中也有重大意義。
[0031]本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對本發(fā)明進(jìn)行各種改型和改變。因此，本發(fā)明覆蓋了落入所附的權(quán)利要求書及其等同物的范圍內(nèi)的各種改型和改變。
【權(quán)利要求】
1.一種高靈敏度的三磷酸腺苷檢測方法，其特征在于，其包括以下步驟: 步驟一，制備氨基化磁性納米粒子； 步驟二，制備固定化三磷酸腺苷檢測酶系統(tǒng)； 步驟三，對配置好的三磷酸腺苷檢測酶系統(tǒng)進(jìn)行預(yù)處理，清除酶系統(tǒng)中殘留的三磷酸腺苷； 步驟四，使用MP1-B化學(xué)發(fā)光檢測儀進(jìn)行三磷酸腺苷測定。
2.如權(quán)利要求1所述的高靈敏度的三磷酸腺苷檢測方法，其特征在于，所述步驟一具體包括以下步驟:將1g 1,6-己烷二胺、5g無水醋酸鈉、4g FeCl3.6Η20作為鐵源在15ml乙二醇中恒溫50°C劇烈攪拌；反應(yīng)完畢后，將上述溶液轉(zhuǎn)移到特氟龍反應(yīng)釜中，在200°C下加熱1h ;待上述反應(yīng)結(jié)束，對反應(yīng)釜中的磁性納米粒子外加磁場，同時傾去未被磁力吸附的溶液，加入適量去離子水對磁性納米粒子清洗2?3次后，用無水乙醇清洗2?3次，最終可得25nmMNPs的磁性納米粒子。
3.如權(quán)利要求1所述的高靈敏度的三磷酸腺苷檢測方法，其特征在于，所述步驟二具體包括以下步驟:取25%戊二醛與氨基化磁性納米粒子以4:1的比例混合，在恒溫30°C下孵育2個小時，待戊二醛與氨基化磁性納米粒子結(jié)合完畢，用pH7.4的PBS緩沖液清洗2至3次，加入pH7.4的PBS緩沖液，在0°C冰浴下反應(yīng)6小時使三磷酸雙磷酸酶與已連接上羧基的磁性納米粒子結(jié)合，濃度為4U/mL，將三磷酸雙磷酸酶固定在磁性納米粒子上，用去離子水清洗固定化酶，洗去未被固定的三磷酸雙磷酸酶，得到固定化三磷酸雙磷酸酶。
4.如權(quán)利要求1所述的高靈敏度的三磷酸腺苷檢測方法，其特征在于，所述步驟三具體包括以下步驟:將固定化三磷酸酶加入已經(jīng)配置好的熒光素酶-熒光素系統(tǒng)，確保固定化三磷酸雙磷酸酶比例為6:7，在301:下恒溫震蕩反應(yīng)20min，此時溶液中固定化三磷酸雙磷酸酶分解溶液中殘存的ATP生成AMP和Pi ;待反應(yīng)結(jié)束后，在恒溫4°C環(huán)境下，外加磁場，將溶液中固定化腺苷三磷酸雙磷酸酶分離，將預(yù)處理后的ATP檢測酶系統(tǒng)緩慢傾斜倒出，用于后續(xù)檢測。
【文檔編號】G01N21/64GK104297219SQ201310297780
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2013年7月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月16日
【發(fā)明者】葉菁 申請人:上海樂宇生物科技有限公司