一種克氏原螯蝦酚氧化酶活性的準(zhǔn)確測(cè)定方法
【專利摘要】蝦蟹類酚氧化酶活性的準(zhǔn)確測(cè)定方法，臟抽取血淋巴液待測(cè)，鰓組織酚氧化酶制備，在冰袋上迅速采集鰓組織樣品，加無(wú)菌生理鹽水，冰浴勻漿，勻漿液經(jīng)離心，吸取上清液保存待測(cè)，加入磷酸鉀緩沖液，于水浴中預(yù)處理使緩沖液溫度達(dá)到預(yù)設(shè)溫度，加入L-DOPA和待測(cè)樣品，充分混勻，迅速測(cè)定波長(zhǎng)490nm時(shí)的初始吸光度值，同時(shí)開(kāi)始水浴計(jì)時(shí)，水浴，測(cè)定吸光度（OD）值，每組另取兩只試管分別測(cè)底物L(fēng)-DOPA和樣品在490nm的吸光度為ODL和OD0作為對(duì)照，每組平行3次，以平均每分鐘（t）OD490nm增加0.001作為一個(gè)酶活力單位(U)，計(jì)算公式:PO=(OD-ODL-OD0)/t。
【專利說(shuō)明】一種克氏原螯蝦酚氧化酶活性的準(zhǔn)確測(cè)定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及酚氧化酶活性的測(cè)定方法，尤其是克氏原螯蝦酚氧化酶活性的準(zhǔn)確測(cè)定方法。
【背景技術(shù)】
[0002]我國(guó)水產(chǎn)甲殼動(dòng)物資源十富，種類繁多。甲殼類的蝦、蟹以其味美及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高而深受人們喜愛(ài)。蝦、蟹既是我國(guó)漁業(yè)經(jīng)濟(jì)十的重要產(chǎn)業(yè)，又是出口創(chuàng)匯的主要產(chǎn)品之一?？耸显?Procambarus clarkii)俗稱小龍奸，原產(chǎn)于墨西哥北部和美國(guó)南部，20世紀(jì)初傳入我國(guó)?？耸显r是世界性的食用蝦，我國(guó)售價(jià)不斷攀升，是出口創(chuàng)匯是重要蝦品之一，是目前在國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)上極為熱銷的淡水大型奸類之一，養(yǎng)殖規(guī)模正逐年擴(kuò)大，養(yǎng)殖密度逐漸提聞。
[0003]甲殼類等節(jié)肢動(dòng)物不具有特異性免疫功能，免疫防御是通過(guò)非特異性免疫發(fā)揮作用。酹氧化酶原激活系統(tǒng)(prophenoloxidase activating system)是甲殼動(dòng)物重要的防御和識(shí)別系統(tǒng)，由絲氨酸蛋白酶和其他相關(guān)因子組成，類似于脊椎動(dòng)物補(bǔ)體系統(tǒng)，在識(shí)別異物、釋放調(diào)理素促進(jìn)血細(xì)胞的吞噬和包囊以及產(chǎn)生殺滅和排除異物的凝集素和溶菌酶等免疫功能方面發(fā)揮重要作用。酚氧化酶(phenoloxidase，PO)是酚氧化酶原激活系統(tǒng)的產(chǎn)物，是衡量機(jī)體免疫功能的重要指標(biāo)，也是一些疾病的診斷的判斷依據(jù)。
[0004]許多學(xué)者在測(cè)定酚氧化酶活力時(shí)采用冰浴終止反應(yīng)的方法來(lái)檢測(cè)，也有部分人采用測(cè)定一段時(shí)間內(nèi)酚氧化酶反應(yīng)底物生成物濃度來(lái)判斷其活性的，但許多在測(cè)定時(shí)間和測(cè)定溫度方面均不統(tǒng)一，因而在測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確性、效率性方面不盡如人意。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]發(fā)明目的:針對(duì)以上技術(shù)現(xiàn)狀，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種準(zhǔn)確、高效的測(cè)定克氏原螯蝦酚氧化酶活性性狀的方法。
[0006]本發(fā)明技術(shù)方案為:一種克氏原螯蝦酚氧化酶活性的準(zhǔn)確測(cè)定方法，其特征在于包括以下步驟:
[0007]I)血清酚氧化酶的制備:用5ml —次性注射器刺破頭胸甲從心臟抽取血淋巴液于2ml離心管中4°C放置過(guò)夜，待血清析出后10000r/min4°C離心lOmin，上清液于潔凈離心管中保存待測(cè)；
[0008]2)組織酚氧化酶的制備:在冰袋上迅速采集鰓組織樣品，加9倍質(zhì)量4°C無(wú)菌生理鹽水使其濃度達(dá)到0.lg/ml，冰浴勻漿，勻漿液經(jīng)3000r/min4°C離心lOmin，吸取上清液于潔凈的離心管中保存?zhèn)溆茫?br> [0009]3)取潔凈的IOml刻度試管，加入pH為5.5 (鰓)或6.5 (血清)的0.lmol/L磷酸鉀緩沖液3ml，于35°C水浴中預(yù)處理5min使緩沖液溫度達(dá)到預(yù)設(shè)溫度。水浴溫度為35°C。
[0010]4)加入0.1mL0.01mol/L的L-D0PA和0.1mL待測(cè)樣品，充分混勻，迅速測(cè)定波長(zhǎng)490nm時(shí)的初始吸光度值，同時(shí)開(kāi)始水浴計(jì)時(shí)，水浴6min，測(cè)定第6min時(shí)的吸光度(OD)值；[0011]5)每組另取兩只試管分別測(cè)底物L(fēng)-DOPA和樣品在490nm的吸光度為0?和ODtl作為對(duì)照。每組平行3次。以均等時(shí)間0D490nm增加相應(yīng)的數(shù)值作為一個(gè)酶活力單位(U)，計(jì)算公式=PO=(OD-ODfC)DciVttj均等時(shí)間可設(shè)為lmin，相應(yīng)的數(shù)值為0.001。
[0012]本發(fā)明的有益效果:
[0013]1、能準(zhǔn)確測(cè)定克氏原螯蝦酚氧化酶活性，可以預(yù)測(cè)克氏原螯蝦的健康狀況，同時(shí)可作為一些疑難疾病的診斷標(biāo)準(zhǔn)。
[0014]2、本檢測(cè)方法具有準(zhǔn)確、快鍵、經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)，適用于科研單位、技術(shù)推廣站及企業(yè)快速診斷蝦病。
【具體實(shí)施方式】
[0015]以下結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步作詳細(xì)描述。
[0016]實(shí)施例1
[0017]①稱取Ig的原料蝦鰓組織，加9ml生理鹽水，用組織勻漿器或勻漿儀冰浴勻漿。
[0018]②勻漿液經(jīng)3000r/min4°C離心lOmin，吸取上清液于潔凈的離心管中保存待測(cè)。
[0019]③酶活測(cè)定:取潔凈的IOml刻度試管，加入pH為5.5的0.lmol/L磷酸鉀緩沖液3ml，于35°C水浴中預(yù)處理5min使緩沖液溫度達(dá)到預(yù)設(shè)溫度。
[0020]④加入0.1mL0.01mol/L的L-D0PA和0.1mL待測(cè)樣品，充分混勻，迅速測(cè)定波長(zhǎng)490nm時(shí)的初始吸光度值，同時(shí)開(kāi)始水浴計(jì)時(shí)，水浴6min，測(cè)定第6min時(shí)的吸光度(OD)值；[0021 ] ⑤每組另取兩只試.管分別測(cè)底物L(fēng)-DOPA和樣品在490nm的吸光度為0?和ODtl作為對(duì)照。每組平行3次。以平均每分鐘(t)0D490nm增加0.001作為一個(gè)酶活力單位(U)，計(jì)算公式:PO= (OD-ODl-ODq)/t。
[0022]實(shí)施例2:
[0023]①血清酚氧化酶的制備:用5ml 一次性注射器刺破頭胸甲從心臟抽取血淋巴液于2ml離心管中4°C放置過(guò)夜。
[0024]②待血清析出后10000r/min4°C離心lOmin，上清液于潔凈離心管中保存待測(cè)；
[0025]③酶活測(cè)定:取潔凈的IOml刻度試管，加入pH為5.5的0.lmol/L磷酸鉀緩沖液3ml，于35°C水浴中預(yù)處理5min使緩沖液溫度達(dá)到預(yù)設(shè)溫度。
[0026]④加入0.1mL0.01mol/L的L-D0PA和0.1mL待測(cè)樣品，充分混勻，迅速測(cè)定波長(zhǎng)490nm時(shí)的初始吸光度值，同時(shí)開(kāi)始水浴計(jì)時(shí)，水浴6min，測(cè)定第6min時(shí)的吸光度(OD)值；
[0027]⑤每組另取兩只試管分別測(cè)底物L(fēng)-DOPA和樣品在490nm的吸光度為0?和ODtl作為對(duì)照。每組平行3次。以平均每分鐘(t)0D490nm增加0.001作為一個(gè)酶活力單位(U)，計(jì)算公式:PO= (OD-ODl-ODq)/t。
[0028]實(shí)施例3:
[0029]①血清酚氧化酶的制備:用5ml 一次性注射器刺破頭胸甲從心臟抽取血淋巴液于2ml離心管中4°C放置過(guò)夜。
[0030]②待血清析出后10000r/min4°C離心lOmin，上清液于潔凈離心管中_20°C保存待測(cè)；
[0031]③測(cè)定前將待測(cè)樣品從冰箱取出，放入35°C水浴鍋，待樣品融化即可測(cè)定。
[0032]④酶活測(cè)定:取潔凈的IOml刻度試管，加入pH為5.5的0.lmol/L磷酸鉀緩沖液3ml，于35°C水浴中預(yù)處理5min使緩沖液溫度達(dá)到預(yù)設(shè)溫度。
[0033]⑤加入0.1mL0.01mol/L的L-D0PA和0.1mL待測(cè)樣品，充分混勻，迅速測(cè)定波長(zhǎng)490nm時(shí)的初始吸光度值，同時(shí)開(kāi)始水浴計(jì)時(shí)，水浴6min，測(cè)定第6min時(shí)的吸光度(OD)值；
[0034]⑥每組另取兩只試管分別測(cè)底物L(fēng)-DOPA和樣品在490nm的吸光度為0?和ODtl作為對(duì)照。每組平行3次。以平均每分鐘(t)0D490nm增加0.001作為一個(gè)酶活力單位(U)，計(jì)算公式:PO= (OD-ODl-ODq)/t。
[0035]以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說(shuō)明書中描述的只是說(shuō)明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)，本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書其等效物界定。
【權(quán)利要求】
1.一種克氏原螯蝦酚氧化酶活性的檢測(cè)方法，其特征在于: A、血清酚氧化酶的制備:從蝦蟹類動(dòng)物心臟抽取血淋巴液于2ml離心管中4°C放置過(guò)夜，待血清析出后10，000r/min4°C離心lOmin，上清液于潔凈離心管中保存待測(cè)； B、組織酚氧化酶的制備:在冰袋上迅速采集鰓組織樣品，加9倍質(zhì)量4°C無(wú)菌生理鹽水使其濃度達(dá)到0.lg/ml，冰浴勻漿，勻漿液經(jīng)3，000r/min4°C離心lOmin，吸取上清液于潔凈的離心管中保存待測(cè)； C、取潔凈的IOml刻度試管，加入緩沖液3ml，水浴中預(yù)處理5min使緩沖液溫度達(dá)到預(yù)設(shè)溫度。 D、加入0.1ml0.01mol/l的L-DOPA和0.1ml待測(cè)樣品，充分混勻，迅速測(cè)定波長(zhǎng)490nm時(shí)的初始吸光度值，同時(shí)開(kāi)始水浴計(jì)時(shí)，水浴一段時(shí)間后，測(cè)定其的吸光度即OD值； E每組另取試管分別測(cè)底物L(fēng)-DOPA和樣品在490nm的吸光度為0?和ODtl作為對(duì)照。每組平行 3次；以均等時(shí)間0D490nm增加相應(yīng)的數(shù)值作為一個(gè)酶活力單位，計(jì)算公式:PO= (OD-ODl-OD0)/t。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的克氏原螯蝦酚氧化酶活性的檢測(cè)方法，其特征在于:步驟C緩沖液為=PH為5.5鰓或6.5血清的0.lmol/L磷酸緩沖液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的克氏原螯蝦酚氧化酶活性的檢測(cè)方法，其特征在于:步驟C、D水浴溫度為35°C，步驟D水浴的時(shí)間為6min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的克氏原螯蝦酚氧化酶活性的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟E另取試管數(shù)量為2支。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的克氏原螯蝦酚氧化酶活性的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟E均等的時(shí)間為lmin，相應(yīng)的數(shù)值為0.001。
【文檔編號(hào)】G01N21/31GK103439275SQ201310330795
【公開(kāi)日】2013年12月11日 申請(qǐng)日期:2013年7月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月31日
【發(fā)明者】王建國(guó), 吳娟, 朱光來(lái), 王權(quán) 申請(qǐng)人:江蘇畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術(shù)學(xué)院