孔雀石綠人工抗原和抗體及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明申請(qǐng)?zhí)峁┛兹甘G人工抗原和抗體的制備，涉及三苯甲烷類化學(xué)物質(zhì)孔雀石綠人工半抗原、人工抗原及抗體的制備。本發(fā)明克服了傳統(tǒng)的理化分析方法繁瑣復(fù)雜、成本較高、分析速度慢的問題，提供了簡便、快速、靈敏、準(zhǔn)確的免疫分析技術(shù)。以4-[雙(4-二甲胺基)苯基]甲基苯甲酸和5-{4-[雙(4-二甲胺基)苯基]甲基}苯基戊酸為半抗原，分別與血藍(lán)蛋白、卵清蛋白等載體蛋白連接合成人工抗原，再經(jīng)動(dòng)物免疫、取血、分出抗血清、純化制得抗體。該抗體穩(wěn)定、具有良好的特異性和靈敏度，可用于孔雀石綠的快速免疫檢測，具有良好的應(yīng)用前景。
【專利說明】孔雀石綠人工抗原和抗體及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明申請(qǐng)涉及具有三苯甲烷類結(jié)構(gòu)的孔雀石綠人工半抗原、特異性抗原的合成及特異性抗體的制備，屬于小分子化合物免疫化學(xué)和殘留分析【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著國民經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，城鄉(xiāng)居民生活水平不斷提高，人們的飲食結(jié)構(gòu)正發(fā)生深刻的變化。水產(chǎn)品以其低脂肪、低膽固醇、高蛋白、營養(yǎng)豐富、味道鮮美等優(yōu)點(diǎn)，正成為廣大消費(fèi)者所青睞的食品之一。
[0003]與其它肉類產(chǎn)品相比，微生物更易于在水產(chǎn)品體內(nèi)繁殖，在水產(chǎn)品的腸道、皮膚、肌肉中我們很容易發(fā)現(xiàn)各種致病菌、病毒和寄生蟲，養(yǎng)殖戶為了預(yù)防和防治水產(chǎn)動(dòng)物患病或受微生物污染，在養(yǎng)殖過程中會(huì)使用殺蟲劑、殺菌劑等，這些藥物的違規(guī)使用或不合理使用又會(huì)引發(fā)藥物殘留等質(zhì)量安全問題。因此，加快水產(chǎn)品安全快速檢測技術(shù)研究，提高水產(chǎn)品質(zhì)量，建立健全水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督體系，對(duì)提高我國水產(chǎn)品在全球市場的競爭力，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和深遠(yuǎn)的戰(zhàn)略意義。
[0004]孔雀石綠是人工合成的有機(jī)化合物,其是由I摩爾分子的苯甲醒(Benzaldehyde)和2摩爾分子的二甲苯胺在濃鹽酸混和下，加熱縮合成隱色素堿(Leuco base)，在酸性條件下加過氧化鉛使其氧化，并在堿性液中沉淀出色素堿，它屬于三苯甲烷型的綠色染料?？兹甘G以往僅在制陶業(yè)、紡織業(yè)、皮革業(yè)、食品著色劑等方面有所使用。自1933年起孔雀石綠開始作為驅(qū)蟲劑、殺菌劑、防腐劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中出現(xiàn)，而后因?yàn)槠渚哂袃r(jià)格低廉、效果顯著等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于預(yù)防與 治療各類水產(chǎn)動(dòng)物的水霉病和對(duì)原蟲的控制。但隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)孔雀石綠進(jìn)入生物機(jī)體后可影響其生長和繁殖能力，造成肝、脾、腎和心臟的病變，對(duì)皮膚、眼睛及肺部都有一定的損傷，還具有致癌、致畸和致突變等副作用。鑒于孔雀石綠的危害性，國內(nèi)外對(duì)其殘留量制定了嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)，包括美國、加拿大和歐盟在內(nèi)的許多國家都規(guī)定，不能在水產(chǎn)品中使用孔雀石綠。歐盟確定孔雀石綠和隱色孔雀石綠的最低執(zhí)法限量為2ug/kg;加拿大水產(chǎn)品養(yǎng)殖全程禁止使用孔雀石綠，并規(guī)定了魚產(chǎn)品中孔雀石綠和無色孔雀石綠含量須在Ippb以下，2002年12月農(nóng)業(yè)部對(duì)農(nóng)牧發(fā)[1999] 17號(hào)文《動(dòng)物性食品中獸藥殘留限量》進(jìn)行了重新修訂(235號(hào)公告)中規(guī)定孔雀石綠為不得檢出。日本于2006年實(shí)施的《肯定列表制度》，其中規(guī)定孔雀石綠不得檢出。但由于孔雀石綠的抗菌效果較好，價(jià)格便宜，不少水產(chǎn)養(yǎng)殖戶仍偷偷使用，因此對(duì)孔雀石綠的殘留監(jiān)控工作依然是一項(xiàng)艱巨而重大的任務(wù)。
[0005]目前孔雀石綠及隱孔雀石綠殘留檢測主要是氣相色譜法和高效液相色譜法，儀器檢測法雖然準(zhǔn)確率較高，但因其設(shè)備昂貴，操作繁瑣，不適用于現(xiàn)場快速檢測。因而迫切需要開發(fā)一種簡便、快速、靈敏的檢測孔雀石綠殘留的方法。
[0006]酶聯(lián)免疫吸附分析，即ELISA法，利用了抗原抗體復(fù)合物的免疫反應(yīng)與酶的催化放大作用，即保持了抗原抗體的特異性，又保持了酶催化反應(yīng)的敏感性，因而極大的提高了反應(yīng)靈敏度。同時(shí)它又屬于一種非均相免疫分析，即在反應(yīng)中的每一步都通過洗滌除去了未反應(yīng)物質(zhì)和干擾物質(zhì)。利用ELISA方法不僅可以定性而且可以定量檢測樣品中的微量殘留物，這種分析方法對(duì)儀器設(shè)備要求不高，具有簡便快速，靈敏度高，特異性強(qiáng)，易于標(biāo)準(zhǔn)化、自動(dòng)化和適于大容量樣本分析等優(yōu)點(diǎn)。20世紀(jì)80年代后，免疫分析技術(shù)已成為優(yōu)先研究、開發(fā)和利用的獸藥殘留快速檢測技術(shù)，美國化學(xué)學(xué)會(huì)已經(jīng)將免疫分析方法與GC、 HPLC方法一起列為化學(xué)獸藥殘留分析的三大支柱技術(shù)，這也為食品中微量孔雀石綠殘留檢測提供了新的技術(shù)。
[0007]半抗原是指能與對(duì)應(yīng)抗體結(jié)合可以發(fā)生抗原-抗體反應(yīng)、又不能單獨(dú)激發(fā)人或動(dòng)物體產(chǎn)生抗體的抗原，即它只有反應(yīng)原性，不具有免疫原性，故又稱作不完全抗原。通常，具有免疫原性的物質(zhì)分子量應(yīng)大于10000，而一般獸藥的分子量均小于1000，不能刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)獸藥抗原決定簇的特異性抗體，因此小分子物質(zhì)必須與大分子載體偶聯(lián)后才具有免疫原性，這也是小分子免疫分析的基本模式。半抗原的結(jié)構(gòu)直接影響了抗體的選擇性，半抗原分子的設(shè)計(jì)與合成是小分子免疫分析技術(shù)的關(guān)鍵所在。半抗原分子的設(shè)計(jì)應(yīng)以獸藥親體以及有毒理學(xué)意義的代謝產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)為目標(biāo)化合物，設(shè)計(jì)中應(yīng)相應(yīng)地突出特定獸藥的分子結(jié)構(gòu)，制備相應(yīng)的單一特異性抗體或族特異性抗體。一般理想的半抗原分子應(yīng)盡量具備與待測物類似的立體化學(xué)特征，以減少免疫交叉反應(yīng)性，提高抗體的特異性；同時(shí)，要保證半抗原與載體的大分子偶聯(lián)后，半抗原的特征結(jié)構(gòu)能最大限度地被免疫活性細(xì)胞所識(shí)別，以制備出具有預(yù)期選擇性和高親和力的抗體。
[0008]人工抗原是半抗原與大分子載體蛋白偶聯(lián)得到的完全抗原。使用載體不僅僅是簡單地增加半抗原的分子量，更重要的是利用其較強(qiáng)的免疫原性誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，從而使機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)半抗原及人工抗原的特異性抗體。因此，免疫分析技術(shù)的關(guān)鍵是半抗原的分子設(shè)計(jì)、合成、人工抗原及抗體的制備。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明申請(qǐng)的目的是通過設(shè)計(jì)合成具有三苯甲烷結(jié)構(gòu)的獸藥孔雀石綠的半抗原和人工抗原，突出了這類獸藥分子特異性抗原決定簇，然后免疫動(dòng)物產(chǎn)生親和性很高的特異性抗體，并以此為基礎(chǔ)建立了快速免疫方法，準(zhǔn)確檢測獸藥孔雀石綠。
[0010]本發(fā)明申請(qǐng)的設(shè)計(jì)思路是，先合成小分子目標(biāo)分析物半抗原，并與載體蛋白質(zhì)偶聯(lián)，制備有效的人工抗原，免疫動(dòng)物制備針對(duì)特定小分子分析物的特異性抗體，利用抗原抗體的特異性免疫學(xué)反應(yīng)和易被檢測識(shí)別的標(biāo)記物的放大作用，從而定性和定量的檢測樣本中超微量小分子目標(biāo)物。其選擇性在于免疫學(xué)反應(yīng)的測定性，其靈敏度取決于抗體的親和性和標(biāo)記物的可檢性，因此可以快速準(zhǔn)確的檢測獸藥孔雀石綠在樣`本中的殘用量。其關(guān)鍵在于半抗原的分子設(shè)計(jì)，合成和全抗原及抗體的制備。
[0011]孔雀石綠的結(jié)構(gòu)如圖2所示所示.從免疫學(xué)角度分析，電子云密度較高的二甲氨基取代的兩個(gè)苯環(huán)系統(tǒng)可能是產(chǎn)生特異性抗體的決定性特征結(jié)構(gòu)區(qū)。因此，半抗原設(shè)計(jì)中必須要保留這部分特征結(jié)構(gòu)，而在遠(yuǎn)離該藥物特征結(jié)構(gòu)區(qū)的非取代苯環(huán)的對(duì)位上衍生化與載體蛋白偶聯(lián)的間隔臂。本發(fā)明申請(qǐng)?jiān)谠O(shè)計(jì)合成孔雀石綠半抗原時(shí)，在非取代苯環(huán)的對(duì)位引入吸電子性質(zhì)的羧基，同時(shí)分別設(shè)計(jì)了長短不一的間隔臂。
[0012]本發(fā)明申請(qǐng)的目的之一是提供孔雀石綠半抗原。[0013]本發(fā)明的半抗原包括:(a) 4-[雙(4-二甲胺基)苯基]甲基苯甲酸，和 (b)5-{4-[雙(4-二甲胺基)苯基]甲基}苯基戊酸，其中，
(a)4-[雙(4-二甲胺基)苯基]甲基苯甲酸的結(jié)構(gòu)如下:
【權(quán)利要求】
1.一種孔雀石綠半抗原，其特征在于:所述的半抗原包括(a)4_[雙(4-二甲胺基)苯基]甲基苯甲酸，和(b)5-{4-[雙(4-二甲胺基)苯基]甲基}苯基戊酸，其中，(a)4-[雙 (4-二甲胺基)苯基]甲基苯甲酸的結(jié)構(gòu)如下:
2.權(quán)利要求1所述的孔雀石綠半抗原與載體蛋白連接形成的完全抗原，其特征在于: 以4-[雙(4-二甲胺基)苯基]甲基苯甲酸和5-{4_[雙(4-二甲胺基)苯基]甲基}苯基戊酸為半抗原，分別與卵清蛋白或血藍(lán)蛋白偶聯(lián)，其結(jié)構(gòu)如下:
3.權(quán)利要求1所述的4-[雙(4-二甲胺基)苯基]甲基苯甲酸的合成方法如下，其特征在于，包括如下步驟:稱取對(duì)-甲?；郊姿峒柞ズ吐然\于燒瓶中，然后加入N，N-二甲基苯胺，加熱到120-140°C，攪拌反應(yīng)4-6小時(shí)，乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯/正己烷= 1:2 的硅膠柱層析純化18_24h后，得到目標(biāo)化合物4-[雙(4-二甲胺基)苯基]甲基苯甲酸。
4.權(quán)利要求1所述的5-{4-[雙(4-二甲胺基)苯基]甲基}苯基戊酸的合成方法如下，其特征在于，包括如下步驟:稱取對(duì)-羥基苯甲酸溶于二氯甲烷中，(TC加入溴化芐及三乙胺，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)1-2天， (TC加入飽和氯化銨淬滅反應(yīng)，二氯甲烷萃取，濃縮，硅膠柱純化(乙酸乙酯/正己烷=1:3) 得到化合物4-羥甲基苯甲酸苯甲酯；將該產(chǎn)物溶于二氯甲烷中，(TC加入三氯異氰尿酸、NaHCO3及2，2，6，6-四甲基哌啶氧化物，反應(yīng)5-8分鐘，硅膠柱純化(乙酸乙酯/正己烷=1:2)，洗脫液濃縮得到化合物4-甲?；郊姿岜郊柞?；稱取wittig試劑溶于四氫呋喃中，慢慢加入六甲基二硅基胺基鋰，在-80—75°C攪拌0.5-2.0小時(shí)，加入4-甲?；郊姿岜郊柞ィ瑑尚r(shí)內(nèi)溫度由-80—75°C升到-25°C，TLC監(jiān)測，濃縮，硅膠柱純化(乙酸乙酯/正己烷=1:4)得到中間產(chǎn)物；將中間產(chǎn)物溶于無水甲醇， 加入鈀碳，氫氣保護(hù)，常溫?cái)嚢璺磻?yīng)4-6小時(shí)，TLC監(jiān)測，加入少量乙酸乙酯，硅膠柱純化(甲醇)，濃縮得化合物4- 丁酸乙酯基苯甲酸；將上述產(chǎn)物溶于無水四氫呋喃，0-4°C加入氯甲酸異丁酯及三乙胺，攪拌反應(yīng)1-2小時(shí)，加入硼氫化鈉，繼續(xù)攪拌反應(yīng)3-5小時(shí)，0-4°C加入HC l淬滅反應(yīng)，濃縮，乙酸乙酯萃取， 濃縮，硅膠柱純化(乙酸乙酯/正己烷=1:5)得到化合物5-(4-羥甲基-苯基)-戊酸乙酷；將該化合物溶于二氯甲烷中，0-4°C加入三氯異氰尿酸、NaHCO3及2，2，6，6-四甲基哌啶氧化物，反應(yīng)5-8分鐘后迅速過硅膠短柱(乙酸乙酯/正己 烷=1:4)，得到化合物5-(4-羥基_苯基)-戍酸乙酯；稱取氯化鋅和化合物5- (4-羥基-苯基)-戊酸乙酯于燒杯中，加入N，N- 二甲基苯胺， 加熱到110-130°C，攪拌反應(yīng)1-2天，TLC監(jiān)測，乙酸乙酯萃取，硅膠柱純化(甲醇/ 二氯甲烷 =1:10)，得目標(biāo)化合物5-{4_[雙(4-二甲胺基)苯基]甲基}苯基戊酸，產(chǎn)率25%。
5.權(quán)利要求2所述的完全抗原的制備方法，其特征在于，包括如下步驟:取權(quán)利要求1所述半抗原以及N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)于燒瓶內(nèi)加入無水四氫呋喃， 在N2保護(hù)下，逐滴加入溶有N，N- 二環(huán)己基碳二亞胺DCC的無水四氫呋喃溶液，邊滴邊攪拌，室溫(18-25°C)下攪拌反應(yīng)4-6 h，硅膠柱純化得到半抗原活化酯；取權(quán)利要求1所述半抗原的活化酯溶于DMF配成溶液A，載體蛋白溶于磷酸緩沖溶液中配成溶液B，然后在冰浴下將溶液A緩慢加入溶液B中，經(jīng)攪拌后在4°C下反應(yīng)過夜，最后將反應(yīng)液置入透析袋中，在4°C，ph=7.4的PBS溶液中透析三天，精確量取蛋白質(zhì)偶聯(lián)物溶液的體積，測定濃度和結(jié)合比，分裝，-20 V下貯藏。
6.使用權(quán)利要求2所述完全抗原制備抗體的方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)免疫:免疫動(dòng)物采用雄性新西蘭大耳白兔，免疫方法采用皮下和肌肉注射法，共進(jìn)行6次免疫,加強(qiáng)免疫分別在初次免疫后第2周,第4周和第6周進(jìn)行三次，以后兩次為一個(gè)月進(jìn)行一次，從第3次免疫后開始采血測效價(jià)，采血時(shí)間為免疫后第10天； 初次免疫:取Img上述人工抗原溶于0.9%的NaCl和弗式完全佐劑等體積配制的溶液中，進(jìn)行動(dòng)物免疫； 加強(qiáng)免疫:取0.5mg上述人工抗原溶于0.9%的NaCl和弗式不完全佐劑等體積配制的溶液中，進(jìn)行動(dòng)物免疫； (2)抗體純化:定時(shí)檢測動(dòng)物抗體效價(jià)，當(dāng)抗體對(duì)一定的包被抗原達(dá)到適宜效價(jià)時(shí)，采集血液，并離心獲得抗血清，使用Protein A-Sepharose 4B蛋白親和層析柱對(duì)抗血清進(jìn)行純化，制備IgG抗體。
7.權(quán)利要求6所述方法制備得到的本發(fā)明申請(qǐng)還提供上述方法得到的特異性抗體用于間接競爭ELISA方法的建立，為在食品`中檢測微量孔雀石綠殘留中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
【文檔編號(hào)】G01N33/53GK103524362SQ201310352708
【公開日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2013年8月14日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月14日
【發(fā)明者】胡章立 申請(qǐng)人:深圳大學(xué)