一種表征聚電解質(zhì)水凝膠平板膜厚度的改進(jìn)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種表征聚電解質(zhì)水凝膠平板膜厚度的改進(jìn)方法。將熒光標(biāo)記的聚陽離子（或/和聚陰離子），通過靜電作用形成聚電解質(zhì)水凝膠平板膜，在確定激光共聚焦掃描顯微鏡gain值和offset值之后，借助激光共聚焦掃描顯微鏡，對(duì)平板水凝膠膜的Z軸進(jìn)行層層掃描，可得到一系列的層掃照片，再對(duì)層掃照片進(jìn)行熒光強(qiáng)度定量，會(huì)得到熒光強(qiáng)度與Z軸步進(jìn)值的關(guān)系曲線，再對(duì)曲線進(jìn)行分段擬合及分段求導(dǎo)，導(dǎo)數(shù)最大值和最小值所對(duì)應(yīng)Z軸步進(jìn)值的差即為凝膠膜的厚度。
【專利說明】一種表征聚電解質(zhì)水凝膠平板膜厚度的改進(jìn)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及材料領(lǐng)域，是一種表征聚電解質(zhì)水凝膠平板膜厚度的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]膜厚是表征膜的一個(gè)重要參數(shù)。目前有關(guān)聚電解質(zhì)水凝膠膜厚度測(cè)量方法主要有光學(xué)顯微鏡觀察法，測(cè)微器測(cè)量法和熒光標(biāo)記方法。光學(xué)顯微鏡觀察法適用于比較厚的球形凝膠膜及平板凝膠膜，不適用于薄的平板凝膠膜。測(cè)微器測(cè)量法是將凝膠膜干燥后，測(cè)量凝膠膜厚度的方法；由于凝膠含水量很高，干燥后測(cè)得的凝膠膜厚度與真實(shí)凝膠膜厚度相差很大，因此這個(gè)方法使用受到限制。熒光標(biāo)記方法是利用熒光探針標(biāo)記的聚陽離子(或聚陰離子)，利用激光共聚焦掃描顯微鏡對(duì)Z軸進(jìn)行層層掃描、三維重建，通過在三維重建形成的左視圖或主視圖劃線，與標(biāo)尺比對(duì)，確定凝膠膜厚度。由于激光共聚焦掃描顯微鏡的gain和offset值對(duì)凝膠膜厚度影響很大(見圖1)，因此需要“參比”確定激光共聚焦掃描顯微鏡的gain和offset值。目前采用激光共聚焦測(cè)凝膠膜厚度方法存在以下問題:無法對(duì)激光共聚焦掃描顯微鏡gain和offset值進(jìn)行確定且邊界不易確定，人為因素影響大。
[0003]針對(duì)上述問題，本專利建立了激光共聚焦掃描顯微鏡gain和offset值確定方法及凝膠膜邊界的確定方法，可對(duì)聚電解質(zhì)水凝膠膜厚進(jìn)行準(zhǔn)確定量。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種可精確測(cè)量聚電解質(zhì)絡(luò)合水凝膠平板膜厚度的方法。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
[0006]一種表征聚電解質(zhì)絡(luò)合水凝膠平板膜厚度的改進(jìn)方法，借助于激光共聚焦掃描顯微鏡進(jìn)行操作，利用熒光標(biāo)記的方法測(cè)平板凝膠膜的厚度。首先熒光探針標(biāo)記聚陽離子，以熒光標(biāo)記的聚陽離子與聚陰離子形成的凝膠微球膜為陽性對(duì)照，確定激光共聚焦掃描顯微鏡gain值和offset值；
[0007]采用熒光標(biāo)記的聚陽離子聚合物溶液與聚陰離子聚合物形成的平板水凝膠反應(yīng)，形成聚電解質(zhì)絡(luò)合水凝膠平板膜；采用已確定的激光共聚焦掃描顯微鏡gain值和offset值，利用激光共聚焦掃描顯微鏡對(duì)平板水凝膠膜的Z軸(Z軸方向:垂直于平板凝膠膜表面的方向)進(jìn)行層層掃描，層掃厚度為0.5-10 μ m/層，可得到一系列層掃照片；
[0008]為表征水凝膠膜的厚度，需確定凝膠膜上層及下層邊界:利用Image J軟件確定層掃照片的熒光強(qiáng)度，會(huì)得到熒光強(qiáng)度與Z軸步進(jìn)值(步進(jìn)值:層掃厚度與每層層掃照片對(duì)應(yīng)的層數(shù)之積)的關(guān)系曲線；再利用Origin軟件對(duì)曲線進(jìn)行分段(可分為3段:熒光強(qiáng)度增加階段、熒光強(qiáng)度平衡階段和熒光強(qiáng)度降低階段)擬合及分段求導(dǎo)，導(dǎo)數(shù)最大值和最小值所對(duì)應(yīng)Z軸步進(jìn)值定義為凝膠膜上層及下層邊界；導(dǎo)數(shù)最大值和最小值所對(duì)應(yīng)Z軸步進(jìn)值的差即為凝膠膜的厚度。
[0009]A、熒光探針標(biāo)記聚陽離子聚合物，并配制標(biāo)記的聚陽離子聚合物溶液。
[0010]B、將聚陰離子溶液置于載玻片上，通過化學(xué)或物理等交聯(lián)劑形成聚陰離子水凝膠。
[0011]C、將粘附在載玻片上的聚陰離子水凝膠浸于熒光標(biāo)記的聚陽離子聚合物溶液中，使其充分反應(yīng)后，即形成聚電解質(zhì)水凝膠平板膜，生理鹽水清洗。
[0012]D、以步驟A獲得的熒光標(biāo)記陽離子聚合物制備的水凝膠微球膜為陽性對(duì)照，確定激光共聚焦掃描顯微鏡的gain值和offset值，采用激光共聚焦掃描顯微鏡對(duì)凝膠平板膜在Z軸上進(jìn)行層層掃描。
[0013]E、對(duì)層掃照片進(jìn)行熒光強(qiáng)度定量，得到熒光強(qiáng)度與Z軸步進(jìn)值的關(guān)系曲線，再對(duì)曲線進(jìn)行分段擬合及分段求導(dǎo)，導(dǎo)數(shù)最大值和最小值所對(duì)應(yīng)Z軸步進(jìn)值的差即為凝膠膜的厚度。
[0014]所述聚電解質(zhì)水凝膠平板膜中的聚陽離子為殼聚糖及其衍生物，α或ε聚賴氨酸，聚鳥氨酸、聚精氨酸，聚胺及其衍生物、聚酰胺及其衍生物、聚酰亞胺及其衍生物，及上述聚陽離子的共聚物中的一種或二種以上，分子量在lkDa-500kDa。
[0015]所述聚電解質(zhì)水凝膠平板膜中的聚陰離子為海藻酸鹽、透明質(zhì)酸鹽及纖維素硫酸鹽，及上述聚陰離子的共聚物中的一種或二種以上，分子量在lkDa-2000kDa。
[0016]所述熒光標(biāo)記的聚陽離子為熒光標(biāo)記反應(yīng)后通過反復(fù)清洗抽濾、透析或者凝膠柱分離等方法純化后的聚合物。
[0017]本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0018]1、對(duì)激光共聚焦測(cè)凝膠膜厚度條件進(jìn)行了確定，為真實(shí)表征凝膠膜厚度提供了條件。
[0019]2、采用曲線擬合及邊界求導(dǎo)方法，可準(zhǔn)確確定凝膠膜厚度邊界。
[0020]3、激光共聚焦掃描顯微鏡測(cè)凝膠厚度的分別率高，可檢測(cè)凝膠膜厚度的下限為3 μ m。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1激光共聚焦掃描顯微鏡的gain和offset值對(duì)凝膠膜厚度的影響，光鏡下觀察微囊膜厚為?ο μ m，此數(shù)值為真實(shí)膜厚，綠色為微囊膜:(a)光鏡下AC微囊；(b)Gain:335V，off set:-20%，激光共聚焦顯微鏡下綠色熒光對(duì)應(yīng)膜厚為10 μ m，與真實(shí)值相同；(c)Gain: 430V，off set:-20%，激光共聚焦顯微鏡下綠色熒光對(duì)應(yīng)的膜厚為48 μ m，遠(yuǎn)大于真實(shí)值；(d) Gain:480V，off set:-20%，激光共聚焦顯微鏡下綠色熒光對(duì)應(yīng)膜厚為99 μ m，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于真實(shí)值，嚴(yán)重失真。
[0022]圖2以FITC標(biāo)記的殼聚糖溶液與海藻酸鈣膠珠形成的AC微囊膜為參比，確定激光共聚焦掃描顯微鏡的gain值和offset值，綠色為AC微囊膜(放大倍數(shù):1000倍)。
[0023]圖3采用激光共聚焦掃描顯微鏡對(duì)AC平板膜的Z軸進(jìn)行層層掃描，得到一系列圖片。
[0024]圖4對(duì)每層層掃照片進(jìn)行熒光強(qiáng)度定量，會(huì)得到熒光強(qiáng)度與Z軸步進(jìn)值的關(guān)系曲線。
[0025]圖5對(duì)圖4曲線進(jìn)行擬合，并分別求導(dǎo)，導(dǎo)數(shù)最大值和最小值對(duì)應(yīng)Z軸步進(jìn)值(Zi和Z2)的差即為凝膠膜的厚度。

【具體實(shí)施方式】
[0026]比較實(shí)施例:
[0027]將lg殼聚糖溶于醋酸/醋酸鈉緩沖體系，用4M NaOH溶液調(diào)殼聚糖溶液pH至中性。將lmg/ml FITC溶液(溶劑為甲醇)緩慢滴加到殼聚糖溶液中反應(yīng)12h。采用4M NaOH溶液沉淀殼聚糖，50%乙醇洗至中性，100%乙醇洗至490nm處無吸收后，真空干燥過夜。配制0.5% (m/v, g/ml)FITC標(biāo)記的殼聚糖溶液。采用微囊制備儀制備海藻酸鈣微球。將海藻酸鈉溶液置于載玻片上，浸于1.l%CaCl2溶液中，鈣化30min形成海藻酸鈣凝膠。將粘附在載玻片上的海藻酸鈣凝膠及海藻酸鈣微球浸于FITC標(biāo)記的殼聚糖溶液中，使其充分反應(yīng)，分別形成熒光標(biāo)記的AC微囊膜和平板AC凝膠膜。
[0028]以FITC標(biāo)記的殼聚糖溶液與海藻酸鈣膠珠形成的AC微囊膜為參比，確定激光共聚焦掃描顯微鏡的gain值和offset值，見圖1。(a)光鏡下AC微囊；(b)Gain:335V，off set:-20%，激光共聚焦顯微鏡下綠色熒光對(duì)應(yīng)膜厚為10 μ m，與真實(shí)值相同；(c)Gain: 430V，off set:-20%，激光共聚焦顯微鏡下綠色熒光對(duì)應(yīng)的膜厚為48 μ m，遠(yuǎn)大于真實(shí)值；(d) Gain:480V，off set:-20%，激光共聚焦顯微鏡下綠色熒光對(duì)應(yīng)膜厚為99 μ m，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于真實(shí)值，嚴(yán)重失真。由此可見，如果不通過AC微囊膜為參比，確定激光共聚焦掃描顯微鏡的gain值和offset值，直接對(duì)平板膜進(jìn)行掃描會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果帶來很大的人為誤差。
[0029]實(shí)施例:一種表征海藻酸鈉-殼聚糖水凝膠平板膜厚度的方法
[0030]將lg殼聚糖溶于醋酸/醋酸鈉緩沖體系，用4M NaOH溶液調(diào)殼聚糖溶液pH至中性。將lmg/ml FITC溶液(溶劑為甲醇)緩慢滴加到殼聚糖溶液中反應(yīng)12h。采用4M NaOH溶液沉淀殼聚糖，50%乙醇洗至中性，100%乙醇洗至490nm處無吸收后，真空干燥過夜。配制濃度為0.5% (w/v，g/ml)FITC標(biāo)記殼聚糖溶液。將海藻酸鈉溶液置于載玻片上，浸于1.l%CaCl2溶液中，鈣化30min形成海藻酸鈣凝膠。將粘附在載玻片上的海藻酸鈣凝膠浸于FITC標(biāo)記的殼聚糖溶液中，使其充分反應(yīng)。
[0031]以FITC標(biāo)記的殼聚糖溶液與海藻酸鈣膠珠形成的AC微囊膜為參比，當(dāng)光鏡下微囊膜與熒光標(biāo)記的膜(綠色代表膜)完全重疊時(shí)，確定激光共聚焦掃描顯微鏡的gain值和offset值(Gain:335V, offset:-20%),見圖2。采用確定的gain及offset值對(duì)凝膠進(jìn)行層層掃描，會(huì)得到一系列的圖片，見圖3。采用Image J軟件中R0I manager功能，分析每張圖片的突光強(qiáng)度(Fluorescence intensity),可得到這一系列圖片對(duì)應(yīng)的突光強(qiáng)度。以Z軸步進(jìn)值(即層掃厚度與對(duì)應(yīng)照片層數(shù)之乘積)為橫坐標(biāo)，以熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，可得到熒光強(qiáng)度與Z軸步進(jìn)值之間的關(guān)系曲線，見圖4?？蓪⑶€分為3段，“增加階段”、“平衡階段”及“降低階段”，再利用Origin軟件中非線性擬合中Bolzman方程對(duì)增加階段和降低階段進(jìn)行分段擬合，可得到導(dǎo)數(shù)最大值和導(dǎo)數(shù)最小值對(duì)應(yīng)的Z軸步進(jìn)值Z1和Z2，凝膠膜厚度為“Z2-Z1”，見圖5。結(jié)果表明，凝膠膜厚度為20.74 μ m。
【權(quán)利要求】
1.一種表征聚電解質(zhì)絡(luò)合水凝膠平板膜厚度的改進(jìn)方法，其特征在于: 借助于激光共聚焦掃描顯微鏡進(jìn)行操作，利用熒光標(biāo)記的方法測(cè)平板凝膠膜的厚度。首先熒光探針標(biāo)記聚陽離子，以熒光標(biāo)記的聚陽離子與聚陰離子形成的凝膠微球膜為陽性對(duì)照，確定激光共聚焦掃描顯微鏡gain值和offset值； 采用熒光標(biāo)記的聚陽離子聚合物溶液與聚陰離子聚合物形成的平板水凝膠反應(yīng)，形成聚電解質(zhì)絡(luò)合水凝膠平板膜；采用已確定的激光共聚焦掃描顯微鏡gain值和offset值，利用激光共聚焦掃描顯微鏡對(duì)平板水凝膠膜的Z軸(Z軸方向:垂直于平板凝膠膜表面的方向)進(jìn)行層層掃描，層掃厚度為0.5-10 μ m/層，可得到一系列層掃照片； 為表征水凝膠膜的厚度，需確定凝膠膜上層及下層邊界:利用Image J軟件確定層掃照片的熒光強(qiáng)度，會(huì)得到熒光強(qiáng)度與Z軸步進(jìn)值(步進(jìn)值:層掃厚度與每層層掃照片對(duì)應(yīng)的層數(shù)之積)的關(guān)系曲線；再利用Origin軟件對(duì)曲線進(jìn)行分段(可分為3段:熒光強(qiáng)度增加階段、熒光強(qiáng)度平衡階段和熒光強(qiáng)度降低階段)擬合及分段求導(dǎo)，導(dǎo)數(shù)最大值和最小值所對(duì)應(yīng)Z軸步進(jìn)值定義為凝膠膜上層及下層邊界；導(dǎo)數(shù)最大值和最小值所對(duì)應(yīng)Z軸步進(jìn)值的差即為凝膠膜的厚度。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述表征膜厚的具體步驟如下: A、熒光探針標(biāo)記聚陽離子聚合物，并配制標(biāo)記的聚陽離子聚合物溶液； B、將聚陰離子溶液置于載玻片上，通過化學(xué)或物理等交聯(lián)劑形成聚陰離子水凝膠； C、將粘附在載玻片上的聚陰離子水凝膠浸于熒光標(biāo)記的聚陽離子聚合物溶液中，使其充分反應(yīng)后，即形成聚電解質(zhì)水凝膠平板膜，生理鹽水清洗； D、以步驟A獲得的熒光標(biāo)記陽離子聚合物制備的水凝膠微球膜為陽性對(duì)照，確定激光共聚焦掃描顯微鏡的gain值和offset值，采用激光共聚焦掃描顯微鏡對(duì)平板凝膠膜的Z軸方向進(jìn)行層層掃描； E、對(duì)層掃照片進(jìn)行熒光強(qiáng)度定量，得到熒光強(qiáng)度與Z軸步進(jìn)值的關(guān)系曲線，再對(duì)曲線進(jìn)行分段擬合及分段求導(dǎo)，導(dǎo)數(shù)最大值和最小值所對(duì)應(yīng)Z軸步進(jìn)值的差即為凝膠膜的厚度。
3.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述聚電解質(zhì)水凝膠平板膜中的聚陽離子為殼聚糖及其衍生物，α或ε聚賴氨酸，聚鳥氨酸、聚精氨酸，聚胺及其衍生物、聚酰胺及其衍生物、聚酰亞胺及其衍生物，及上述聚陽離子的共聚物中的一種或二種以上，分子量在 lkDa_500kDa。
4.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述聚電解質(zhì)水凝膠平板膜中的聚陰離子為海藻酸鹽、透明質(zhì)酸鹽及纖維素硫酸鹽，及上述聚陰離子的共聚物中的一種或二種以上，分子量在lkDa-2000kDa。
5.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述熒光標(biāo)記的聚陽離子為熒光標(biāo)記反應(yīng)后通過反復(fù)清洗抽濾、透析或者凝膠柱分離等方法純化后的聚合物。
【文檔編號(hào)】G01B11/06GK104422394SQ201310375432
【公開日】2015年3月18日 申請(qǐng)日期:2013年8月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月22日
【發(fā)明者】馬小軍, 宋益哲, 于煒婷, 王秀麗, 徐小溪, 鄭國爽, 李楠 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所