基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光的婦科腫瘤標(biāo)志物ca125、ca153、scca、he4芯片檢測(cè)系統(tǒng)及試劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種基于上轉(zhuǎn)化發(fā)光檢測(cè)婦科腫瘤四項(xiàng)系統(tǒng)(CA125、CA153、SCCA、HE4)，利用反應(yīng)杯檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。反應(yīng)杯檢測(cè)系統(tǒng)包括載體板，反應(yīng)檢測(cè)杯，熒光檢測(cè)儀。反應(yīng)檢測(cè)杯由反應(yīng)檢測(cè)杯、試管蓋組成。滴加樣本到反應(yīng)檢測(cè)杯中進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)5-15min將載體板取出插入熒光檢測(cè)儀的卡槽中讀取數(shù)值。本發(fā)明的特點(diǎn)是：結(jié)合上轉(zhuǎn)換發(fā)光檢測(cè)方法同時(shí)進(jìn)行婦科腫瘤CA125、CA153、SCCA、HE4四項(xiàng)標(biāo)志物的檢測(cè)。其背景值小，測(cè)量便捷、準(zhǔn)確，操作簡(jiǎn)單。數(shù)據(jù)wifi傳輸醫(yī)生快速獲得檢測(cè)結(jié)果，達(dá)到快速診斷。
【專利說明】基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光的婦科腫瘤標(biāo)志物CA125、CA153、SCCA、
HE4芯片檢測(cè)系統(tǒng)及試劑

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種免疫檢測(cè)系統(tǒng)和試劑檢測(cè)婦科腫瘤CA125，CA153，SCCA, HE4四項(xiàng)標(biāo)志物，是一種通過上轉(zhuǎn)換發(fā)光方法檢測(cè)婦科腫瘤四項(xiàng)標(biāo)志物的裝置，屬于醫(yī)療產(chǎn)品領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002]乳腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸鱗癌、子宮頸癌等婦科腫瘤疾病是影響廣大女性的健康的主要障礙。宮頸癌是女性生殖道最常見的腫瘤，近年來有發(fā)病率升高，發(fā)病年輕化的特點(diǎn)，在全球范圍的婦科癌癥中，宮頸癌是導(dǎo)致死亡的主要原因，發(fā)生率為493243例/年，死亡率273505例/年，全球范圍內(nèi)的死亡率為55%。婦科腫瘤引起了社會(huì)各界和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛關(guān)注。婦科腫瘤學(xué)家致力于婦科腫瘤早期診斷方法的研究，即找到一種簡(jiǎn)單、敏感性特異性高的腫瘤標(biāo)志物。特異性血清檢測(cè)物的發(fā)現(xiàn)，挽救了很多身患婦科惡性腫瘤患者的生命。在治療過程中可以通過標(biāo)志物來監(jiān)測(cè)病情。
[0003]常用的婦科腫瘤標(biāo)志物如:甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、絨毛膜促性腺激素(hCG)、糖類抗原CA125、糖類抗原CA199、糖類抗原CA724等，它們對(duì)病情監(jiān)測(cè)有重要作用。
[0004]CA125在婦科腫瘤標(biāo)志物中有大量的研究，是一種分子量為200000的糖蛋白。Bast等在1983年用卵巢漿液囊腺癌細(xì)胞免疫小鼠，并與骨髓瘤細(xì)胞雜交得到的單克隆抗體。作為監(jiān)測(cè)上皮性卵巢癌的重要標(biāo)志物，是區(qū)分良惡性疾病的一種常用的非侵入性方法。在近10余年中關(guān)于CA125的實(shí)驗(yàn)及臨床研究文章已多達(dá)2000余篇。通過對(duì)CA125半衰期的研究發(fā)現(xiàn)其與卵巢癌患者的生存期明顯相關(guān)。Gadducci等研究證明晚期卵巢癌患者CA125半衰期若< 25天，經(jīng)過減瘤術(shù)后化療達(dá)到病理完全緩解(CR)的機(jī)率較> 25天的高
3.585倍，半衰期長(zhǎng)者顯示預(yù)后差，應(yīng)給予加強(qiáng)治療。CA125半衰期是化療早期時(shí)的一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)，它能提示患者能否達(dá)到病理CR及病人的生存期。在臨床上CA125除了作為診斷的參考指標(biāo)外，還可作為隨訪及病情監(jiān)測(cè)的重要參考指標(biāo)。經(jīng)過治療后CA125值迅速下降則病人的預(yù)后往往較好。CA125達(dá)到正常值以后再升高，往往預(yù)示腫瘤復(fù)發(fā)。CA125的升高較臨床上能檢查到腫瘤要早3?6個(gè)月。CA125值的升高在大多數(shù)的卵巢癌患者中是先于臨床表現(xiàn)的，但用它來作為卵巢癌篩查的價(jià)值尚未肯定。雖然CA125是較好的卵巢上皮癌的標(biāo)志物，但主要在卵巢漿液性癌及未分化癌中的陽性率比較高，而在粘液性癌中則陽性率比較低。許多研究也提示在一些良性疾病中也有CA125的升高，如良性卵巢腫瘤、盆腔炎性疾病及肝硬化等。CA125還存在于許多器官的上皮或間皮中，如輸卵管、子宮、腹膜、胸膜及心包等，但在非腫瘤者的升高范圍不大，在作出臨床判斷前應(yīng)加以考慮。CA125作為卵巢癌的輔助診斷是個(gè)重要的標(biāo)志物，與病程有關(guān)。
[0005]CA153最早發(fā)現(xiàn)于乳腺癌細(xì)胞，是位于細(xì)胞膜上的一種分子量較大的粘液樣糖蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量300000-450000，包括一個(gè)膜區(qū)，一個(gè)細(xì)胞內(nèi)區(qū)和一個(gè)富含糖基的細(xì)胞外區(qū)，由抗人乳脂球膜抗體115D8和DF3所識(shí)別，存在于多種腺癌內(nèi)，如乳腺癌，肺癌，卵巢癌及胰腺癌。當(dāng)細(xì)胞癌變時(shí)，由于糖基轉(zhuǎn)化酶被激活，引起細(xì)胞膜上蛋白酶和唾液酸酶活性增高，細(xì)胞骨架破壞，CA糖類抗原增多并從癌細(xì)胞膜上分離出來，向血液中釋放，近年推出作為乳腺癌標(biāo)志物，正常< 40U/ml哺乳期婦女或良性乳腺腫瘤皆低于此值。乳腺癌晚期100%，其它期75%此值明顯升高?？勺鳛槟[瘤標(biāo)志物應(yīng)用于腫瘤的輔助診斷，療效監(jiān)測(cè)和轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的判定。對(duì)乳腺癌的動(dòng)態(tài)追蹤、判斷復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有一定價(jià)值。
[0006]SCCA(鱗狀細(xì)胞癌抗原)是1977年從子宮頸鱗癌的肝轉(zhuǎn)移灶中提取的一種蛋白質(zhì)，其分子量約為48000。該抗原在子宮頸癌、肺癌、皮膚癌、食管癌、喉癌等腫瘤組織中高表達(dá)，是目前為數(shù)不多的宮頸癌腫瘤標(biāo)志物之一。SCCA主要存在于含鱗癌成分的宮頸癌中，其臨界值為1.5ng/ml, SCCA的陽性率分別為O期12.4%, I期30.0% -40.0%, II期60.0% -70.0%, III期及IV期80.0 % -90.0%。近期研究表明，術(shù)前血清SCCA水平與宮頸癌的臨床分期、腫瘤病灶大小、間質(zhì)浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)是否累積等因素有相關(guān)性。SCCA值的改變與疾病進(jìn)展或好轉(zhuǎn)的變化是一致的。如果應(yīng)用化療，化療后的病情改變也與SCCA值的改變一致。如果治療后2-3個(gè)月的SCCA水平持續(xù)升高意味著治療效失敗。SCCA先于臨床2-6個(gè)月發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)病灶。即使治療前SCCA呈陰性，當(dāng)癌瘤復(fù)發(fā)時(shí)它也仍然有可能出現(xiàn)陽性反應(yīng)。因此SCCA是對(duì)宮頸癌病情監(jiān)測(cè)的一個(gè)很好的標(biāo)志物，對(duì)患者治療方案的確定提供了有意義的信息。
[0007]HE4在早期(I期)的卵巢癌中的敏感性及檢測(cè)卵巢癌總的敏感性均高于CA125，是卵巢癌敏感及特異的標(biāo)志物，可用于對(duì)卵巢癌早期診斷及輔助監(jiān)控卵巢癌患者的治療情況。英國(guó)的一項(xiàng)研究對(duì)200000婦女用30多種腫瘤標(biāo)記物分別單獨(dú)或與CA125聯(lián)合進(jìn)行卵巢癌篩查，HE4可以使診斷卵巢癌的敏感度和特異性提高。HE4抗原在漿液性、子宮內(nèi)膜樣及透明狀細(xì)胞性卵巢癌中高表達(dá)。未分化和移行細(xì)胞癌中有表達(dá)。在粘液性、生殖細(xì)胞及性索卵巢癌中幾乎不表達(dá)。
[0008]腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)是:
[0009](I)可以協(xié)助診斷腫瘤來源。
[0010](2)屬于無損傷檢查，可多次重復(fù)檢查。
[0011](3)方法簡(jiǎn)便，基層醫(yī)院也可檢測(cè)。
[0012](4)可以獲得客觀準(zhǔn)確的數(shù)值。
[0013]但現(xiàn)有臨床標(biāo)志物特異性較差。鑒于目前多數(shù)腫瘤標(biāo)志物的敏感性及特異性尚不理想，假陽性及假陰性時(shí)有發(fā)生。為提高這些腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)的準(zhǔn)確性，可以把具有不同特點(diǎn)的腫瘤標(biāo)志物結(jié)合起來聯(lián)合檢測(cè)。聯(lián)合檢測(cè)優(yōu)于只檢測(cè)單一任何一種腫瘤標(biāo)志物，它提高了臨床診斷價(jià)值。Woolas等用CA125作為標(biāo)志物來區(qū)分盆腔良性與惡性腫塊，其敏感性及特異性分別為78.1%及76.8%。若用5種標(biāo)志物(CA125、OVXU LASA, CA153及CA724)聯(lián)合檢測(cè)，并經(jīng)統(tǒng)計(jì)處理，則使其敏感性及特異性分別提高到90.6%及93.2%，大大提高了判斷的準(zhǔn)確性。因此將CA125、CA153、SCCA、HE4四種抗原組合，聯(lián)合檢測(cè)婦科腫瘤，以便提高檢測(cè)準(zhǔn)確性及特異性。
[0014]上轉(zhuǎn)換發(fā)光顆粒UCP在標(biāo)志物檢測(cè)領(lǐng)域具有巨大潛能。上轉(zhuǎn)換發(fā)光具有獨(dú)特的光學(xué)特性，它具有以下特點(diǎn):
[0015]I)靈敏性高:不受外界的背景干擾。
[0016]2)穩(wěn)定性高:避免了樣本腐蝕或自身衰變引發(fā)的淬滅現(xiàn)象。
[0017]3)靈活性高:可以組合多樣化光譜。
[0018]4)安全性高:對(duì)于檢測(cè)者、檢測(cè)樣品和環(huán)境都沒有危害。
[0019]5)方便簡(jiǎn)易:可對(duì)血液，尿液，唾液等樣品直接進(jìn)行檢測(cè)，無需特殊處理。
[0020]以上特點(diǎn)決定其在生物標(biāo)記物檢驗(yàn)方面應(yīng)用前景較廣闊。特別是在床旁檢測(cè)領(lǐng)域。
[0021]免疫檢測(cè)是測(cè)定一種特異蛋白的靈敏方法。典型的免疫檢測(cè)方法包括，酶聯(lián)免疫吸收分析(elisa)及免疫印跡法檢測(cè)(western blot)，免疫檢測(cè)的常規(guī)程序冗長(zhǎng)費(fèi)時(shí)、不易攜帶且成本較高。因此床旁檢測(cè)在醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域的大勢(shì)所趨，它的特點(diǎn)是快速，方便攜帶，操作簡(jiǎn)單。不僅僅可以在醫(yī)院使用，還可以在基層使用。因此一種基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光的檢測(cè)婦科腫瘤四項(xiàng)標(biāo)志物的快速檢測(cè)系統(tǒng)及聯(lián)合檢測(cè)試劑在臨床檢測(cè)領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0022]針對(duì)以上存在的問題，本發(fā)明提供一種免疫檢測(cè)系統(tǒng)和試劑檢測(cè)婦科腫瘤CA125，CA153，SCCA, HE4四項(xiàng)標(biāo)志物，本發(fā)明的特點(diǎn)是:結(jié)合上轉(zhuǎn)換發(fā)光方法同時(shí)檢測(cè)婦科腫瘤四項(xiàng)標(biāo)志物。利用四種標(biāo)記物聯(lián)檢，其準(zhǔn)確性及特異性更高；利用上轉(zhuǎn)換發(fā)光方法測(cè)定，其背景值小，測(cè)量便捷、準(zhǔn)確，操作簡(jiǎn)單。
[0023]其中一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中:基于上轉(zhuǎn)化發(fā)光的檢測(cè)婦科腫瘤四項(xiàng)標(biāo)志物的反應(yīng)杯系統(tǒng)，包括:載體板，反應(yīng)檢測(cè)杯，熒光檢測(cè)儀。載體板上同時(shí)包被有待檢測(cè)的四種抗原的抗體鼠抗人CA125、CA153、SCCA、HE4。將反應(yīng)杯中加入100微升標(biāo)記了 UCP顆粒的CA125、CA153、SCCA、HE4四種抗體混合液(濃度均為lmg/ml)，將試管蓋中間有小孔的蓋子蓋在反應(yīng)杯上，在凍干機(jī)中凍干。將載體板插入反應(yīng)檢測(cè)杯中，滴加100微升血清或體液、組織液等樣本進(jìn)行檢測(cè)，樣本可以直接與一抗及凍干液發(fā)生一步反應(yīng)，反應(yīng)5-15min將載體板取出插入熒光檢測(cè)儀的卡槽中讀取數(shù)值，將數(shù)值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中對(duì)樣本濃度進(jìn)行計(jì)算。直接打印檢測(cè)結(jié)果，或者檢測(cè)結(jié)果通過wifi傳輸?shù)结t(yī)院數(shù)據(jù)中心讓醫(yī)生直接調(diào)閱檢測(cè)結(jié)果，到達(dá)快速檢測(cè)，快速診斷的目的。而且該檢測(cè)儀器輕便，不到IKg;操作簡(jiǎn)便，一鍵出結(jié)果。廣泛適用于體檢，120急診，野外檢測(cè)等環(huán)境。
[0024]所述的載體板是黑色聚苯乙烯板。長(zhǎng)寬為6mmX10mm。其上有3X4個(gè)點(diǎn)，點(diǎn)間距為1.5_，點(diǎn)直徑為1.5_。其上包被有鼠抗人CA125、CA153、SCCA、HE4四種抗體。
[0025]在另一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，利用免疫層析試紙條檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。分析膜為硝酸纖維素膜，將膜上四個(gè)區(qū)域同時(shí)包被4種抗體，烘干；在試紙條前端包被兔抗羊IgG (lmg/ml)作為質(zhì)控點(diǎn)；利用UCP標(biāo)記CA125、CA153、SCCA、HE4四種抗體，將UCP標(biāo)記的四種抗體浸潤(rùn)在玻璃纖維墊上，烘干。烘干后裁剪成長(zhǎng)條。將硝酸纖維素膜、吸水紙、結(jié)合墊、樣品墊貼到底板上。結(jié)合墊上通過加樣區(qū)將樣品添加到加樣墊上，結(jié)果判讀處對(duì)應(yīng)著分析膜的檢測(cè)帶和質(zhì)控帶。
[0026]所述的突光檢測(cè)儀大小只有12cmX6cmX5.5cm,可以隨意攜帶。方便操作。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1為試管立體圖，為長(zhǎng)方體,長(zhǎng)寬高依次為10mmX4mmX40mm。底端有負(fù)壓裝置。
[0028]圖2為試管正面圖，內(nèi)徑為8mm。此側(cè)管體距底部1mm為磨砂透明面。
[0029]圖3為試管側(cè)面圖，內(nèi)徑為2mm。
[0030]圖4插有塑料桿的蓋子，蓋子為長(zhǎng)方形，上端有長(zhǎng)方形片狀把手，方便蓋子開合，蓋子中央下端連有寬約1-3_桿子，桿子下端連有可以自由取下的黑色高吸附蛋白的聚苯乙烯板，此板為長(zhǎng)方體，長(zhǎng)寬高依次為6mmX0.5-lmmX10mm。
[0031]圖5為中央帶有小孔的蓋子，蓋子為長(zhǎng)方形，中央留有直徑為Imm的小孔，蓋好蓋子后，可以將液體試劑加入試管中在凍干機(jī)中進(jìn)行凍干。
[0032]圖6為黑色聚苯乙烯板生產(chǎn)時(shí)整體壓制為A4紙大小，每個(gè)小片可以從整板上方便的拆下來。黑色聚苯乙烯板正面有3X4或者4X5個(gè)凹面小孔,孔徑為Imm或者0.5mm。
[0033]圖7為在板的上端后面有一扣眼，與桿子下端設(shè)計(jì)小扣，兩者可以隨意扣合及分離。A為側(cè)面圖，B為正面圖。
[0034]圖8A為熒光檢測(cè)裝置，B為屏幕,在激光燈一側(cè)留有卡槽,如圖9。
[0035]圖10為聚苯乙烯板取下后可放置在卡板上，然后將卡板放入卡槽中進(jìn)行讀數(shù)。
[0036]圖11上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析試紙條檢測(cè)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖，其中I為樣品墊；2為結(jié)合墊；3為分析膜；4為吸水墊；5為粘性低襯；6為4種蛋白連接蛋白抗體-UCP結(jié)合物；7為標(biāo)記蛋白I ;8為標(biāo)記蛋白2 ；9為標(biāo)記蛋白3 ； 10為標(biāo)記蛋白4。
[0037]圖12為將樣品加入裝有UCP顆粒標(biāo)記的四種抗凍干體混合液的反應(yīng)杯中。
[0038]圖13為將載體板插入反應(yīng)杯，其中裝有樣品及四種抗體的凍干混合液。
[0039]圖14為反應(yīng)結(jié)合示意圖，樣品中的抗原與載體板上的抗體及標(biāo)記了 UCP顆粒的抗體發(fā)生一步反應(yīng)。

【具體實(shí)施方式】
[0040]實(shí)施案例一:反應(yīng)杯檢測(cè)系統(tǒng)
[0041]1，如圖1管體內(nèi)加入U(xiǎn)CP顆粒標(biāo)記的CA125、CA153、SCCA、HE4蛋白溶液共100微升(濃度均為lmg/ml)，蓋上如圖5中間有圓孔的蓋子，放入凍干機(jī)內(nèi)在-50°C條件下凍干。
[0042]2，如圖6黑色聚苯乙烯上固定有12-20個(gè)點(diǎn)的蛋白，加在如圖6的凹面小孔內(nèi)，每點(diǎn)0.1-0.5微升。點(diǎn)間距0.5-1_。
[0043]3，包被蛋白在聚苯乙烯薄片上，包被4種蛋白鼠抗人CA125、CA153、SCCA, HE4，使4種蛋白在一條與反應(yīng)杯底邊平行的直線上，在檢測(cè)蛋白的上方，包被兔抗羊IgG(lmg/ml)作為質(zhì)控點(diǎn)。固定在如圖4手柄架上。放入如圖1的試管中，放入恒溫震蕩搖床中在37°C條件下反應(yīng)10分鐘。
[0044]4，反應(yīng)好后將管放入負(fù)壓抽濾器中抽出反應(yīng)的液體，取出帶黑色聚苯乙烯薄片的手柄架正面朝上放入如圖10的卡槽中，插入檢測(cè)儀側(cè)面方口中進(jìn)行檢測(cè)。
[0045]5，通過熒光檢測(cè)儀讀數(shù)得到反應(yīng)熒光值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的濃度。
[0046]實(shí)施案例二:免疫層析試紙條檢測(cè)
[0047]1，包被:將兔抗羊IgG稀釋到lmg/ml，作為C線包被液，將鼠抗人CA125、CA153、SCCA、HE4四種單抗(濃度均為lmg/ml)混合，作為T線。通過噴膜機(jī)，將T線包被液和C線包被液包被到硝酸纖維素膜上，晾干，即可得到單克隆抗體包被測(cè)試條。
[0048]2，利用 UCP 標(biāo)記 CA125、CA153、SCCA, HE4 四種抗體備用。
[0049]3，結(jié)合墊的制備:將上述利用UCP標(biāo)記的四種抗體浸潤(rùn)在玻璃纖維墊上，放入烘箱37°C下烘烤2h?？靖珊蟛眉舫砷L(zhǎng)條。
[0050]4，組裝試紙條:將硝酸纖維素膜、吸水紙、結(jié)合墊、樣品墊貼到底板上。
[0051]5，將樣品加到樣品墊上，5_15min后，將試紙條插入熒光檢測(cè)儀，在分析膜結(jié)果觀測(cè)處進(jìn)行數(shù)值讀取。
【權(quán)利要求】
1.一種基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光的婦科腫瘤標(biāo)志物CA125、CA153、SCCA、HE4芯片檢測(cè)系統(tǒng)及試齊U，其特征在于:上轉(zhuǎn)換發(fā)光UCP顆粒標(biāo)記了 CA125、CA153、SCCA, HE4四種抗體。
2.一種基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光的婦科腫瘤標(biāo)志物CA125、CA153、SCCA、HE4芯片檢測(cè)系統(tǒng)及試齊U，其特征在于:反應(yīng)杯檢測(cè)系統(tǒng)中的載體板為黑色聚苯乙烯，上面包被有鼠抗人CA125、CA153、SCCA, HE4 四種抗體。
3.一種基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光的婦科腫瘤標(biāo)志物CA125、CA153、SCCA、HE4芯片檢測(cè)系統(tǒng)及試齊U，其特征在于:將樣品滴加到反應(yīng)檢測(cè)杯中進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)5-15min后將卡取出載體板插入熒光檢測(cè)儀的卡槽中讀取數(shù)值，將數(shù)值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中對(duì)樣本濃度進(jìn)行計(jì)算。
4.如權(quán)利要求3所述，檢測(cè)樣品為血清、體液、組織液。
【文檔編號(hào)】G01N33/533GK104422770SQ201310375818
【公開日】2015年3月18日 申請(qǐng)日期:2013年8月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月23日
【發(fā)明者】羅朝領(lǐng), 王微微, 茅柳娟, 肖建國(guó), 王連會(huì), 王亮, 馬麗, 胡麗莉, 羅智允, 羅朝舉 申請(qǐng)人:上海凱璟生物科技有限公司