一種同時測定葡萄酒中原花青素和白藜蘆醇的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及食品檢驗(yàn)與分析領(lǐng)域，具體為一種測定葡萄酒中原花青素和白藜蘆醇的方法。本發(fā)明旨在采用高效液相色譜串聯(lián)二級陣列管檢測器與熒光檢測器，直接測定葡萄酒中的原花青素與白藜蘆醇。其中熒光檢測器能夠通過激發(fā)波長與發(fā)射波長的調(diào)整，減小雜質(zhì)的干擾，從而具有高選擇性，其靈敏度遠(yuǎn)高于紫外檢測器，可準(zhǔn)確、可靠地對物質(zhì)定量分析，能夠準(zhǔn)確可靠地檢測分析葡萄酒中的原花青素與白藜蘆醇這兩種功效成分。
【專利說明】—種同時測定葡萄酒中原花青素和白藜蘆醇的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及食品檢驗(yàn)與分析領(lǐng)域，具體為一種測定葡萄酒中原花青素和白藜蘆醇的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]原花青素(procyanidins，簡稱為PC)是黃烷_3_醇衍生物的總稱，主要有兒茶素的單體、二聚體、三聚體至十聚體組合而成。其特點(diǎn)為高效、低毒、高生物利用率，半致死量為LD50 = 3g/kg，是近年來不斷研究開發(fā)的一種極強(qiáng)體內(nèi)活性功能因子。許多研究表明，PC是清除自由基很強(qiáng)的抗氧化劑，其抗氧化，清除自由基的能力是VE的50倍，Vc的20倍，已引起人們的極大關(guān)注。它不僅廣泛分布于植物中，如銀杏、日本羅漢柏、北美崖柏、土耳其側(cè)柏、花棋松、白樺村野生刺葵、日本莽草、耳葉番瀉、海岸松、大黃、落葉松、蓮房等，也存在于某些飲料、蔬菜、水果和糧食中，如葡萄、葡萄酒、蘋果、蘋果汁、啤酒、茶葉、大麥、麥芽、高梁、豆科植物、番荔枝、野草毒、櫻桃等。在涉及的眾多天然產(chǎn)中，葡萄及其制品中的PC含量豐富，故研究較多。目前該物質(zhì)的定量測定方法包括滴定法、分光法、電化學(xué)法、化學(xué)發(fā)光法、毛細(xì)管電泳以及在鐵鹽酸化降解基礎(chǔ)上的HPLC法。白藜蘆醇(resveratrol)亦稱芪三酚，是一種植物激素，值得注意的是它可以在葡萄釀造過程中，由于生物化學(xué)酶的催化反應(yīng)生成。優(yōu)質(zhì)葡萄酒白藜蘆醇的含量較高，而勾兌酒(葡萄汁加酒精)白藜蘆醇含量為零。目前，研究表明它具有抗腫瘤、抗心血管疾病、治療突變、抗氧化、抗菌抗炎、保肝、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及雌激素調(diào)節(jié)等生物藥理活性。目前這種物質(zhì)的測定方法有高效液相色譜法、熒光法、化學(xué)發(fā)光法、毛細(xì)管電泳法、電化學(xué)法。
[0003]申請?zhí)枮?01210184125.5的中國專利曾公布了一種利用HPLC測定葡萄和柑橘果實(shí)中17種酚類物質(zhì)的方法，即采用高效液相色譜法對葡萄以及柑橘果實(shí)中的沒食子酸、綠原酸、咖啡酸、丁香酸、香豆酸、蘆丁、阿魏酸、橙皮苷、柚皮苷、水楊酸、槲皮素、川陳皮素、桔皮素、兒茶素、表兒茶素、苯甲酸、白藜蘆醇進(jìn)行測定，通過紫外檢測器定性定量分析，但是采用紫外檢測器，需對樣品進(jìn)行一系列復(fù)雜的提取與純化程序，雜質(zhì)干擾較多；并且由于采用了繁瑣的萃取前處理技術(shù)，樣品有所損失，測量精度不高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為解決上述問題，本發(fā)明旨在采用高效液相色譜串聯(lián)二級陣列管檢測器與熒光檢測器，直接測定葡萄酒中的原花青素與白藜蘆醇。其中熒光檢測器能夠通過激發(fā)波長與發(fā)射波長的調(diào)整，減小雜質(zhì)的干擾，從而具有高選擇性，其靈敏度遠(yuǎn)高于紫外檢測器，可準(zhǔn)確、可靠地對物質(zhì)進(jìn)行定量分析。
[0005]具體技術(shù)方案如下:一種測定葡萄酒中原花青素和白藜蘆醇的方法，包括以下步驟:
(I)樣品處理
取葡萄酒適量過有機(jī)濾膜后備用作為待測樣品； (2)高效液相色譜儀系統(tǒng)的測定
取適量待測樣品加入高效液相色譜儀中，利用流動相對其進(jìn)行梯度洗脫，然后利用二級管陣列檢測器對樣品中的原花青素和白藜蘆醇進(jìn)行定性分析，二級管陣列檢測器的工作原理是復(fù)色光通過樣品池被組分選擇性吸收后再進(jìn)入單射器，照射在二極管陣列裝置上使每個納米波長的光強(qiáng)度轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的電信號強(qiáng)度，即獲得組分的吸收光譜，從而獲得特定組分的結(jié)構(gòu)信息，有助于未知組分或復(fù)雜組分的結(jié)構(gòu)確定，因此，可以根據(jù)目標(biāo)物的色譜保留時間(Rt)與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)保留時間比較初步對化合物定性，同時利用目標(biāo)物與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的吸收光譜比較進(jìn)一步定性，雙重定性更為準(zhǔn)確可靠；最后再利用熒光檢測器對樣品中的原花青素和白藜蘆醇進(jìn)行定量分析，熒光檢測器是利用具有特殊結(jié)構(gòu)的化合物收到紫外光激發(fā)(Eex)后能發(fā)射出比激發(fā)光源波長更長的光(Eail)的熒光特性來檢測的，許多有機(jī)化合物具有天然熒光活性，其中帶有芳香基團(tuán)的化合物具有熒光活性很強(qiáng)，在一定條件，熒光強(qiáng)度與物質(zhì)濃度成正比，通過熒光的強(qiáng)度大小可以確定物質(zhì)的濃度，它特別適合于稠環(huán)芳烴、甾族化合物等，原花青素與白藜蘆醇均具有稠環(huán)芳烴結(jié)構(gòu)。熒光檢測器靈敏度高、選擇性好，比紫外檢測器高出2-3個數(shù)量級。
[0006](3)通過標(biāo)準(zhǔn)曲線定量
分別稱取適量原花青素和白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品，利用甲醇溶解和定容，依次配置兩標(biāo)準(zhǔn)品的混合溶液，其中，原花青素濃度依次為0.0100,0.0500,0.100,0.150,0.200,0.250mg/ml,白藜蘆醇的濃度依次為1.00,5.00、10.0、15.0,20.0,25.0、30.0 μ g/ml，將混合溶液重復(fù)步驟(2)進(jìn)行測定，所得數(shù)據(jù)以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，得到峰面積-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，由此曲線來確定樣品中原花青素和白藜蘆醇的含量。
[0007]高效液相色譜儀系統(tǒng)測定時，液相色譜條件為:色譜柱為ultimate XB-C18色譜柱，其規(guī)格為150mm X 4.6mm, 1.d.5 μ m ;流動相A為0.1%甲酸，流動相B為乙腈，梯度洗脫成程序:0min—lOmin，10%B, lOmin—llmin，10%B — 25%B, llmin—23min，25%B，23min—24min，25%B — 10%B, 24min—30min, 10%B ;流速為 lml/min，柱溫為 30°C，進(jìn)樣量為 20 μ I ；二級管陣列檢測器的掃描波長為210nm—600nm ;突光檢測器條件為:0min—Ilmin時的激發(fā)波長和發(fā)射波長分別是280nm、305nm，llmin — 30min的激發(fā)波長和發(fā)射波長分別是320nm、370nmo
[0008]通過上述技術(shù)方案，本發(fā)明所提供的測定方法具有高選擇性、高靈敏度、能夠準(zhǔn)確可靠地檢測分析葡萄酒中的原花青素與白藜蘆醇這兩種功效成分。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]圖1為標(biāo)準(zhǔn)品二級管陣列檢測器色譜圖；
圖2為樣品二級管陣列檢測器色譜圖；
圖3為標(biāo)準(zhǔn)品二級管陣列檢測器光譜圖；
圖4為樣品二級管陣列檢測器光譜圖；
圖5為標(biāo)準(zhǔn)品熒光檢測器色譜圖；
圖6為樣品熒光檢測器色譜圖；
圖7為原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線；
圖8為白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)曲線?！揪唧w實(shí)施方式】
[0010]—、測定所采用設(shè)備及藥品如下:Waters 2695型高效液相色譜儀系統(tǒng)，Waters2996型二極管陣列檢測器，waters 2475熒光檢測器，Empower色譜工作站及數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；原花青素(> 95%，天津尖峰天然研究開發(fā)有限公司)；白藜蘆醇(中國藥品生物制品檢定所，批號:111535) ;saint coeur牌葡萄酒一瓶。
[0011]二、測定步驟如下:
(1)樣品處理
各取市售saint coeur牌葡萄酒Iml過0.22 μ m有機(jī)濾膜后備用有機(jī)濾膜后備用作為待測樣品；
(2)高效液相色譜儀系統(tǒng)的測定
取Iml待測樣品加入高效液相色譜儀中，利用流動相對其進(jìn)行梯度洗脫，液相色譜條件為:色譜柱為ultimate XB-C18色譜柱,其規(guī)格為150mm X 4.6mm, 1.d.5μηι;流動相A為0.1%甲酸,流動相B為乙腈,梯度洗脫成程序:0min—lOmin, 10%B, IOmin一11 min, 10%B—25%B, llmin—23min, 25%B, 23min—24min，25%B — 10%B, 24min—30min，10% B ;流速為lml/min，柱溫為30°C，進(jìn)樣量為20 μ I。
[0012]然后利用二級管陣列檢測器對樣品中的原花青素和白藜蘆醇進(jìn)行定性分析，本次測定時，二級管陣列檢測器的掃描波長210nm — 600nm ;最后再利用熒光檢測器對樣品中的原花青素和白藜蘆醇進(jìn)行定量分析。本次測定時，熒光檢測器的條件為:0min — Ilmin時的激發(fā)波長(Eex)和發(fā)射波長(Eem)分別是280nm、305nm, llmin一30min的激發(fā)波長(Eex)和發(fā)射波長(Eem)分別是320nm、370nm。
[0013](3)通過標(biāo)準(zhǔn)曲線定量
精密稱取原花青素0.0300g于IOml容量瓶中，用甲醇溶解并定容。得3.00mg/ml原花青素標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密稱取0.0150g白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品于IOml容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配得1.50 mg/ml白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)儲備液，再用甲醇稀釋5倍得標(biāo)準(zhǔn)使用液0.300mg/ ml。用甲醇稀釋，依次配置兩標(biāo)準(zhǔn)品的混合溶液。其中，原花青素濃度為0.0100,0.0500,0.100、0.150,0.200,0.250mg/ml 的標(biāo)準(zhǔn)工作液，白藜蘆醇的濃度為 1.00,5.00、10.0,15.0,20.0、25.0、30.0μ g/ml，將混合溶液重復(fù)步驟(2)進(jìn)行測定，所得數(shù)據(jù)以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，得到峰面積-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0014](4)數(shù)據(jù)分析
如圖1和圖2對比可知，在二級管陣列檢測器色譜圖上，標(biāo)準(zhǔn)品原花青素和白藜蘆醇的保留時間分別為8.489分鐘和20.108分鐘，而樣品中原花青素和白藜蘆醇的保留時間分別為8.504分鐘和20.504分鐘，這與標(biāo)準(zhǔn)品接近；如圖3和圖4所示，在二級管陣列檢測器光譜圖上，標(biāo)準(zhǔn)品原花青素和白藜蘆醇的最大吸收波長分別是280nm和306nm，而樣品中原花青素和白藜蘆醇的最大吸收波長分別為279nm和306nm，這與標(biāo)準(zhǔn)品接近，因此，由光譜和色譜圖來定性分析樣品的這兩種成分。
[0015]如圖5和圖6所示，標(biāo)準(zhǔn)品原花青素和白藜蘆醇的保留時間分別為8.489分鐘和20.108分鐘，而樣品中原花青素和白藜蘆醇的保留時間分別為8.517分鐘和20.237分鐘，如圖7和圖8所示，所得峰面積-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為:
原花青素:Y=6.00*108Χ+3.54*105，相關(guān)系數(shù) R=0.9989 ；白藜蘆醇:Y=3.0O氺IO9 Χ+5.60*106，相關(guān)系數(shù) R=0.9991 ；
由此測得I ml saint coeur牌葡萄酒中原花青素與白藜蘆醇的含量是1.326mg/ml和8.585 ug/ml。
[0016]對本次測定原花青素與白藜蘆醇的方法進(jìn)行方法學(xué)考察，所得結(jié)果如下表:
【權(quán)利要求】
1.一種同時測定葡萄酒中原花青素和白藜蘆醇的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)樣品處理 取葡萄酒適量過有機(jī)濾膜后備用作為待測樣品； (2)高效液相色譜儀系統(tǒng)的測定 取適量待測樣品加入高效液相色譜儀中，利用流動相對其進(jìn)行梯度洗脫，然后利用二級管陣列檢測器對樣品中的原花青素和白藜蘆醇進(jìn)行定性分析，最后再利用熒光檢測器對樣品中的原花青素和白藜蘆醇進(jìn)行定量分析； (3)通過標(biāo)準(zhǔn)曲線定量 分別稱取適量原花青素和白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品，利用甲醇溶解和定容，依次配置兩標(biāo)準(zhǔn)品的混合溶液，其中，原花青素濃度依次為0.0100,0.0500,0.100,0.150,0.200,0.250mg/ml,白藜蘆醇的濃度依次為1.00,5.00、10.0、15.0,20.0,25.0、30.0 μ g/ml，將混合溶液重復(fù)步驟(2)進(jìn)行測定，所得數(shù)據(jù)以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，得到峰面積-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，由此曲線來確定樣品中原花青素和白藜蘆醇的含量。
2.如權(quán)利要求1所述一種測定葡萄酒中原花青素和白藜蘆醇的方法，其特征在于，高效液相色譜儀系統(tǒng)測定時，液相色譜條件為:色譜柱為ultimate XB-C18色譜柱,其規(guī)格為150 mm X 4.6 mm, 1.d.5 μ m ;流動相A為0.1%甲酸，流動相B為乙腈，梯度洗脫成程序:0 min—10 min, 10% B, 10 min —11 min, 10% B — 25% B, 11 min — 23 min，25% B, 23min—24 min, 25% B — 10% B, 24 min—30min, 10% B ;流速為 I ml/min，柱溫為 30°C，進(jìn)樣量為20 μ 1
3.如權(quán)利要求1所述一種測定葡萄酒中原花青素和白藜蘆醇的方法，其特征在于，二級管陣列檢測器的掃描波長為210 nm一600 nm。
4.如權(quán)利要求1所述一種測定葡萄酒中原花青素和白藜蘆醇的方法，其特征在于，熒光檢測器條件為:0 min一Ilmin時的激發(fā)波長和發(fā)射波長分別是280nm、305nm, Ilmin一30min的激發(fā)波長和發(fā)射波長分別是320 nm、370 nm。
【文檔編號】G01N21/64GK103558164SQ201310387469
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年8月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月30日
【發(fā)明者】黃宏南, 劉榮麗, 周芬霞, 劉懷永, 鐘碧萍 申請人:黃宏南