一種定量檢測樣品中小分子化合物的測試條及方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種定量檢測樣品中小分子化合物的測試條及方法，采用其結(jié)合墊上包含熒光乳膠微粒以及小分子化合物抗體的測試條，通過時間分辨熒光免疫層析方法進行檢測，和標(biāo)準(zhǔn)曲線進行比較，從而確定小分子化合物是否存在或檢測其含量。本發(fā)明可以定量檢測樣品小分子化合物，可大幅度消除非特異性的結(jié)合，使檢測信號的信噪比顯著提高，具有快速、高靈敏度、高特異性等優(yōu)點。
【專利說明】-種定量檢測樣品中小分子化合物的測試條及方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及檢測領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及一種檢測樣品中小分子化合物的測試 條及方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 免疫層析檢測技術(shù)（immunoc虹omatographic test)又稱為免疫測流檢測 (lateral flow immunoassay, LFIA)，是80年代興起的一項快速檢測技術(shù)。經(jīng)過多年的發(fā) 展，此項技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床診斷，毒品檢測和食品安全等領(lǐng)域。
[0003] 檢測大多數(shù)小分子化合物，通常采用競爭抑制法來檢測。在免疫層析方法中，將小 分子物質(zhì)的完全抗原固定于硝酸纖維膜上的檢測區(qū)（固相抗原），待檢樣品溶液中的小分 子物質(zhì)（游離抗原）與固相抗原競爭結(jié)合膠體金或彩色乳膠微球標(biāo)記的抗小分子物質(zhì)的單 克隆抗體（標(biāo)記抗體）。如果待檢樣品中含有的小分子物質(zhì)，將抑制標(biāo)記抗體與固定抗原 的結(jié)合，抑制在硝酸纖維素膜的檢測區(qū)形成色帶。測定后檢測區(qū)如果形成色帶，則結(jié)果為陰 性，待測樣品不含待測小分子物質(zhì)；反之，不形成色帶，則結(jié)果為陽性，檢測樣品含有待測小 分子物質(zhì)。
[0004] 由于膠體金或彩色乳膠微球標(biāo)記檢測是通過肉眼來判別結(jié)果，目前W膠體金或彩 色微球標(biāo)記的檢測方法只能作為一種定性或半定量的檢測。長期W來，人們嘗試使用閱讀 儀器來對免疫層析檢測條進行定量，但是，由于膠體金或彩色乳膠微粒是W顏色的深淺作 為檢測的信號，定量檢測的準(zhǔn)確度和靈敏度都難W達到要求，也有一些W磁性微粒或普通 的英光微球作為標(biāo)記，通過檢測磁性或英光的強弱來實現(xiàn)定量，取得了較好的效果。但是仍 然存在一些問題。主要是免疫層析檢測的材料中硝酸纖維膜等均會在激發(fā)光作用下發(fā)出不 同程度的英光，同時檢測樣本如血液、尿樣及唾液等均含有蛋白、核酸、糖類均具有英光效 應(yīng)，因此而導(dǎo)致檢測的背景較高，影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。
[0005] 因此，本領(lǐng)域需要開發(fā)快速、準(zhǔn)確、高效、簡便地定量檢測小分子化合物化合物的 方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的就是提供一種定量檢測樣本中小分子化合物的方法，快速、高效、簡 便、準(zhǔn)確。
[0007] 在本發(fā)明的第一方面，提供一種測試條，包括樣品墊、結(jié)合墊、反應(yīng)膜、吸收墊、和 背襯，所述反應(yīng)膜上設(shè)置檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)，所述結(jié)合墊上包含抗體復(fù)合物，所述抗體復(fù)合物 包含英光乳膠微粒W及小分子化合物抗體，所述小分子化合物抗體偶聯(lián)于所述英光乳膠微 粒。
[0008] 在另一優(yōu)選例中，所述小分子化合物的分子量為1-lOOOODa。
[0009] 在另一優(yōu)選例中，所述小分子化合物為毒品和精神類藥品，包括但不限于；海洛 因、嗎啡、安非他明、甲基安非他明、MDMA、氯胺麗、可卡因、杜冷下、芬太尼、曲馬多、大麻類、 下丙諾啡、美沙麗、可待因、咖啡因、麻黃堿、偽麻黃堿、安定、立哇侖、BZO、己比妥、立環(huán)類抗 憂郁藥物。
[0010] 在另一優(yōu)選例中，所述小分子化合物為食品中的有害物質(zhì)，包括但不限于；鹽酸克 侖特羅、萊克多己胺、沙下胺醇、H聚氯胺、孔雀石綠、蘇丹紅、黃曲霉素B1、黃曲霉素Ml、有 機磯、除蟲劑、除草劑，各種激素如孕麗、雌H醇、睪丸麗等。
[0011] 在另一優(yōu)選例中，所述小分子化合物為食品中殘留的抗生素，包括但不限于；青霉 素、氨予青霉素、阿莫西林、頭抱、慶大霉素、四環(huán)素、賴胺類抗生素、巧喃類抗生素。
[0012] 在另一優(yōu)選例中，所述英光乳膠微粒為銅系金屬和/或銅系金屬馨合物包被的乳 膠微粒。
[0013] 在另一優(yōu)選例中，所述結(jié)合墊上還包含兔IgG或鼠IgG。
[0014] 在另一優(yōu)選例中，所述質(zhì)控區(qū)包含羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG。
[0015] 在另一優(yōu)選例中，所述檢測區(qū)包含小分子化合物與載體蛋白的偶聯(lián)物。
[0016] 在另一優(yōu)選例中，所述載體蛋白為人血清白蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白。
[0017] 本發(fā)明的第二方面，提供一種檢測試劑盒，包括：
[0018] (a)測試條，所述測試條包括樣品墊、結(jié)合墊、檢測區(qū)、反應(yīng)膜、質(zhì)控區(qū)、吸收墊、和 背襯；
[0019] (b)抗體復(fù)合物，所述抗體復(fù)合物包含英光乳膠微粒W及小分子化合物抗體，所述 小分子化合物抗體偶聯(lián)于所述英光乳膠微粒；和
[0020] (C)容器。
[0021] 本發(fā)明的第H方面，提供第一方面所述的測試條的用途，用于制備檢測飲用水、飲 料、全血、血漿、血清、尿液、汗液、巧液或唾液中小分子化合物的試劑盒。
[0022] 本發(fā)明的第四方面，提供一種檢測小分子化合物的方法，包括步驟：
[0023] (1)將待測物樣品加至第一方面所述的測試片的樣品墊；
[0024] (2)采用時間分辨英光免疫層析方法測量所述測試片的檢測區(qū)的英光強度及質(zhì)控 區(qū)的英光強度，從而確定小分子化合物是否存在，或從而換算為小分子化合物的含量。
[0025] 在另一優(yōu)選例中，在步驟（2)中，將測試區(qū)的英光強度與質(zhì)控區(qū)的英光強度的比 值，和標(biāo)準(zhǔn)曲線進行比較，從而確定小分子化合物的含量。
[0026] 在另一優(yōu)選例中，所述檢測小分子化合物為定性、半定量、或定量檢測小分子化合 物。
[0027] 本發(fā)明的第五方面，提供一種定量檢測待測物的英光測量裝置，包括：
[0028] (a)第一方面所述的測試片；和
[0029] 化）用于檢測英光強度的檢測器。
[0030] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可W互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0031] 圖1顯示了本發(fā)明的一種免疫層析試紙條（板）的結(jié)構(gòu)示意圖，
[0032] 其中，各標(biāo)識如下；1為樣品墊，2為結(jié)合墊，3為檢測區(qū)，4為反應(yīng)膜，5為質(zhì)控區(qū) (對照區(qū))，6為吸收墊，7為背襯。
[0033] 圖2顯示了本發(fā)明采用免疫層析試紙條進行檢測的原理示意圖。
[0034] 圖3為樣品濃度與T/C值關(guān)系圖，其中，X軸為樣品濃度，Y軸為T/C值，即T線英 光值/C線英光值。

【具體實施方式】
[00巧]本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，意外發(fā)現(xiàn)選用英光乳膠微粒標(biāo)記小分子化合物 的抗體，結(jié)合時間分辨英光免疫層析技術(shù)，能夠即時快速定量檢測特定小分子化合物。與現(xiàn) 有的膠體金W及普通的英光的P0CT(Point of Care Test,床邊診斷或即時檢測）方法相 比，本發(fā)明方法的可W消除樣本中的英光物質(zhì)、激發(fā)光和膜本身對檢測的干擾，使檢測的靈 敏度和/或特異性均有顯著提高。
[0036] 術(shù)語
[0037] 免疫層析技術(shù)
[0038] 免疫層析技術(shù)（immunoc虹omatography)是20世紀(jì)80年代末90年代初建立的一 種快速檢測技術(shù)。由于免疫層析技術(shù)不須進行結(jié)合標(biāo)記物與自由標(biāo)記物的分離，因而操作 簡單、快速，非常適合現(xiàn)場檢測之用。
[0039] 時間分辨英光免疫分析
[0040] 時間分辨英光免疫分析（time resolved fluoro immunoassay, TRFIA)是 20 世紀(jì) 80年代初在傳統(tǒng)英光免疫分析的基礎(chǔ)上創(chuàng)立的一種新型非放射性標(biāo)記免疫分析技術(shù)，是目 前最靈敏的微量分析技術(shù)。
[0041] 測試條上檢測區(qū)域的檢測信號的獲取，將測試條上的檢測信號傳遞過來的光信 號，通過光學(xué)聚光裝置、分光裝置，和光學(xué)光路整形等，得到615皿± 10皿左右的英光光斑， 將此英光光斑傳遞到光學(xué)傳感器光電倍增管，獲得測試條上檢測區(qū)域的檢測光信號。通過 控制信號讀取時間為10微砂到400微砂，得到一個扣除英光本底的檢測信號。通過光電信 號轉(zhuǎn)換，將光信號轉(zhuǎn)換為電信號傳送給計算控制部件處理，最終完成檢測。
[0042] 與傳統(tǒng)的英光素標(biāo)記不同，它所用的示蹤物是具有獨特英光特性的銅系元素及其 馨合物，可有效排除樣品自然英光的干擾，具有靈敏度高、特異性強、穩(wěn)定性好和無放射性 污染等特點，靈敏度高達10^19,較放射免疫分析化IA)高出3個數(shù)量級。在臨床免疫檢驗 和科學(xué)研究中的應(yīng)用越來越廣泛。
[0043] 時間分辨英光免疫層析技術(shù)
[0044] 時間分辨英光免疫層析技術(shù)是基于免疫層析技術(shù)的時間分辨英光分析技術(shù)，是 在時間分辨英光免疫分析儀的基礎(chǔ)上，將時間分辨英光免疫分析和免疫層析技術(shù)相結(jié)合， 省去了繁瑣的加樣、洗涂步驟，試劑穩(wěn)定性好，操作簡單，檢測速度快，靈敏度高，可廣 泛應(yīng)用于現(xiàn)場定量檢測，也可作為P〇CT(Point of Care Test,床邊診斷或即時檢測）分析 儀。
[0045] 銅系元素
[0046] 到目前為止，己有5種銅系元素被用于TRFIA，其中常用的有Eu、化和Sm，而 Eu (館元素）又是在標(biāo)記抗原抗體中應(yīng)用最廣的元素。銅系元素在游離狀態(tài)下，英光信號 很微弱，僅僅是分子間共振能級的能量傳遞，無福射躍遷回基態(tài)發(fā)射英光的機率很小，但 其馨合物在紫外光源的激發(fā)下能發(fā)射英光。與傳統(tǒng)的英光素標(biāo)記物相比，銅系元素具有較 寬的激發(fā)光譜帶和較窄的發(fā)射光譜帶，英光持續(xù)時間長，且英光光譜的Stocks位移較大， 利用光譜分辨技術(shù)和時間分辨技術(shù)可有效排除激發(fā)光和非特異性英光的干擾。
[0047] 乳膠微粒
[004引在本文中，術(shù)語"乳膠微粒"、"乳膠微球"可W互換使用；"英光微球V'英光微粒"、 "英光乳膠微粒"、"英光乳膠微球"可W互換使用。
[0049] 在醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域，從最早的乳膠凝集試驗發(fā)展到今天復(fù)雜的多元化檢測。W乳膠 微粒作為抗原抗體的標(biāo)記物，主要是由于乳膠微粒本身的特性，它可W進行多種形式表面 功能化修飾，密度改變和特殊屬性的改變（比如：顏色改變、英光或磁性等），使得乳膠成為 檢測中的一個重要部分。
[0050] 乳膠微球的直徑一般為100-300皿，最佳地為150-200皿。
[0051] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的時間分辨英光乳膠微粒是具有發(fā)射波長在610-620nm的英光 乳膠微粒，W便于檢測。一種優(yōu)選的乳膠微粒是含銅系元素的英光乳膠微粒，較佳地，含有 館馨合物?？捎糜诒景l(fā)明的乳膠微球沒有特別限制，可W選用市售的或用常規(guī)方法制備的 乳膠微球。
[0052] 采用內(nèi)部含館的乳膠微粒，即結(jié)合館馨合物的英光微粒。該結(jié)合館馨合物的英光 微粒，在紫外光激發(fā)下，發(fā)出610-620nm的紅色英光，可W用來作為抗體標(biāo)記。
[0053] 英光微粒標(biāo)記抗體（抗體復(fù)合物）
[0054] 本發(fā)明中，經(jīng)英光乳膠微粒標(biāo)記的抗體為單/多克隆抗體。優(yōu)選的，所述英光乳膠 微粒經(jīng)氨基葡聚糖凝膠包裹。
[0055] 經(jīng)標(biāo)記后，抗體被偶聯(lián)于英光乳膠微粒。當(dāng)然，也可視為乳膠微粒被偶聯(lián)有抗體。
[0056] 較佳地，抗體共價偶聯(lián)于英光乳膠微粒。
[0057] 更佳地，將抗體偶聯(lián)于英光乳膠微粒是將抗體通過英光乳膠微粒表面活化的駿基 或輕基而共價偶聯(lián)于英光乳膠微粒。
[0058] 其中，所述英光乳膠微球的直徑為100-300皿，較佳地為150-200皿。
[0059] 另外，所述抗體與所述乳膠微粒的重量比例為為1:2?1:50,較佳地為1:5? 1:25。
[0060] 在一優(yōu)選例中，所述抗體與所述乳膠微粒的重量比例為1 ;8?12。
[0061] 免疫層析側(cè)流片（或試紙條、或試紙片）
[0062] 在本發(fā)明中，提供一種免疫層析試紙條。
[0063] -種優(yōu)選的試紙條是利用側(cè)流原理的免疫層析側(cè)流片或免疫層析試紙條。
[0064] 在本發(fā)明中，術(shù)語"測流片"、"試紙片"、"試紙條"、"試紙板"、"層析條"、"測試條" 具有相同的含義，可W互換使用。
[0065] 本發(fā)明優(yōu)選的免疫層析側(cè)流片（或測試條）的結(jié)構(gòu)如圖1所示，其中包括；樣品墊 1，結(jié)合墊2,檢測區(qū)(或檢測線)3,反應(yīng)膜4,對照區(qū)(或質(zhì)控區(qū)、對照線、質(zhì)控線)5,吸收墊6， 背襯7。
[0066] 背襯7的長度與測試條相同。
[0067] 樣品墊1位于測試條的一端，吸收墊6位于測試條的另一端。
[006引結(jié)合墊2位于樣品墊1和吸收墊6之間，在樣品墊1的近端和吸收墊6的遠端，臨 近樣品墊1。
[0069] 檢測區(qū)3 (也稱檢測線）位于結(jié)合墊2和吸收墊6之間，通常檢測區(qū)3設(shè)置在反應(yīng) 膜4上，通過所述反應(yīng)膜連接結(jié)合墊2和吸水墊6。優(yōu)選地，所述反應(yīng)膜4上還設(shè)置有質(zhì)控 區(qū)5 (也稱質(zhì)控線），質(zhì)控區(qū)5位于檢測區(qū)3和吸收墊6之間。
[0070] 測試條的制造方法，優(yōu)選地，分別將樣品墊1、結(jié)合墊2、反應(yīng)膜4、吸收墊6通過粘 合劑粘貼于背襯7上，即得所述測試條。
[0071] 在本發(fā)明中，所述測試條的各組成元件（或組件）可選用本領(lǐng)域已有的材料制成。
[0072] 背襯7可W用任何穩(wěn)定的、無孔的材料制成，其強度應(yīng)足W支承材料和粘于其上 的各組成元件。因為許多測定用水作為擴散介質(zhì)，因此背襯7較佳地是基本上不透水的。在 一個優(yōu)選例中，背襯7是用聚合物膜制成的，更佳地是用聚氯己帰膜制成的（如PVC膠板）。
[0073] 樣品墊1可用任何吸收性材料制成。可使用的材料例子包括；纖維素、硝酸纖維 素、己酸纖維素、玻璃纖維、尼龍、聚電解質(zhì)離子交換膜、丙帰共聚物/尼龍、和聚離諷。
[0074] 結(jié)合墊2或反應(yīng)膜4可W用任何材料制成，只要該材料有足夠孔隙度從而允許在 表面和內(nèi)部發(fā)生流體的毛細管作用。結(jié)合墊2或反應(yīng)膜4應(yīng)有足夠的孔隙度，從而允許涂 有抗體或抗原的顆粒移動。結(jié)合墊2或反應(yīng)膜4還可被含待檢測分析物的樣品中所用的液 體潤濕（例如，對于水性液體具有親水性，對于有機溶劑具有疏水性）。通過例如在美國專 利No. 4, 340, 482或No. 4, 618, 533中所述的方法（該些方法描述了將疏水表面轉(zhuǎn)變成親水 表面），可W改變其疏水性從而使其具有親水性W便用于水性液體?？捎糜谥圃旖Y(jié)合墊2或 反應(yīng)膜4的材料例子包括但不限于；聚脂膜、纖維素、硝酸纖維素、己酸纖維素、玻璃纖維、 尼龍、聚電解質(zhì)離子交換膜、丙帰共聚物/尼龍、和聚離諷（polyethersulfone)。在一個優(yōu) 選例中，結(jié)合墊2是用聚脂膜制成的，反應(yīng)膜4是用硝酸纖維素制成的。
[0075] 吸收墊6可W用任何能吸收作為樣品和緩沖液的液體的材料制成。吸收墊6的吸 收能力應(yīng)足夠大，W便吸收添加至測試條的液體。適用于吸收墊6的材料的例子包括纖維 素和吸水濾紙。
[0076] 為了便于理解本發(fā)明，給出本發(fā)明免疫層析測試條的檢測原理。應(yīng)理解，本發(fā)明的 保護范圍并不受該原理的影響或限制。
[0077] 如圖2所示，本發(fā)明采用競爭法免疫層析的原理，將小分子物質(zhì)的完全抗原固定 于硝酸纖維膜上的檢測區(qū)（固相抗原），如果樣本中不含有特定的小分子化合物，英光乳膠 標(biāo)記的小分子化合物抗體將沿反應(yīng)膜巧日硝酸纖維膜）向前流動，到達檢測線位置時，英光 乳膠標(biāo)記抗體被固定在反應(yīng)膜上的小分子與載體蛋白偶聯(lián)物捕獲，通過365nm紫外光的激 發(fā)，在檢測區(qū)T線位置形成紅色的615nm英光條帶。如果待檢樣品中含有一定濃度的小分子 物質(zhì)，將會抑制英光標(biāo)記抗體與固定抗原的結(jié)合，在硝酸纖維素膜的檢測區(qū)的英光條帶將 會減弱。英光條帶的強弱與待檢樣品中含有的小分子物質(zhì)的濃度呈一定的線性關(guān)系，通過 光電倍增管采集英光信號進行計數(shù)，從而計算出待檢樣品中含有的小分子物質(zhì)的濃度。本 發(fā)明在反應(yīng)膜巧日硝酸纖維膜）的質(zhì)控區(qū)設(shè)置羊抗鼠IgG多抗，無論待檢樣品中是否含有待 測小分子化合物，結(jié)合墊上預(yù)包被的英光乳膠標(biāo)記抗體總能與質(zhì)控區(qū)的羊抗鼠IgG多抗結(jié) 合形成一條英光質(zhì)控帶，該英光條帶是判定層析過程是否正常和檢測板是否失效的標(biāo)準(zhǔn)， 同時也作為定量分析中控制批間差的計算指標(biāo)。
[0078] 在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，通過使用稀±元素館馨合物包被的英光乳膠顆粒， 標(biāo)記小分子化合物的單克隆抗體形成抗體復(fù)合物，固定于結(jié)合墊上，在硝酸纖維膜上的檢 測區(qū)和質(zhì)控區(qū)，分別包被不同濃度的小分子化合物與載體蛋白偶聯(lián)物、羊抗鼠IgG，通過對 兩個區(qū)域的英光信號分別加W分析。獲得檢測物的定量指標(biāo)。
[0079] 檢測試劑盒和檢測方法
[0080] 本發(fā)明還提供了可用于檢測飲用水、飲料、全血、血漿、血清、尿液、汗液、巧液、唾 液等樣本中特定小分子化合物的檢測試劑盒。所述試劑盒包括：一容器，W及位于容器內(nèi)的 測試片和抗體復(fù)合物，所述抗體復(fù)合物為英光乳膠微粒標(biāo)記的小分子化合物抗體。
[0081] 其中，所述小分子化合物抗體采用含館的英光乳膠微粒標(biāo)記。優(yōu)選的，所述小分子 化合物抗體采用凝膠包裹的含館的英光乳膠微粒標(biāo)記。
[008引檢測裝置
[0083] 本發(fā)明的檢測裝置可W包括；測試條、檢測器、光源、光導(dǎo)纖維和計算機。還可W包 括一份檢測方法的使用說明。其中測試條的工作原理如上所述，任何可用于檢測英光強度 的時間分辨英光分析方法均可用于本發(fā)明的檢測裝置。
[0084] 本發(fā)明的主要優(yōu)點有：
[0085] (1)本發(fā)明提供了一種新型的測試片。
[0086] (2)本發(fā)明提供了一種采用上述測試片的檢測方法，解決了膠體金層析定量不準(zhǔn)， 普通英光層析檢測背景過高的缺點，顯著地提高了檢測的靈敏度和特異性，降低了假陽性 率。且所述方法快捷、簡便、成本低廉，定量準(zhǔn)確。
[0087] (3)本發(fā)明還提供了一種檢測裝置，所述裝置基于上述檢測方法，可廣泛用于定量 檢測領(lǐng)域。
[0088] 下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，該些實施例僅用于說明本 發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照 常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克??；實驗室手冊（New York:Cold Spring Harbor L油oratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否 則百分比和份數(shù)是重量百分比和重量份數(shù)。
[0089] 實施例1
[0090] 英光乳膠標(biāo)記氯胺麗抗體(抗體復(fù)合物）的制備
[0091] 取100 y 110%表面帶有活化駿基的館乳膠微球（200皿，購自美國Thermo Fisher 公司），加900 y 1 MES (0. 05M，p冊.1)洗涂，離也13000轉(zhuǎn)15分鐘，棄上清。加1ml標(biāo)記 液（0. 05M MES P冊.1,2. Omg/ml N-輕基玻巧醜亞胺畑S，和0. 5mg/ml邸C.肥1 (1-己 基-3- (3-二甲基氨丙基）-碳化二亞胺邸C))重息，超聲，室溫下反應(yīng)1小時。激活的乳 膠W 1300化pm離也15分鐘，棄上清。用ImlO. 05M MES buffer P冊.1重息。超聲后加入 氯胺麗抗體80yg/ml，混勻，在室溫下反應(yīng)2小時。標(biāo)記后的乳膠W 130(K)巧m離也15分 鐘，棄上清。加入ImlO. 05M MES buffer P冊.14%BSA封閉，超聲，在室溫下封閉2小時。封 閉完成后，離也130(K)巧m，15分鐘，棄上清。用稀釋液重息乳膠微粒。使用前超聲。
[009引 實施例2
[0093] 免疫層析檢測試劑板的制備
[0094] (1)結(jié)合墊對示記墊）的制備
[0095] 將實施例1制備的抗體復(fù)合物、鼠IgG與含0. 5%的表面活性劑Tetronic - 1037 (購自BASF)的抑為7. 4的lOmM磯酸鹽緩沖溶液混合，配制成0. 5mg/ml濃度的溶液，均勻 地涂布在玻璃纖維素紙或聚醋膜上，涂布量為50 y 1/cm2,真空干燥。制備得到結(jié)合墊。
[0096] (2)檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)
[0097] 檢測區(qū)（也稱為檢測線）；將氯胺麗小牛血清白蛋白（BSA)偶聯(lián)物溶于含10%藏糖 的0. 01M pH7. 3磯酸鹽緩沖液中，噴點在硝酸纖維反應(yīng)膜上，涂布量為lOy 1/cm2 ;然后在 15?35°C干燥20小時，制成檢測區(qū)；
[0098] 質(zhì)控區(qū)（也稱為對照線或?qū)φ諈^(qū)）；將羊抗鼠IgG溶于含10%藏糖的0. 01M pH7. 3 磯酸鹽緩沖液中，濃度為0. 8mg/ml。噴點在硝酸纖維膜上，涂布量為lOy l/cm2 ;然后在 15?35C干燥20小時，制成質(zhì)控區(qū)。
[009引 做樣品墊的制備
[0100] 樣品墊材質(zhì)為玻璃纖維紙或聚醋膜，用配制好的樣品墊處理液浸泡樣品墊，樣品 處理液的量為lOOul/cm 2,然后在37C下烘干，樣品墊處理液的組成為；抑為7. 4的lOmM磯 酸鹽緩沖溶液，含 0. 5%S9 (表面活性劑 Tetronic - 1037)，1%PVP，0. 2%邸TA 和 0. 5%BSA。
[0101] (4)測試條組裝
[0102] 用常規(guī)方法，將W下各組件按圖1所示組裝成檢測試劑條：
[0103] 1.樣品墊：經(jīng)樣品墊處理液浸泡處理
[0104] 2.結(jié)合墊；包被抗體復(fù)合物和鼠IgG的玻璃纖維紙
[0105] 3.檢測線：硝酸纖維素膜上包被氯胺麗小牛血清白蛋白（BSA)偶聯(lián)物
[0106] 4.反應(yīng)膜
[0107] 5.質(zhì)控線；硝酸纖維素膜上包被羊抗鼠IgG多抗
[010引 6.吸收墊（吸水濾紙）
[0109] 7.背襯（PVC)
[0110] 實施例3
[0111] 檢測
[011引 （1)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0113] 配制1. 0ml濃度為lOOOng/ml的氯胺麗的PBS溶液，取500 y 1用PBS進行倍比 稀釋獲得不同濃度的氯胺麗溶液，如下；l〇〇〇〇ng/ml，5000ng/ml，2500ng/ml，1250ng/ml， 625ng/ml，312. 5ng/ml，156ng/ml，78ng/ml，39ng/ml，Ong/ml。W PBS 為空白對照。取 200 y 1 樣品直接加至樣品墊上，在室溫下反應(yīng)5分鐘，再將檢測條插入檢測裝置進行檢測，分別獲 得檢測區(qū)T線和質(zhì)控區(qū)C線的英光值，計算T/C比值，結(jié)果如表1所示。
[0114] 表1英光檢測數(shù)據(jù) [011 引

【權(quán)利要求】
1. 一種測試條，包括樣品墊、結(jié)合墊、反應(yīng)膜、吸收墊、和背襯，其特征在于，所述反應(yīng)膜 上設(shè)置檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)，所述結(jié)合墊上包含抗體復(fù)合物，所述抗體復(fù)合物包含熒光乳膠微 粒以及小分子化合物抗體，所述小分子化合物抗體偶聯(lián)于所述熒光乳膠微粒。
2. 如權(quán)利要求1所述的測試條，其特征在于，所述小分子化合物的分子量為 l-10000Da。
3. 如權(quán)利要求1所述的測試條，其特征在于，所述熒光乳膠微粒為鑭系金屬和/或鑭系 金屬螯合物包被的乳膠微粒。
4. 如權(quán)利要求1所述的測試條，其特征在于，所述質(zhì)控區(qū)包含羊抗兔IgG或羊抗鼠 IgG。
5. 如權(quán)利要求1所述的測試條，其特征在于，所述檢測區(qū)包含小分子化合物與載體蛋 白的偶聯(lián)物。
6. -種檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括： (a) 測試條，所述測試條包括樣品墊、結(jié)合墊、檢測區(qū)、反應(yīng)膜、質(zhì)控區(qū)、吸收墊、和背 襯； (b) 抗體復(fù)合物，所述抗體復(fù)合物包含熒光乳膠微粒以及小分子化合物抗體，所述小分 子化合物抗體偶聯(lián)于所述熒光乳膠微粒；和 (c) 容器。
7. 如權(quán)利要求1所述的測試條的用途，其特征在于，用于制備檢測飲用水、飲料、全血、 血漿、血清、尿液、汗液、淚液或唾液中小分子化合物的試劑盒。
8. -種檢測小分子化合物的方法，其特征在于，包括步驟： (1) 將待測物樣品加至如權(quán)利要求1-5任一項所述的測試片的樣品墊； (2) 采用時間分辨熒光免疫層析方法測量所述測試片的檢測區(qū)的熒光強度及質(zhì)控區(qū)的 熒光強度，從而確定小分子化合物是否存在，或從而換算為小分子化合物的含量。
9. 如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，在步驟（2)中，將測試區(qū)的熒光強度與質(zhì)控 區(qū)的熒光強度的比值，和標(biāo)準(zhǔn)曲線進行比較，從而確定小分子化合物的含量。
10. -種定量檢測待測物的熒光測量裝置，其特征在于，所述的裝置包括： (a) 權(quán)利要求1所述的測試片；和 (b) 用于檢測熒光強度的檢測器。
【文檔編號】G01N33/577GK104422765SQ201310391061
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年8月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月30日
【發(fā)明者】胡小龍, 丁國榮 申請人:上海八通生物科技有限公司