用于調(diào)節(jié)nk細(xì)胞活性的組合物和方法【專利摘要】本發(fā)明涉及用于調(diào)節(jié)NK細(xì)胞活性的組合物和方法。本發(fā)明涉及一種特異性結(jié)合至KIR2DL1、KIR2DL2和/或KIR2DL3的抗體，包括：由氨基酸序列GFSFTPYGVH組成的重鏈CDR1，由氨基酸序列VIWSGGNTDYNAAFIS組成的重鏈CDR2，由氨基酸序列NPRPGNYPYGMDY組成的重鏈CDR3，由氨基酸序列KASENVVTYVS組成的輕鏈CDR1，由氨基酸序列GASNRYT組成的輕鏈CDR2，以及由氨基酸序列GQGYSYPYT組成的輕鏈CDR3。本發(fā)明還涉及包括這類抗體的藥物組合物和它們的應(yīng)用，尤其是在治療中的應(yīng)用，以增加在受治療者體內(nèi)的NK細(xì)胞活性或細(xì)胞毒性?！緦＠f(shuō)明】用于調(diào)節(jié)NK細(xì)胞活性的組合物和方法[0001]本發(fā)明是申請(qǐng)日2004年7月I日、標(biāo)題為“PAN-KIR2DLNK-受體的抗體及其在診斷及治療中的應(yīng)用”申請(qǐng)?zhí)?00480024006.7的分案申請(qǐng)?！?br>技術(shù)領(lǐng)域：
】[0002]本發(fā)明涉及抗體、抗體片段、及其衍生物，它們與存在于NK細(xì)胞的細(xì)胞表面上的兩種或更多種抑制性受體進(jìn)行交叉反應(yīng)并增強(qiáng)哺乳動(dòng)物受治療者中或生物樣品中的NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性。本發(fā)明還涉及制備這樣的抗體、片段、變異體、以及衍生物的方法；包括這樣的抗體、片段、變異體、以及衍生物的藥物組合物、以及這樣的分子和組合物的應(yīng)用，尤其在治療中，以增加受治療者的NK細(xì)胞活性或細(xì)胞毒性。【
背景技術(shù)：
】[0003]自然殺傷(NK)細(xì)胞是淋巴細(xì)胞的亞群，涉及非常規(guī)型免疫。NK細(xì)胞可以通過(guò)本領(lǐng)域熟知的各種技術(shù)獲得，如從血液樣品、細(xì)胞單采術(shù)、收集等。[0004]NK細(xì)胞的特性和生物性能包括:表達(dá)包括⑶16、⑶56、和/或⑶57的表面抗原；在細(xì)胞表面上缺少α/β或Y/STCR復(fù)合物；通過(guò)激活特異性細(xì)胞溶解酶以便結(jié)合于并殺傷未能表達(dá)“自體"MHC/HLA抗原的細(xì)胞的能力；殺傷表達(dá)NK活化受體-配體的腫瘤細(xì)胞或其它患病細(xì)胞的能力；釋放刺激或抑制免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子的能力；以及經(jīng)歷多回細(xì)胞分裂并產(chǎn)生和親代細(xì)胞具有類似的生物性能的子代細(xì)胞的能力。在本發(fā)明的上下文中，“活性”NK細(xì)胞是指生物活性NK細(xì)胞，更具體地說(shuō)，是指能夠溶解靶細(xì)胞的NK細(xì)胞。例如，“活性”NK細(xì)胞能夠殺傷表達(dá)NK活化受體-配體并未能表達(dá)“自體”MHC/HLA抗原(KIR-不相容細(xì)胞)的細(xì)胞。[0005]基于它們的生物性能，在本領(lǐng)域已經(jīng)提出各種依賴于NK細(xì)胞調(diào)節(jié)的治療和疫苗方案。然而，NK細(xì)胞活性是通過(guò)復(fù)雜的機(jī)制加以調(diào)節(jié)的，該機(jī)制涉及刺激性和抑制性信號(hào)。因此，有效的NK細(xì)胞介導(dǎo)治療可能需要刺激這些細(xì)胞以及中和抑制性信號(hào)。[0006]NK細(xì)胞通過(guò)主要組織相容性復(fù)合物(MHC)類型I特異抑制性受體進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié)(Karreetal.，1986;Ohlenetal.，1989)。這些特異性受體與其它細(xì)胞上存在的MHC類型I分子或HLA的多態(tài)決定簇相結(jié)合，并且抑制NK細(xì)胞溶解。在人類中，稱作殺傷Ig樣受體(KIR)的受體家族的一些成員可識(shí)別HLA類型I等位基因組。[0007]KIR是存在于淋巴細(xì)胞的一些子集的較大的受體家族，其包括NK細(xì)胞。用于KIRs的術(shù)語(yǔ)是基于細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的數(shù)目(KIR2D或KIR3D)以及細(xì)胞質(zhì)尾是否是較長(zhǎng)的(KIR2DL或KIR3DL)或較短的(KIR2DS或KIR3DS)。在人類中，單一個(gè)體所存在的NK群內(nèi)，存在或缺少一個(gè)給定的KIR從一個(gè)NK細(xì)胞到另一個(gè)NK細(xì)胞是不同的。在人類種群中，還存在相對(duì)較高水平的KIR分子的多態(tài)性，其中一些KIR分子存在于某些個(gè)體中，但不是存在于所有個(gè)體中。當(dāng)結(jié)合于適當(dāng)配體時(shí)，一些KIR基因產(chǎn)物會(huì)刺激淋巴細(xì)胞活性。已證實(shí)的刺激性KIR都具有較短的細(xì)胞質(zhì)尾，并具有帶電荷的跨膜殘基，它與具有免疫刺激基序(immunostimulatorymotif,ITAM)的適配子分子相關(guān)聯(lián)。其它KIR基因產(chǎn)物就性質(zhì)上來(lái)說(shuō)是抑制性的。所有證實(shí)的抑制性KIRs都具有較長(zhǎng)的細(xì)胞質(zhì)尾，并且似乎與取決于KIR亞型的HLA抗原的不同子集相互作用。抑制性KIRs在它們的胞質(zhì)內(nèi)部分呈現(xiàn)一種或幾種募集磷酸酶的抑制性基序。已知的抑制性KIR受體包括KIR2DL和KIR3DL亞家族的成員。具有兩個(gè)Ig結(jié)構(gòu)域的KIR受體(KIR2D)確定(鑒定)HLA-C同種異型:KIR2DL2(以前稱為p58.2)或緊密相關(guān)的基因產(chǎn)物KIR2DL3識(shí)別由組2HLA-C同種異型(Cwl、3、7、以及8)共有的抗原決定部位；而KIR2DL1(p58.1)識(shí)別由互補(bǔ)組IHLA-C同種異型(Cw2、4、5、以及6)共有的抗原決定部位。由KIR2DL1的識(shí)別取決于在HLA-C等位基因的第80位存在賴氨酸(Lys)殘基。KIR2DL2和KIR2DL3識(shí)別取決于在第80位存在天冬酰胺(Asn)殘基。重要的是，大多數(shù)HLA-C等位基因在第80位具有天冬酰胺或賴氨酸殘基。一個(gè)具有三個(gè)Ig結(jié)構(gòu)域的KIR，KIR3DL1(p70)，可識(shí)別由HLA-Bw4等位基因共有的抗原決定部位。最后，具有三個(gè)Ig結(jié)構(gòu)域的分子的同型二聚體KIR3DL2(pl40)可識(shí)別HLA-A3和HLA-A11。[0008]雖然抑制性KIRs和其它類型I抑制性受體(Morettaetal,1997;Valianteetal,1997a;Lanier,1998)可以由NK細(xì)胞共表達(dá)，但在任何給定個(gè)體的NK表達(dá)譜(repertoire)中都存在表達(dá)單一KIR的細(xì)胞，因而，相應(yīng)的NK細(xì)胞僅被表達(dá)特異性類型I等位基因組的細(xì)胞阻斷。[0009]KIR錯(cuò)配的NK細(xì)胞群或克隆，即，表達(dá)KIR(其不相容于宿主的HLA分子)的NK細(xì)胞群已表明是在異基因(同種異體)移植中看到的移植物抗白血病效應(yīng)的最有可能的介體(Ruggerietal.，2002)。在給定個(gè)體中再現(xiàn)這種效應(yīng)的一種方法是使用阻斷KIR/HLA相互作用的試劑。[0010]對(duì)于KIR2DL1特異的單克隆抗體已經(jīng)表明可以阻斷KIR2DL1與Cw4(或類似物)等位基因的相互作用(Morettaetal.，1993)。針對(duì)KIR2DL2/3的單克隆抗體也已有描述，其阻斷KIR2DL2/3與HLACw3(或類似物)等位基因的相互作用(Morettaetal.，1993)。然而，在臨床狀況下使用這樣的試劑將需要開發(fā)兩種治療性單克隆抗體(mAb)以治療所有患者，而不管任何給定患者是否表達(dá)類型I或類型2HLA-C等位基因。此外，人們?cè)跊Q定使用哪一種治療性抗體之前，必須預(yù)先確定每位患者正在表達(dá)哪一種HLA型，因而導(dǎo)致了高得多的治療成本。[0011]Watzletal.,TissueAntigens,56,p.240(2000)制備了識(shí)別KIR的多個(gè)同種型的交叉反應(yīng)抗體，但那些抗體并不呈現(xiàn)NK細(xì)胞活性的增強(qiáng)。G.M.Spaggiaraetal..Blood.100,pp.4098-4107(2002)利用多種針對(duì)各種KIR的單克隆抗體進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。據(jù)說(shuō)，那些抗體之一，NKVSF1，可以識(shí)別CD158a(KIR2DLA)、CD158b(KIR2DL2)以及p50.3(KIR2DS4)的共同抗原決定部位。它未提示NKVSFl可以增強(qiáng)NK細(xì)胞活性，并且也未提示它可以用作治療藥劑。因此，迄今在本領(lǐng)域還未獲得調(diào)節(jié)NK細(xì)胞活性的實(shí)用和有效的方案，因而仍然需要使用特異性試劑的HLA等位基因特異性干預(yù)。【
發(fā)明內(nèi)容】[0012]現(xiàn)在本發(fā)明提供了新穎的抗體、組合物、以及方法，它們可以克服目前在NK細(xì)胞激活中遇到的困難，并且提供另外的有利特點(diǎn)和益處。在一個(gè)典型方面，本發(fā)明提供了單一抗體，該抗體在幾乎所有人類中有助于人NK細(xì)胞的激活。更具體地說(shuō)，本發(fā)明提供了新穎的特異性抗體，這些抗體與各種抑制性KIR組進(jìn)行交叉反應(yīng)并中和它們的抑制性信號(hào)，從而導(dǎo)致在表達(dá)這樣的抑制性KIR受體的NK細(xì)胞中增強(qiáng)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性。與多種KIR基因產(chǎn)物進(jìn)行交叉反應(yīng)的能力使得本發(fā)明的抗體能夠有效地用來(lái)在大多數(shù)的人類受治療者中增加NK細(xì)胞活性,而沒有預(yù)先確定受治療者的HLA類型的負(fù)擔(dān)或費(fèi)用。[0013]在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了抗體、抗體片段、及其任何一種的衍生物，其中所述抗體、片段、或衍生物與在NK細(xì)胞表面上的至少兩種抑制性KIR受體進(jìn)行交叉反應(yīng)，中和NK細(xì)胞的抑制性信號(hào)，以及增強(qiáng)NK細(xì)胞的活性。更優(yōu)選地，該抗體與人KIR2DL受體的共同決定簇相結(jié)合。甚至更準(zhǔn)確地說(shuō)，本發(fā)明的抗體與至少KIR2DL1、KIR2DL2、以及KIR2DL3受體結(jié)合。對(duì)本發(fā)明目的而言，術(shù)語(yǔ)“KIR2DL2/3”是指KIR2DL2和KIR2DL3受體的任何一種或兩者。這兩種受體具有非常高的同源性，大概是相同基因的等位基因形式，并且在本【
技術(shù)領(lǐng)域：
】被認(rèn)為是可互換的。因此，對(duì)本發(fā)明目的而言，KIR2DL2/3被認(rèn)為是單一抑制性KIR分子，因此僅與KIR2DL2和KIR2DL3并且不與其它抑制性KIR受體進(jìn)行交叉反應(yīng)的抗體不在本發(fā)明的范圍內(nèi)。[0014]本發(fā)明的抗體特異性地抑制MHC或HLA分子與至少兩種抑制性KIR受體結(jié)合，并有助于NK細(xì)胞活性。如在本文中所使用的，兩種活性都是用術(shù)語(yǔ)“中和KIR的抑制性活性”來(lái)表示。在本發(fā)明的上下文中，本發(fā)明的抗體的下述能力，即“有助于NK細(xì)胞活性”、“有助于NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性”、“有助于NK細(xì)胞”、“增強(qiáng)NK細(xì)胞活性”、“增強(qiáng)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性”、或“增強(qiáng)NK細(xì)胞”，是指抗體允許NK細(xì)胞在其表面上表達(dá)抑制性KIR受體以便能夠溶解在其表面上表達(dá)特定抑制性KIR受體(例如，特定HLA抗原)的相應(yīng)配體的細(xì)胞。在一個(gè)特定方面，本發(fā)明提供了一種抗體，該抗體特異性地抑制HLA-C分子與KIR2DL1和KIR2DL2/3受體結(jié)合。在另一個(gè)特定方面，本發(fā)明提供了一種有助于體內(nèi)NK細(xì)胞活性的抗體。[0015]因?yàn)镵IR2DL1或KIR2DL2/3至少之一存在于至少約90%的人群中，所以本發(fā)明的更優(yōu)選的抗體能夠有助于針對(duì)大多數(shù)HLA-C同種異型相關(guān)細(xì)胞的NK細(xì)胞活性，分別為組IHLA-C同種異型和組2HLA-C同種異型的NK細(xì)胞活性。因而，本發(fā)明的組合物可以用來(lái)有效地激活或增強(qiáng)在大多數(shù)人類個(gè)體中(通常在約90%或更多的人類個(gè)體中)的NK細(xì)胞。因此，根據(jù)本發(fā)明的單一抗體組合物可以用來(lái)治療大多數(shù)的人類受治療者，并且很少需要確定等位基因組或使用抗體混合劑。[0016]本發(fā)明首次表明，可以產(chǎn)生針對(duì)抑制性KIR的交叉反應(yīng)以及中和抗體，并且這樣的抗體使得能夠在廣泛的人類族群的范圍內(nèi)有效激活NK細(xì)胞。[0017]因而本發(fā)明的一個(gè)特定目的涉及一種抗體，其中所述抗體特異性地與KIR2DL1和KIR2DL2/3人受體結(jié)合，并且逆轉(zhuǎn)由這些KIR介導(dǎo)的NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性的抑制作用。在一種【具體實(shí)施方式】中，該抗體與由雜交瘤DF200產(chǎn)生的單克隆抗體DF200進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)?？蛇x地，所述與抗體DF200競(jìng)爭(zhēng)的抗體不是抗體DF200本身。[0018]在另一種【具體實(shí)施方式】中，該抗體與單克隆抗體NKVSFl競(jìng)爭(zhēng)，可選地其中與抗體NKVSFl競(jìng)爭(zhēng)的抗體不是抗體NKVSFl。[0019]在另一種【具體實(shí)施方式】中，該抗體與抗體1-7F9競(jìng)爭(zhēng)。[0020]優(yōu)選地，所述抗體是嵌合抗體、人源化抗體、或人抗體。[0021]在針對(duì)特定單克隆抗體(例如，DF200、NKVSF1、1-7F9、EB6、GL183)時(shí)，術(shù)語(yǔ)“與其競(jìng)爭(zhēng)”是指在使用重組體KIR分子或表面表達(dá)的KIR分子的結(jié)合測(cè)定中，抗體與該單克隆抗體(例如，DF200、NKVSF1、1-7F9、EB6、GL183)相競(jìng)爭(zhēng)。例如，如果在結(jié)合測(cè)定中一抗體減少DF200與KIR分子的結(jié)合，那么該抗體與DF200“相競(jìng)爭(zhēng)”。和DF200“相競(jìng)爭(zhēng)”的抗體可以與DF200相競(jìng)爭(zhēng)，以便結(jié)合于KIR2DL1人受體、KIR2DL2/3人受體、或KIR2DL1及KIR2DL2/3人受體。[0022]在一優(yōu)選的【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明提供了一種抗體，該抗體結(jié)合KIR2DL1及KIR2DL2/3人受體，逆轉(zhuǎn)由這些KIR介導(dǎo)的NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性的抑制作用，并且與DF200、1-7F9、或NKVSFl競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合于KIR2DL1人受體、KIR2DL2/3人受體、或KIR2DL1和KIR2DL2/3人受體?？蛇x地，所述抗體不是NKVSFl。所述抗體可任選為嵌合抗體、人抗體、或人源化抗體。[0023]在另一種【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明提供了一種抗體，該抗體與KIR2DL1及KIR2DL2/3人受體結(jié)合，逆轉(zhuǎn)由這些KIR介導(dǎo)的NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性的抑制，并且與EB6競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合于KIR2DL1人受體，與GL183競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合于KIR2DL2/3人受體，或與EB6競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合于KIR2DL1人受體以及與GL183競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合于KIR2DL2/3人受體?？蛇x地，所述抗體不是NKVSFl;可選地,所述抗體不是DF200。所述抗體可任選為嵌合抗體、人抗體、或人源化抗體。[0024]在一有利的方面，本發(fā)明提供了一種抗體，該抗體與DF200競(jìng)爭(zhēng)并且對(duì)與單克隆抗體DF200實(shí)質(zhì)上或本質(zhì)上相同、或完全相同的在KIR分子上的抗原決定部分或“抗原決定位點(diǎn)”進(jìn)行識(shí)別、相結(jié)合或具有免疫特異性。優(yōu)選地，所述KIR分子是KIR2DL1人受體或KIR2DL2/3人受體。[0025]本發(fā)明的一個(gè)特定目的涉及一種抗體，其中所述抗體與存在于KIR2DL1及KIR2DL2/3人受體中的共同決定簇結(jié)合，并逆轉(zhuǎn)由這些KIR介導(dǎo)的NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性的抑制作用。該抗體更特異性地結(jié)合在KIR的抗原決定部位上，它與單克隆抗體DF200(由雜交瘤DF200產(chǎn)生)或抗體NKVSFl(由雜交瘤NKVSFl產(chǎn)生)實(shí)質(zhì)上相同，其中該抗體不是NKVSFl。[0026]在一優(yōu)選的【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明的抗體是單克隆抗體。本發(fā)明的最優(yōu)選的抗體是由雜交瘤DF200產(chǎn)生的單克隆抗體DF200。[0027]產(chǎn)生抗體DF200的雜交瘤已保藏在CNCM培養(yǎng)物保藏中心(CNCMculturecollection)，識(shí)別號(hào)(Identificationn0.)為“DF200”，登記號(hào)為CNCM1-3224，于2004年6月10日登記，CollectionNationaledeCulturesdeMicroorganismes,InstitutPasteur,25,RueduDocteurRoux,F-75724ParisCedexl5,France。抗體NKVSFl可獲自Serotec(CergySainte-Christophe,France),目錄參考號(hào)MCA2243。在本文中NKVSFl還稱作pan2D單克隆抗體(pan2DmAb)。[0028]本發(fā)明還提供了本文中所描述的抗體的功能性片段和衍生物，其具有實(shí)質(zhì)上類似的抗原特異性和活性(例如，其可以與親代抗體進(jìn)行交叉反應(yīng)并且其增強(qiáng)表達(dá)抑制性KIR受體的NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性)，包括但不限于Fab片段、Fab’2片段、免疫粘附素、雙功能抗體(diabody)、⑶R、以及ScFv。而且,本發(fā)明的抗體可以是人源化抗體、人抗體、或嵌合抗體。[0029]本發(fā)明還提供了包括本發(fā)明抗體的抗體衍生物，其共軛或共價(jià)結(jié)合于毒素、放射性核素、可檢測(cè)部分(detectablemoiety)(例如,突光體)、或固相支撐體。[0030]本發(fā)明還提供了藥物組合物，這些組合物包括如上所披露的抗體、其片段、或抗體或其片段的衍生物。因此，本發(fā)明還涉及如在本文中所披露的抗體在制藥方法中的應(yīng)用。在優(yōu)選的【具體實(shí)施方式】中，所述藥劑或藥物組合物是用于治療癌癥或其它增生性病癥、感染，或用于移植。[0031]在另一【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明提供一種組合物，包括與至少兩個(gè)不同的人抑制性KIR受體基因產(chǎn)物相結(jié)合的抗體，其中所述抗體在表達(dá)至少所述兩個(gè)不同的人抑制性KIR受體之一的NK細(xì)胞上能夠中和KIR-介導(dǎo)的NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性的抑制作用，其中所述抗體被結(jié)合到脂質(zhì)體之中?？蛇x地，所述組合物包括一種另外的物質(zhì)，該物質(zhì)選自:遞送用于基因治療的基因核酸分子；遞送用于抑制NK細(xì)胞中的基因的反義RNA、RNA1、或siRNA的核酸分子；或用于靶向殺傷另外被結(jié)合到所述脂質(zhì)體之中的NK細(xì)胞的毒素或藥物。[0032]本發(fā)明還提供了在體外、活體外、或體內(nèi)調(diào)節(jié)人NK細(xì)胞活性的方法，包括用有效量的本發(fā)明的抗體、這樣的抗體的片段、其任何一種的衍生物、或包括至少任何上述之一的藥物組合物與人NK細(xì)胞相接觸。優(yōu)選的方法包括給予有效量的本發(fā)明的藥物組合物，最優(yōu)選的是在活體外或體內(nèi)，并且目的在于在受治療者體內(nèi)增加人NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，其中所述受治療者患有癌癥、傳染性疾病、或免疫性疾病。[0033]在另外的方面，本發(fā)明提供了一種雜交瘤，包括:(a)來(lái)自哺乳動(dòng)物宿主(通常為非人哺乳動(dòng)物宿主)的B細(xì)胞，其已用一種包括存在于抑制性KIR多肽上的抗原決定部位的抗原加以免疫，融合到(b)永生化(終生獲得免疫)細(xì)胞(例如，骨髓瘤細(xì)胞)，其中所述雜交瘤產(chǎn)生單克隆抗體，其結(jié)合至少兩種不同的人抑制性KIR受體，并且在表達(dá)所述至少兩種不同的人抑制性KIR受體的NK細(xì)胞種群中至少實(shí)質(zhì)上能夠中和KIR介導(dǎo)的NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性的抑制作用?？蛇x地，所述雜交瘤并不產(chǎn)生單克隆抗體NKVSFl。優(yōu)選地，所述抗體結(jié)合KIR2DL1及KIR2DL2/3受體。優(yōu)選地，所述抗體與存在于KIR2DL1及KIR2DL2/3上的共同決定簇相結(jié)合。優(yōu)選地，所述雜交瘤產(chǎn)生一種抑制在第80位具有賴氨酸(Lys)殘基的HLA-c等位基因分子與人KIR2DL1受體結(jié)合，以及抑制在第80位具有天冬酰胺(Asn)殘基的HLA-C等位基因分子與人KIR2DL2/3受體結(jié)合的抗體。優(yōu)選地，所述雜交瘤產(chǎn)生一種與由雜交瘤DF200產(chǎn)生的單克隆抗體DF200實(shí)質(zhì)上相同的抗原決定部位結(jié)合的、抗原決定部位在KIR2DL1上或在KIR2DL2/3上、或在KIR2DL1和KIR2DL2/3二者上的抗體。這樣的雜交瘤的一個(gè)實(shí)例是DF200。[0034]本發(fā)明還提供了產(chǎn)生抗體的方法，該抗體與多種KIR2DL基因產(chǎn)物進(jìn)行交叉反應(yīng)，并且中和這樣的KIR的抑制活性，所述方法包括以下步驟:[0035]Ca)用包括KIR2DL多肽的免疫原免疫非人哺乳動(dòng)物；[0036](b)由所述經(jīng)免疫的哺乳動(dòng)物制備抗體，其中所述抗體與所述KIR2DL多肽結(jié)合，[0037](c)選擇(b)的與至少兩種不同的KIR2DL基因產(chǎn)物進(jìn)行交叉反應(yīng)的抗體，以及[0038](d)選擇(C)的增強(qiáng)NK細(xì)胞的抗體。在一【具體實(shí)施方式】中，所述非人哺乳動(dòng)物是一種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其經(jīng)基因工程化來(lái)表達(dá)人抗體表達(dá)譜(例如，包括人免疫球蛋白基因座和天然免疫球蛋白基因缺失的非人哺乳動(dòng)物，如Xenomouse?(Abgenix-Fremont,CA,USA),或包括人Ig-編碼基因的小基因座的非人哺乳動(dòng)物，如HuMab-mouse?(Medarex-Princeton,NJ,USA))?？蛇x地，該方法進(jìn)一步包括選擇一種抗體，該抗體與靈長(zhǎng)類，優(yōu)選為食蟹猴，的NK細(xì)胞或KIR多肽結(jié)合?？蛇x地，本發(fā)明進(jìn)一步包括評(píng)估抗體的方法，其中將根據(jù)上述方法制備的抗體給予靈長(zhǎng)類，優(yōu)選為食蟹猴，優(yōu)選其中食蟹猴是用來(lái)觀察存在或缺少抗體毒性的指征。[0039]本發(fā)明還提供了一種制備與至少兩種不同的人抑制性KIR受體基因產(chǎn)物相結(jié)合的抗體的方法，其中所述抗體在表達(dá)所述至少兩種不同的人抑制性KIR受體基因產(chǎn)物的NK細(xì)胞種群中能夠中和KIR-介導(dǎo)的NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性的抑制作用，所述方法包括以下步驟:[0040]a)用包括抑制性KIR多肽的免疫原免疫非人哺乳動(dòng)物；[0041]b)由所述經(jīng)免疫的動(dòng)物制備抗體，其中所述抗體結(jié)合所述KIR多肽，[0042]c)選擇(b)的與至少兩種不同的人抑制性KIR受體基因產(chǎn)物進(jìn)行交叉反應(yīng)的抗體，以及[0043]d)選擇(C)的能夠?qū)Ρ磉_(dá)所述至少兩種不同的人抑制性KIR受體基因產(chǎn)物的NK細(xì)胞種群中和KIR-介導(dǎo)的NK細(xì)胞的細(xì)胞毒抑制作用的抗體，其中步驟(C)和(d)的次序可隨意顛倒并且任何數(shù)目的步驟可隨意重復(fù)I次或多次。優(yōu)選地，用于免疫作用的抑制性KIR多肽是KIR2DL多肽，并且在步驟(c)中選擇的抗體與至少KIR2DL1和KIR2DL2/3進(jìn)行交叉反應(yīng)。優(yōu)選地，所述抗體識(shí)別存在于至少兩種不同的KIR受體基因產(chǎn)物上的共同決定簇；最優(yōu)選地，所述KIR是KIR2DL1和KIR2DL2/3。可選地，所述方法進(jìn)一步包括選擇一種與靈長(zhǎng)類，優(yōu)選為食蟹猴，的NK細(xì)胞或KIR多肽結(jié)合的抗體?？蛇x地，本發(fā)明進(jìn)一步包括評(píng)估抗體的方法，其中將根據(jù)上述方法制備的抗體給予靈長(zhǎng)類，優(yōu)選為食蟹猴，優(yōu)選其中食蟹猴是用來(lái)觀察存在或缺少抗體毒性的指征。[0044]可選地，在上述方法中，在步驟c)或d)中選擇的抗體不是NKVSFl。優(yōu)選地，在上述方法的步驟(b)中制備的抗體是單克隆抗體。優(yōu)選地，在上述方法的步驟(C)中選擇的抗體可抑制在第80位具有賴氨酸殘基的HLA-C等位基因分子與人KIR2DL1受體的結(jié)合、以及在第80位具有天冬酰胺殘基的HLA-C等位基因分子與人KIR2DL2/3受體的結(jié)合。優(yōu)選地，在上述方法的步驟(d)中選擇的抗體可增強(qiáng)NK細(xì)胞毒性，例如，任何顯著的增強(qiáng)，或至少增強(qiáng)5%、10%、20%、30%或更大的NK細(xì)胞毒性，例如，至少增強(qiáng)約50%的靶NK細(xì)胞毒性(例如，增強(qiáng)至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、或至少約95%(如約65-100%)的NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性)。優(yōu)選地，該抗體與在KIR2DL1和/或KIR2DL2/3上的單克隆抗體實(shí)質(zhì)上相同的抗原決定部位結(jié)合。優(yōu)選地，所述方法還包括或可替換地包括另外的步驟:制備選定單克隆抗體的片段，制備選定單克隆抗體的衍生物(例如，通過(guò)與放射性核素、細(xì)胞毒制劑、報(bào)道分子(reportermolecule)、或類似物的共軛結(jié)合),或制備抗體片段的衍生物，其中抗體片段產(chǎn)生自或包括與這些單克隆抗體的序列相對(duì)應(yīng)的序列。[0045]本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種制備抗體的方法，該抗體與至少兩種不同的人抑制性KIR受體基因產(chǎn)物相結(jié)合，其中所述抗體在表達(dá)所述至少兩種不同的人抑制性KIR受體基因產(chǎn)物的NK細(xì)胞種群中能夠中和KIR-介導(dǎo)的NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性的抑制作用，所述方法包括以下步驟:[0046](a)從文庫(kù)或表達(dá)譜中選擇與至少兩種不同的人抑制性KIR2DL受體基因產(chǎn)物進(jìn)行交叉反應(yīng)的單克隆抗體或抗體片段，以及[0047](b)選擇(a)的能夠在表達(dá)所述至少兩種不同的人抑制性KIR2DL受體基因產(chǎn)物的NK細(xì)胞種群中中和KIR-介導(dǎo)的NK細(xì)胞的細(xì)胞毒抑制作用的抗體。優(yōu)選地，該抗體與存在于KIR2DL1和KIR2DL2/3上的共同決定簇結(jié)合。可選地，在步驟(b)中選擇的所述抗體不是NKVSFl。優(yōu)選地，在步驟(b)中選擇的抗體可抑制在第80位具有賴氨酸殘基的HLA-c等位基因分子與人KIR2DL1受體的結(jié)合、以及在第80位具有天冬酰胺殘基的HLA-C等位基因分子與人KIR2DL2/3受體的結(jié)合。優(yōu)選地，在步驟(b)中選擇的抗體可增強(qiáng)NK細(xì)胞毒性，例如，任何顯著的增強(qiáng)，或增強(qiáng)至少5%、10%、20%、30%或更大的NK細(xì)胞毒性，例如，增強(qiáng)至少約50%的靶NK細(xì)胞毒性(例如，增強(qiáng)至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、或至少約95%(如約65-100%)的NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性)。優(yōu)選地，該抗體結(jié)合于與在KIR2DL1和/或KIR2DL2/3上的單克隆抗體DF200實(shí)質(zhì)上相同的抗原決定部位?？蛇x地，該方法包括另外的步驟:制備選定單克隆抗體的片段，制備選定單克隆抗體的衍生物，或制備選定單克隆抗體片段的衍生物。[0048]另外，本發(fā)明提供了一種制備與至少兩種不同的人抑制性KIR受體基因產(chǎn)物相結(jié)合的抗體的方法，其中所述抗體在表達(dá)所述至少兩種不同的人抑制性KIR受體基因產(chǎn)物的NK細(xì)胞種群中能夠中和KIR-介導(dǎo)的NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性的抑制作用，所述方法包括以下步驟:[0049]a)在容許產(chǎn)生所述單克隆抗體的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的雜交瘤；以及[0050]b)由所述雜交瘤分離所述單克隆抗體?？蛇x地，該方法包括另外的步驟:制備所述單克隆抗體的片段，制備單克隆抗體的衍生物，或制備這樣的單克隆抗體片段的衍生物。優(yōu)選地，該抗體與存在于KIR2DL1和KIR2DL2/3上的共同決定簇結(jié)合。[0051]本發(fā)明還提供了制備抗體的方法，該抗體與至少兩種不同的人抑制性KIR受體基因產(chǎn)物相結(jié)合，其中所述抗體在表達(dá)所述至少兩種不同的人抑制性KIR受體基因產(chǎn)物的NK細(xì)胞種群中能夠中和KIR-介導(dǎo)的NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性的抑制作用，所述方法包括以下步驟:[0052]a)由本發(fā)明的雜交瘤分離對(duì)所述單克隆抗體進(jìn)行編碼的核酸；[0053]b)任選對(duì)所述核酸進(jìn)行的修飾以便獲得一個(gè)經(jīng)修飾的核酸，它包括一個(gè)序列對(duì)經(jīng)修飾的或衍生的抗體進(jìn)行編碼，該抗體包括對(duì)應(yīng)于單克隆抗體的功能序列或?qū)嵸|(zhì)上與其類似的氨基酸序列(例如，至少約65%、至少約75%、至少約85%、至少約90、至少約96%(如約70-99%)與這樣的序列相同)，選自人源化抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、抗體的免疫反應(yīng)片段、或包括這樣的免疫反應(yīng)片段的融合蛋白；[0054]c)將所述核酸或修飾的核酸(或相關(guān)的為相同的氨基酸序列編碼的核酸)插入表達(dá)載體中，其中，當(dāng)所述表達(dá)載體存在于在適宜條件下生長(zhǎng)的宿主細(xì)胞中時(shí)，所述編碼的抗體或抗體片段能夠被表達(dá)；[0055]d)用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞并不用其它方法產(chǎn)生免疫球蛋白；[0056]e)在引起所述抗體或抗體片段表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述經(jīng)轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞；以及[0057]f)分離由所述經(jīng)轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞產(chǎn)生的抗體或抗體片段。優(yōu)選地，該抗體與存在于KIR2DL1和KIR2DL2/3上的共同決定簇結(jié)合。[0058]應(yīng)當(dāng)明了，本發(fā)明還提供了一種組合物，該組合物包括一種與至少兩種不同的人抑制性KIR受體基因產(chǎn)物相結(jié)合的抗體，其中所述抗體在表達(dá)所述至少所述兩種不同的人抑制性KIR受體之一的NK細(xì)胞中能夠中和KIR-介導(dǎo)的NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性的抑制作用，所述抗體存在有效量以可檢測(cè)地增強(qiáng)患者的或包括NK細(xì)胞的生物樣品的NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性；以及一種可藥用的載體或賦形劑。優(yōu)選地，該抗體與存在于KIR2DL1和KIR2DL2/3上的共同決定簇相結(jié)合。所述組合物可任選進(jìn)一步包括第二治療藥劑，其選自，例如，免疫調(diào)節(jié)劑、激素藥物、化療藥物、抗血管形成劑、凋亡劑、結(jié)合于并抑制抑制性KIR受體的第二抗體、抗感染藥、靶向劑、或附加化合物。有利的免疫調(diào)節(jié)劑可以選自白介素-1α、白介素-1β、白介素-2、白介素_3、白介素-4、白介素-5、白介素_6、白介素-7、白介素-8、白介素-9、白介素-10、白介素-11、白介素-12、白介素-13、白介素-15、白介素-21、TGF_3、GM-CSF,M-CSF,G-CSF,TNF-α、TNF-β、LAF,TCGF,BCGF,TRF、BAF、BDG、ΜΡ、LIF、OSM、TMF、PDGF,α-干擾素、干擾素、或Y-干擾素。[0059]所述化療藥物的實(shí)例包括烷化劑、抗代謝藥、細(xì)胞毒抗生素、阿霉素、更生霉素、絲裂霉素、洋紅霉素(去甲柔紅霉素)、道諾霉素、多柔比星(多索魯比辛)、他莫昔芬、紫杉酚(泰素)、泰索帝、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春瑞賓、依托泊苷(VP-16)、5-氟尿嘧啶(5FU)、阿糖胞苷、環(huán)磷酰胺、噻替派、甲氨蝶呤、喜樹堿、放線菌素D、絲裂霉素C、順鉬(CDDP)、氨基蝶呤、康布瑞塔卡汀(考布他汀)、其它長(zhǎng)春花生物堿、以及其衍生物或前藥。激素藥物的實(shí)例包括亮丙瑞林、戈舍瑞林、曲普瑞林、布舍瑞林、他莫昔芬、托瑞米芬、氟他胺、尼魯?shù)仄?、環(huán)丙孕酮、比卡魯胺、阿那曲唑、依西美坦、來(lái)曲唑、法倔唑、甲羥孕酮(medroxy)、氯地孕酮、甲地孕酮、其它LHRH促效劑、其它抗雌激素藥、其它抗雄激素藥、其它芳香酶抑制劑、以及其它孕激素。優(yōu)選地，所述結(jié)合于并抑制抑制性KIR受體的第二抗體是抗體或抗體的衍生物或片段，其結(jié)合于不同于由所述抗體結(jié)合的抗原決定部位的抑制性KIR受體的抗原決定部位，其中所述抗體與存在于至少兩種不同的人抑制性KIR受體基因產(chǎn)物上的共同決定簇相結(jié)[0060]本發(fā)明進(jìn)一步提供了在有需要的患者體內(nèi)可檢測(cè)地增強(qiáng)NK細(xì)胞活性的方法，包括將根據(jù)本發(fā)明的組合物給予所述患者的步驟。需要增強(qiáng)NK細(xì)胞活性的患者可以是患有病癥或障礙的任何患者，其中這樣的增強(qiáng)可以有助于、增強(qiáng)、和/或誘導(dǎo)治療效應(yīng)(或在至少相當(dāng)大比例的患有病癥或障礙以及和患者有實(shí)質(zhì)上類似特性的患者中有助于、增強(qiáng)、和/或誘導(dǎo)這樣的效應(yīng)，如可以由例如臨床試驗(yàn)所確定的效應(yīng))。需要這樣的治療的患者可以患有，例如癌癥、另一種增生性病癥、傳染性疾病或免疫障礙。優(yōu)選地，所述方法包括將適宜的另外的治療藥劑給予所述患者的另外步驟，其中另外的治療藥劑選自免疫調(diào)節(jié)劑、激素藥物、化療藥物、抗血管形成劑、凋亡劑、結(jié)合于并抑制抑制性KIR受體的第二抗體、抗感染藥、靶向劑、或附加化合物，其中所述另外的治療藥劑作為連同所述抗體的單劑型或作為分開的劑型給予所述患者?？贵w(或抗體片段/衍生物)的劑量和另外的治療藥劑的劑量共同以足以可檢測(cè)地誘導(dǎo)、幫助、和/或增強(qiáng)患者的包括增強(qiáng)NK細(xì)胞活性的治療反應(yīng)。在分開給藥的情況下，最好是在對(duì)患者產(chǎn)生可檢測(cè)地結(jié)合治療益處的條件下(例如，關(guān)于時(shí)間、劑量次數(shù)等)給予抗體、片段、或衍生物以及另外的治療藥劑。[0061]另外，本發(fā)明包括本發(fā)明的能夠特異性地結(jié)合非人靈長(zhǎng)類，優(yōu)選為猴，的NK細(xì)胞和/或猴KIR受體的抗體。還包括用于評(píng)估本發(fā)明的抗體的毒性、劑量和/或活性或效力的方法，其中本發(fā)明的抗體是候選藥劑。在一個(gè)方面，本發(fā)明包括一種用于通過(guò)將本發(fā)明的抗體給予具有NK細(xì)胞的非人靈長(zhǎng)類受體動(dòng)物來(lái)確定對(duì)動(dòng)物或靶組織有毒的抗體劑量，以及用于評(píng)估藥劑對(duì)動(dòng)物、或優(yōu)選對(duì)靶組織的任何毒性反應(yīng)或有害效應(yīng)或有害反應(yīng)的方法。在另一個(gè)方面，本發(fā)明是一種用于通過(guò)將本發(fā)明的抗體給予具有NK細(xì)胞的非人靈長(zhǎng)類受體動(dòng)物來(lái)鑒定對(duì)動(dòng)物或祀組織有毒的抗體，以及用于評(píng)估藥劑對(duì)動(dòng)物、或優(yōu)選對(duì)祀組織的任何毒性反應(yīng)或有害效應(yīng)或有害反應(yīng)的方法。在另一個(gè)方面，本發(fā)明是一種用于通過(guò)將本發(fā)明的抗體給予感染的、患病的或癌癥的非人靈長(zhǎng)類模型來(lái)鑒定可有效治療感染、疾病或腫瘤的抗體，以及用于鑒定可改善感染、疾病或癌癥、或其癥狀的抗體的方法。優(yōu)選地，本發(fā)明的所述抗體是一種(a)與在人NK細(xì)胞表面上的至少兩種抑制性人KIR受體進(jìn)行交叉反應(yīng)，以及(b)與非人靈長(zhǎng)類的NK細(xì)胞或KIR受體進(jìn)行交叉反應(yīng)的抗體。[0062]另外，本發(fā)明包括在生物樣品或活生物體中檢測(cè)在它們的細(xì)胞表面上帶有抑制性KIR的NK細(xì)胞存在的方法，所述方法包括以下步驟:[0063]a)用本發(fā)明的抗體與所述生物樣品或活生物體接觸，其中所述抗體是共軛或共價(jià)結(jié)合于可檢測(cè)的部分；以及[0064]b)在所述生物樣品或活生物體中檢測(cè)所述抗體的存在。[0065]本發(fā)明還提供了由在它們的細(xì)胞表面上帶有抑制性KIR的樣品NK細(xì)胞進(jìn)行純化的方法，該方法包括以下步驟:[0066]a)在使得在它們的細(xì)胞表面上帶有抑制性KIR的所述NK細(xì)胞能夠結(jié)合于所述抗體的條件下，用本發(fā)明的抗體與所述樣品接觸，其中所述抗體是共軛或共價(jià)結(jié)合于固相支撐體(例如，珠、基質(zhì)等)；以及[0067]b)自所述共軛或共價(jià)結(jié)合于固相支撐體的抗體上洗脫所述結(jié)合的NK細(xì)胞。[0068]在一另外的方面，本發(fā)明提供了如圖12所示的包括抗體DF200或抗體Pan2D的輕可變區(qū)或一個(gè)或多個(gè)輕可變區(qū)CDR的抗體、抗體片段、或其任何一種的衍生物。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包括一種高度類似于所有或?qū)嵸|(zhì)上所有的DF200或Pan2D的輕可變區(qū)序列或一種或兩種這些抗體的一個(gè)或多個(gè)輕可變區(qū)CDR的序列的抗體、抗體片段、或其任何一種的衍生物。[0069]在一另外的方面，本發(fā)明提供了如圖13所示的包括抗體DF200的重可變區(qū)或一個(gè)或多個(gè)重可變區(qū)CDR的抗體、抗體片段、或其任何一種的衍生物。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供了抗體、抗體片段、或其任何一種的衍生物，它們包括一種序列高度類似于所有的或?qū)嵸|(zhì)上所有的DF200的重可變區(qū)的序列。[0070]本發(fā)明的這些和另外的有利方面和特點(diǎn)可以進(jìn)一步在本文的其它地方加以描述。[0071]保藏說(shuō)明[0072]產(chǎn)生抗體DF200的雜交瘤已保藏在CNCM培養(yǎng)物保藏中心(CNCMculturecollection)，識(shí)別號(hào)(Identificationn0.)為“DF200”，登記號(hào)為CNCM1-3224，于2004年6月10日登記，CollectionNationaledeCulturesdeMicroorganismes,InstitutPasteur,25,RueduDocteurRoux,F-75724ParisCedexl5,France?？贵wNKVSFl可獲自Serotec(CergySainte-Christophe,France),目錄參考號(hào)MCA2243。在本文中NKVSFl還稱作pan2D單克隆抗體(pan2DmAb)?！緦＠綀D】【附圖說(shuō)明】[0073]圖1示出結(jié)合于各種人KIR2DL受體的共同決定簇的單克隆抗體DF200。[0074]圖2示出單克隆抗體DF200在Cw4陽(yáng)性(正)靶細(xì)胞上中和KIR2DL-介導(dǎo)的KIR2DL1陽(yáng)性NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性的抑制作用。[0075]圖3示出單克隆抗體DF200、DF200的Fab片段以及KIR2DL1或KIR2DL2/3特異的常規(guī)抗體在Cw4陽(yáng)性靶細(xì)胞上中和KIR2DL-介導(dǎo)的KIR2DL1陽(yáng)性NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性的抑制作用，以及在Cw3陽(yáng)性靶細(xì)胞上中和KIR2DL-介導(dǎo)的KIR2DL2/3陽(yáng)性NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性的抑制作用。[0076]圖4示出在有DF200和EB6抗體的F(ab’)2片段存在的情況下，通過(guò)HLACw4陽(yáng)性靶細(xì)胞的NK克隆對(duì)細(xì)胞溶解的重構(gòu)(重建)。[0077]圖5和圖6示出單克隆抗體DF200、NKVSFl(pan2D)、人抗體1-7F9、1-4F1、1-6F5和1-6F1、以及KIR2DL1或KIR2DL2/3特異常規(guī)抗體在Cw4陽(yáng)性靶細(xì)胞(圖5中的Cw4轉(zhuǎn)染細(xì)胞以及圖6中的EBV細(xì)胞)上中和KIR2DL-介導(dǎo)的KIR2DL1陽(yáng)性NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性的抑制作用。[0078]圖7示出抗原決定部位圖，其顯示了通過(guò)表面等離子共振(BIAcore?)分析獲得的抗-KIR抗體對(duì)于KIR2DL1的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，其中重疊圓表示結(jié)合于KIR2DL1的重疊。結(jié)果表明:1_7F9與EB6和1-4F1、但不與NKVSFl和DF200在KIR2DL1上競(jìng)爭(zhēng)。抗體1-4F1依次與EB6、DF200、NKVSFl、以及1-7F9競(jìng)爭(zhēng)?？贵wNKVSFl與DF200、1-4F1、以及EB6，但不與1-7F9在KIR2DL1上競(jìng)爭(zhēng)。DF200與NKVSF1、1-4F1、以及EB6，但不與1-7F9在KIR2DL1上競(jìng)爭(zhēng)。[0079]圖8示出抗原決定部位圖，其顯示了通過(guò)BIAcore⑧:分析獲得的抗-KIR抗體對(duì)于KIR2DL3的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，其中重疊圓表示結(jié)合于KIR2DL3的重疊。結(jié)果表明:1-4F1與NKVSFl、DF200、gl183、以及1-7F9在KIR2DL3上競(jìng)爭(zhēng)。1-7F9與DF200、gll83、以及1-4F1，但不與NKVSFl在KIR2DL3上競(jìng)爭(zhēng)。NKVSFl與DF200、1-4F1、以及GL183，但不與1-7F9在KIR2DL3上競(jìng)爭(zhēng)。DF200與NKVSFlU-4FK以及1-7F9，但不與GL183在KIR2DL3上競(jìng)爭(zhēng)。[0080]圖9示出抗原決定部位圖，其顯示了通過(guò)BIAcore?分析獲得的抗-KIR抗體對(duì)于KIR2DS1的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，其中重疊圓表示結(jié)合于KIR2DS1的重疊。結(jié)果表明，抗體1-4F1與NKVSFl、DF200、以及1-7F9在KIR2DS1上競(jìng)爭(zhēng)?？贵w1-7F9與1-4F1，但不與DF200和NKVSFl在KIR2DS1上競(jìng)爭(zhēng)。NKVSFl與DF200以及1-4F1，但不與1-7F9在KIR2DS1上競(jìng)爭(zhēng)。DF200與NKVSFl以及1-4F1，但不與1-7F9在KIR2DS1上競(jìng)爭(zhēng)。[0081]圖10示出NKVSFl(pan2D)單克隆抗體(mAb)滴定，其表明該單克隆抗體(mAb)結(jié)合于食蟹猴NK細(xì)胞。食蟹猴NK細(xì)胞(NK主體(bulk)，第16天)用不同量的Pan2D單克隆抗體接著用PE-結(jié)合的山羊F(ab’)2片段抗鼠IgG(H+L)抗體進(jìn)行孵育。陽(yáng)性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)是用同種型對(duì)照(純化的鼠IgGl)加以確定的。將樣品制成雙份。平均熒光強(qiáng)度=MFI。[0082]圖12提供了抗體DF200和Pan2DmAb的輕可變區(qū)和輕可變區(qū)⑶R的氨基酸序列的比較排列。[0083]圖13提供了抗體DF200的重可變區(qū)。【具體實(shí)施方式】[0084]技述[0085]本發(fā)明提供了新穎的抗體和片段或其衍生物，其與人抑制性KIR受體的共同決定簇(優(yōu)選存在于至少兩種不同的KIR2DL基因產(chǎn)物上的決定簇)結(jié)合，并且增強(qiáng)表達(dá)至少那些KIR受體之一的NK細(xì)胞。本發(fā)明首次披露，可以產(chǎn)生這種進(jìn)行交叉反應(yīng)并中和的抗體，其表現(xiàn)出意想不到的結(jié)果并打開了通向新穎和有效的基于NK的治療途徑，尤其是在人類受治療者中的治療途徑。在一優(yōu)選的【具體實(shí)施方式】中，該抗體不是單克隆抗體NKVSFl。[0086]在本發(fā)明的上下文中，“共同決定簇”表示由人抑制性KIR受體的幾個(gè)基因產(chǎn)物共有(共用)的決定簇或抗原決定部位。優(yōu)選地，共同決定簇由KIR2DL受體組的至少兩個(gè)成員共有。更優(yōu)選地，該決定簇由至少KIR2DL1和KIR2DL2/3共有。本發(fā)明的一些抗體，除識(shí)別KIR2DL的多基因產(chǎn)物以外，還可以識(shí)別存在于其它抑制性KIR，如KIR3DL受體組的基因產(chǎn)物上的決定簇。該決定簇或抗原決定部位可以表現(xiàn)為由所述成員共有的肽片段或構(gòu)象抗原決定部位。在一種更特殊的【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明的抗體特異性地結(jié)合于由單克隆抗體DF200識(shí)別的實(shí)質(zhì)上相同的抗原決定部位。這種決定簇存在于KIR2DL1和KIR2DL2/3上。[0087]在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)抗體與一個(gè)共同決定簇“相結(jié)合”表示一個(gè)抗體借助于特異性和/或親和性與所述決定簇相結(jié)合。[0088]如在本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“抗體”是指多克隆和單克隆抗體，以及指所述多克隆和單克隆抗體的片段和衍生物，除非另有說(shuō)明或明顯同上下文相矛盾。根據(jù)重鏈中恒定結(jié)構(gòu)域的類型，全長(zhǎng)抗體通常被確定為五個(gè)主要類型之一:IgA、IgD、IgE、IgG、以及IgM。其中一些被進(jìn)一步分成亞類或同種型，如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4等。相應(yīng)于不同類的免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)被分別稱為“α”、“β”、“ε”、“Y”以及“μ”。不同類免疫球蛋白的亞單位結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是眾所周知的。IgG和/或IgM是在本發(fā)明中使用的優(yōu)選類型的抗體，因?yàn)樗鼈兪窃谏頎顩r下最通常的抗體并且因?yàn)樗鼈冊(cè)趯?shí)驗(yàn)室裝置中最容易制備。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體是單克隆抗體。因?yàn)楸景l(fā)明的目的之一是阻斷抑制性KIR和其相應(yīng)的HLA配體在體內(nèi)的相互作用而不消除(耗竭)NK細(xì)胞，相應(yīng)于介導(dǎo)低效應(yīng)物功能的Fe受體的同種型，如IgG4，通常是優(yōu)選的。[0089]本發(fā)明的抗體可以通過(guò)本領(lǐng)域熟知的各種技術(shù)加以制備。通常，它們是通過(guò)借助免疫原對(duì)非人動(dòng)物、優(yōu)選小鼠進(jìn)行免疫作用來(lái)加以制備，其中所述免疫原包括抑制性KIR多肽，優(yōu)選為KIR2DL多肽，更優(yōu)選為人KIR2DL多肽。抑制性KIR多肽可以包括人抑制性KIR多肽的全長(zhǎng)序列、或其片段或衍生物，通常為免疫原片段，即，包括暴露在表達(dá)抑制性KIR受體的細(xì)胞表面上的抗原決定部位的多肽部分。這樣的片段通常包含成熟多肽序列的至少約7個(gè)連續(xù)氨基酸，甚至更優(yōu)選為至少約10個(gè)連續(xù)氨基酸。這些片段通常實(shí)質(zhì)上衍生自受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。甚至更優(yōu)選的是包括全長(zhǎng)KIRDL多肽的至少一個(gè)、更優(yōu)選為兩個(gè)細(xì)胞外Ig結(jié)構(gòu)域，并且能夠模擬存在于KIR2DL受體中的至少一個(gè)構(gòu)象抗原決定部位的人KIR2DL多肽。在其它的【具體實(shí)施方式】中，所述多肽包括KIR2DL1多肽的氨基酸位置1_224的細(xì)胞外Ig結(jié)構(gòu)域的至少約8個(gè)連續(xù)氨基酸(根據(jù)描述KIR基因家族的PROW萬(wàn)維網(wǎng)站的氨基酸編號(hào)，http://www.ncb1.nlm.nih.gov/prow/guide/1326018082.htm)。[0090]在一種最優(yōu)選的【具體實(shí)施方式】中，免疫原包括在脂質(zhì)膜中的野生型人KIR2DL多肽，通常在細(xì)胞表面。在一特定的【具體實(shí)施方式】中，免疫原包括完整NK細(xì)胞，尤其是完整的人NK細(xì)胞，可任選進(jìn)行處理或溶解。[0091]用抗原對(duì)非人哺乳動(dòng)物進(jìn)行免疫的步驟可以用本領(lǐng)域中熟知的任何方式來(lái)刺激小鼠產(chǎn)生抗體(參見，例如，E.HarlowandD.Lane,Antibodies:ALaboratoryManual.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY(1988))。然后將免疫原懸浮或溶解于緩沖液中，可任選一種佐劑，如完全弗氏佐劑。用于確定免疫原量、緩沖液類型以及佐劑量的方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是熟知的，并且不以任何方式限制本發(fā)明。對(duì)于不同的免疫原，這些參數(shù)可以不同，但容易加以說(shuō)明。[0092]類似地，足以刺激產(chǎn)生抗體的免疫作用的位置和頻率也是本【
技術(shù)領(lǐng)域：
】熟知的。在一種典型的免疫作用方案中，非人動(dòng)物在第I天被腹膜內(nèi)注射抗原并在約I周后再次注射。接著在約第20天回憶注射抗原，可任選用佐劑如不完全弗氏佐劑。該回憶注射在靜脈內(nèi)進(jìn)行并且可以連續(xù)重復(fù)幾天。接著在第40天進(jìn)行加強(qiáng)注射，經(jīng)靜脈或腹膜內(nèi)，通常不用佐劑。這種方案導(dǎo)致在約40天以后產(chǎn)生的B細(xì)胞能產(chǎn)生抗原特異性抗體。也可以使用其它方案，只要它們導(dǎo)致產(chǎn)生的B細(xì)胞表達(dá)的抗體指向在免疫作用中使用的抗原。[0093]對(duì)于多克隆抗體制劑，血清獲自經(jīng)免疫的非人動(dòng)物并且其中存在的抗體通過(guò)熟知的技術(shù)加以分離。該血清可以利用任何上述的連接于載體的免疫原加以親和純化，以便獲得與抑制性KIR受體反應(yīng)的抗體。[0094]在一種可替換的【具體實(shí)施方式】中，來(lái)自未免疫的非人哺乳動(dòng)物的淋巴細(xì)胞被分離，在體外生長(zhǎng)，然后暴露于在細(xì)胞培養(yǎng)中的免疫原。然后采集這些淋巴細(xì)胞并進(jìn)行下文描述的融合步驟。[0095]對(duì)于單克隆抗體，下一步驟是從經(jīng)免疫的非人哺乳動(dòng)物分離脾細(xì)胞以及其后用永生化細(xì)胞融合那些脾細(xì)胞，以便形成產(chǎn)生抗體的雜交瘤。從非人哺乳動(dòng)物中分離脾細(xì)胞是本【
技術(shù)領(lǐng)域：
】熟知的，并且通常涉及從麻醉的非人哺乳動(dòng)物中除去脾，將它切成小片，并從脾囊擠壓脾細(xì)胞并通過(guò)細(xì)胞濾過(guò)器的尼龍篩孔進(jìn)入適宜的緩沖液，以便產(chǎn)生單細(xì)胞懸浮液。這些細(xì)胞被洗滌，離心并再懸浮于溶解任何紅細(xì)胞的緩沖液中。再次離心溶液并將在沉淀中的剩余淋巴細(xì)胞最后重新懸浮在新鮮的緩沖液中。[0096]一旦分離并存在于單細(xì)胞懸浮液中以后，這些淋巴細(xì)胞可以被融合于一個(gè)永生化細(xì)胞系。這通常是鼠骨髓瘤細(xì)胞系，雖然在本領(lǐng)域已知許多其它永生化細(xì)胞系可用于產(chǎn)生雜交瘤。優(yōu)選的鼠骨髓瘤細(xì)胞系包括但不限于那些衍生自M0PC-21和MPC-1l鼠腫瘤的細(xì)胞系，其可獲自SalkInstituteCellDistributionCenter,SanDiego,Calif.U.S.A.，X63Ag8653和SP-2細(xì)胞，其可獲自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,Rockville,MarylandU.S.A.)。融合利用聚乙二醇或類似物來(lái)完成。然后將得到的雜交瘤在選擇的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，該選擇培養(yǎng)基包含一種或多種抑制未融合的、親代骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或存活的物質(zhì)。例如，如果親代骨髓瘤細(xì)胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，那么用于雜交瘤的培養(yǎng)基通常將包括次黃嘌呤、氨基蝶呤、以及胸苷(胸腺嘧啶脫氧核苷)(HAT培養(yǎng)基)，這些物質(zhì)可阻止HGPRT缺乏細(xì)胞的生長(zhǎng)。[0097]雜交瘤通常生長(zhǎng)在巨噬細(xì)胞的喂養(yǎng)層。巨噬細(xì)胞優(yōu)選來(lái)自用來(lái)分離脾細(xì)胞的非人哺乳動(dòng)物的同窩仔，并且通常在平皿培養(yǎng)雜交瘤數(shù)天前用不完全弗氏佐劑或類似物加以初次激活。在Goding,“MonoclonalAntibodies!PrinciplesandPractice,，，pp.59-103(AcademicPress,1986)中描述了融合方法，將其披露的內(nèi)容以引用方式結(jié)合于本文中。[0098]細(xì)胞被允許在選擇培養(yǎng)基中生長(zhǎng)足夠的時(shí)間以便形成菌落和產(chǎn)生抗體。這通常是在約7天和約14天之間。然后測(cè)定雜交瘤菌落產(chǎn)生的針對(duì)與多種抑制性KIR受體基因產(chǎn)物進(jìn)行交叉反應(yīng)的抗體。該測(cè)定通常是比色ELISA型測(cè)定，雖然可以采用任何可以適用于雜交瘤在其內(nèi)生長(zhǎng)的孔的測(cè)定。其它測(cè)定包括免疫沉淀和放射免疫測(cè)定。對(duì)于產(chǎn)生所希望的抗體為陽(yáng)性的孔進(jìn)行檢查，以確定是否存在一個(gè)或多個(gè)獨(dú)特的菌落。如果存在一個(gè)以上的菌落，則可以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行再克隆和生長(zhǎng)，以確保僅由單一細(xì)胞生成了產(chǎn)生所希望抗體的菌落。通常對(duì)具有單個(gè)表觀菌落的陽(yáng)性孔進(jìn)行再克隆和再測(cè)定以保證僅檢測(cè)和產(chǎn)生一種單克隆抗體。如在Wardetal.,Nature,341(1989)p.544中所披露的，還可以通過(guò)免疫球蛋白的組合文庫(kù)的選擇來(lái)產(chǎn)生抗體。[0099]本發(fā)明的抗體能夠中和KIR-介導(dǎo)的NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性的抑制作用；尤其是由KIR2DL受體介導(dǎo)的抑制作用以及更加尤其是至少KIR2DL1以及KIR2DL2/3兩者的抑制作用。因而這些抗體是“中和”或“抑制性”抗體，這是基于下述意義而言的:當(dāng)它們與MHC類型I分子相互作用時(shí)，它們，至少部分地和可檢測(cè)地，阻斷由KIR受體介導(dǎo)的抑制性信號(hào)通路。更重要的是，這種抑制性活性是相對(duì)于若干幾種類型的抑制性KIR受體、優(yōu)選為幾種KIT2DL受體基因產(chǎn)物、以及更優(yōu)選為至少KIR2DL1和KIR2DL2/3而呈現(xiàn)，以致這些抗體可以高效地用于各種受治療者。對(duì)KIR-介導(dǎo)的NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性的抑制作用的抑制可以通過(guò)各種測(cè)定或試驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估，如結(jié)合或細(xì)胞測(cè)定。[0100]一旦與多種抑制性KIR受體進(jìn)行交叉反應(yīng)的抗體被鑒定以后，可以試驗(yàn)它對(duì)那些在完整NK細(xì)胞中的KIR受體的抑制性效應(yīng)進(jìn)行中和的能力。在一特定的變化方案中，中和活性可以通過(guò)所述抗體借助于HLA-C陽(yáng)性靶的KIR2DL陽(yáng)性NK克隆重構(gòu)溶解的能力來(lái)加以說(shuō)明。在另一特定的【具體實(shí)施方式】中，抗體的中和活性是通過(guò)抗體抑制HLA-C分子結(jié)合于KIR2DL1和KIR2DL3(或緊密相關(guān)的KIR2DL2)受體的能力來(lái)加以定義的，進(jìn)一步優(yōu)選地作為抗體改變下述的能力:[0101]一選自Cwl、Cw3、Cw7、以及Cw8的HLA-C分子(或在第80位具有天冬酰胺殘基的HLA-C分子)結(jié)合于KIR2D2/3；以及[0102]一選自Cw2、Cw4、Cw5以及Cw6的HLA-C分子(或在第80位具有賴氨酸殘基的HLA-C分子)結(jié)合于KIR2D1。[0103]在另一種變化方案中，本發(fā)明的抗體的抑制性活性可以用如在本文提供的實(shí)施例中所披露的基于細(xì)胞的的細(xì)胞毒性測(cè)定來(lái)加以評(píng)估。[0104]在另一種變化方案中，本發(fā)明的抗體的抑制性活性可以用細(xì)胞因子釋放測(cè)定來(lái)加以評(píng)估，其中NK細(xì)胞用試驗(yàn)抗體孵育，而表達(dá)一種HLA-C等位基因的靶細(xì)胞系通過(guò)NK種群的KIR分子加以識(shí)別，以刺激NK細(xì)胞的細(xì)胞因子的產(chǎn)生(例如Y-干擾素和/或GM-CSF產(chǎn)生)。在一示范性方案中，由PBMC產(chǎn)生的Y-干擾素(IFN-Y)通過(guò)細(xì)胞表面和胞質(zhì)內(nèi)染色法以及通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法分析在培養(yǎng)約4天以后來(lái)加以評(píng)估。簡(jiǎn)單地說(shuō)，布雷菲德菌素A(BrefeldinA,SigmaAldrich)可以用約5yg/ml的終濃度加入，并進(jìn)行最少約4小時(shí)的培養(yǎng)。然后可以在滲透作用(IntraPrep?;BeckmanCoulter)以及用PE-抗-Y-干擾素(PE-抗-1FN-Y)或PE-1gGl(Pharmingen)染色之前，用抗-CD3及抗-CD56單克隆抗體(mAb)孵育細(xì)胞。由多克隆激活的NK細(xì)胞產(chǎn)生的GM-CSF和Y-干擾素(IFN-Y)可以利用ELISA在上清液中進(jìn)行測(cè)量(GM-CSF:DuoSetElisa,R&DSystems,Minneapolis,MN；IFN-y:OpeElAset,Pharmingen)。[0105]本發(fā)明的抗體可以部分或完全中和KIR-介導(dǎo)的NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性的抑制作用。如在本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“中和KIR-介導(dǎo)的NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性的抑制作用”是指:當(dāng)表達(dá)給定KIR的NK細(xì)胞種群與表達(dá)關(guān)連MHC類型I分子(由表達(dá)在NK細(xì)胞上的KIR所識(shí)別)的靶細(xì)胞接觸時(shí)，與在沒有抗體的情況下獲得的特異性溶解水平相比，增加到特異性溶解的至少約20%、優(yōu)選至少約30%、至少約40%、至少約50%或更多(例如，約25-100%)的能力，其中所述特異性溶解是在與NK細(xì)胞或NK細(xì)胞系(其未被它們的KIR阻斷)相同比率下獲得的，如通過(guò)細(xì)胞毒性經(jīng)典鉻釋放試驗(yàn)所測(cè)得的。例如，本發(fā)明的優(yōu)選抗體能夠誘導(dǎo)匹配的或HLA相容的或自體同源靶細(xì)胞種群(即在沒有所述抗體存在的情況下，不會(huì)被NK細(xì)胞有效溶解的細(xì)胞種群)的溶解。因此，本發(fā)明的抗體也可以定義為在體內(nèi)有助于NK細(xì)胞活性。[0106]可替換地，術(shù)語(yǔ)“中和KIR介導(dǎo)的抑制作用”是指:在利用表達(dá)一種或數(shù)種抑制性KIR的NK細(xì)胞克隆或轉(zhuǎn)染子以及僅表達(dá)一種HLA等位基因(其由NK細(xì)胞上的KIR之一加以識(shí)別)的靶細(xì)胞的鉻測(cè)定中，借助抗體獲得的細(xì)胞毒性水平應(yīng)是借助已知的阻斷抗MHC類型I分子(如W6/32抗MHC類型I抗體)獲得的細(xì)胞毒性的至少約20%、優(yōu)選至少約30%、至少約40%、至少約50%(例如，約25-100%)、或更多。[0107]在一特定【具體實(shí)施方式】中，該抗體結(jié)合實(shí)質(zhì)上與單克隆抗體DF200(由雜交瘤DF200產(chǎn)生的)相同的抗原決定部位。在本文中這樣的抗體被稱作“DF200樣抗體”。在一另外的優(yōu)選【具體實(shí)施方式】中，該抗體是單克隆抗體。本發(fā)明的更優(yōu)選的“DF200樣抗體”是不同于單克隆抗體NKVSFl的抗體。最優(yōu)選的是單克隆抗體DF200(由雜交瘤DF200產(chǎn)生的)。[0108]術(shù)語(yǔ)“結(jié)合于實(shí)質(zhì)上與感興趣的抗體相同的抗原決定部位或決定簇”是指抗體和所述感興趣的抗體“競(jìng)爭(zhēng)”。術(shù)語(yǔ)“結(jié)合于實(shí)質(zhì)上與單克隆抗體DF200相同的抗原決定部位或決定簇”是指抗體和DF200“競(jìng)爭(zhēng)”。一般來(lái)說(shuō)，“結(jié)合于實(shí)質(zhì)上與感興趣的單克隆抗體相同的抗原決定部位或決定簇”的抗體(例如，DF200、NKVSFlU7F9)是指該抗體與所述感興趣的抗體“競(jìng)爭(zhēng)”更多KIR分子的任何一種，優(yōu)選為一種KIR分子，其選自由KIR2DL1和KIR2DL2/3構(gòu)成的組。在其它實(shí)施例中，結(jié)合于實(shí)質(zhì)上與感興趣的抗體相同的在KIR2DL1分子上的抗原決定部位或決定簇的抗體與感興趣的抗體“競(jìng)爭(zhēng)”結(jié)合于KIR2DL1。結(jié)合于實(shí)質(zhì)上與感興趣的抗體相同的在KIR2DL2/3分子上的抗原決定部位或決定簇的抗體與感興趣的抗體“競(jìng)爭(zhēng)”結(jié)合于KIR2DL2/3。[0109]術(shù)語(yǔ)“結(jié)合于本質(zhì)上與感興趣的抗體相同的抗原決定部位或決定簇”是指抗體與所述感興趣的抗體“競(jìng)爭(zhēng)”任何及所有KIR分子，所述感興趣的抗體特異性地結(jié)合于這些KIR分子。術(shù)語(yǔ)“結(jié)合于本質(zhì)上與單克隆抗體DF200相同的抗原決定部位或決定簇”是指抗體與DF200“競(jìng)爭(zhēng)”任何及所有KIR分子，DF200特異性地結(jié)合于這些KIR分子。例如，結(jié)合于本質(zhì)上與單克隆抗體DF200或NKVSFl相同的抗原決定部位或決定簇的抗體分別與所述DF200或NKVSFl“競(jìng)爭(zhēng)”結(jié)合于KIR2DL1、KIR2DL2/3、KIR2DS1以及KIR2DS2。[0110]利用各種免疫篩選測(cè)定(其中可以評(píng)估抗體競(jìng)爭(zhēng)性)的任何一種，可以容易地鑒定一種或多種抗體，這些抗體結(jié)合于實(shí)質(zhì)上或本質(zhì)上與本文中描述的單克隆抗體相同的抗原決定部位。許多這樣的測(cè)定被常規(guī)實(shí)施，并且在本【
技術(shù)領(lǐng)域：
】是熟知的(參見，例如，1997年8月26日發(fā)行的美國(guó)專利第5，660，827號(hào)，將其特別地以引用方式結(jié)合于本文中)。應(yīng)當(dāng)明了，實(shí)際上確定本文描述的抗體與其結(jié)合的抗原決定部位決不需要鑒定結(jié)合于與本文描述的單克隆抗體相同的或?qū)嵸|(zhì)上相同的抗原決定部位的抗體。[0111]例如，在要檢查的試驗(yàn)抗體是獲自不同來(lái)源的動(dòng)物、或甚至是具有不同的Ig同種型的情況下，可以采用簡(jiǎn)單的競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定，其中將對(duì)照抗體(例如，DF200)與試驗(yàn)抗體混合(或預(yù)吸附)并施加于含有KIR2DL1及KIR2DL2/3的樣品，其中已知KIR2DL1及KIR2DL2/3各自被DF200結(jié)合?；诿嘎?lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、放射免疫測(cè)定、蛋白質(zhì)印跡法(Westernblotting)的方案，以及BIACORE分析的應(yīng)用(如在實(shí)施例部分所陳述的)適用于這樣的簡(jiǎn)單競(jìng)爭(zhēng)研究。[0112]在一些【具體實(shí)施方式】中，在施加到抑制性KIR抗原樣品之前，可以用不同量的試驗(yàn)抗體(例如，約1:10或約1:100)與對(duì)照抗體(例如，DF200)預(yù)混合一段時(shí)間。在其它的【具體實(shí)施方式】中，可以在暴露于KIR抗原樣品期間，簡(jiǎn)單地混合對(duì)照抗體和不同量的試驗(yàn)抗體。只要可以將結(jié)合抗體和游離抗體區(qū)別開(例如，利用分離或洗滌技術(shù)以消除未結(jié)合的抗體)以及將DF200和試驗(yàn)抗體區(qū)別開(例如，利用物種特異性或同種型特異性次級(jí)抗體或通過(guò)用可檢測(cè)的標(biāo)記物特異性地標(biāo)記DF200)，就可以確定是否試驗(yàn)抗體可降低DF200結(jié)合于兩種不同的KIR2DL抗原,其表不試驗(yàn)抗體識(shí)別實(shí)質(zhì)上與DF200相同的抗原決定部位。在沒有完全不相關(guān)抗體存在的情況下，(標(biāo)記的)對(duì)照抗體的結(jié)合可以作為對(duì)照高值。通過(guò)用完全相同類型的未標(biāo)記抗體(DF200)孵育經(jīng)標(biāo)記的(DF200)抗體，就可以獲得對(duì)照低值，其中可能發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)并降低標(biāo)記抗體的結(jié)合。在試驗(yàn)測(cè)定中，在有試驗(yàn)抗體存在的情況下，標(biāo)記抗體反應(yīng)性的顯著降低預(yù)示可識(shí)別實(shí)質(zhì)上相同的抗原決定部位的試驗(yàn)抗體，即，一種與經(jīng)標(biāo)記的(DF200)抗體“交叉反應(yīng)”的試驗(yàn)抗體。在DF200:試驗(yàn)抗體為約1:10和約1:100之間的任何比率下，降低DF200與每種KIR2DL1及KIR2DL2/3抗原的結(jié)合至少約50%，如至少約60%，或更優(yōu)選至少約70%(例如，約65-100%)的任何試驗(yàn)抗體都可以被認(rèn)為是結(jié)合于實(shí)質(zhì)上與DF200相同的抗原決定部位或決定簇的抗體。優(yōu)選地，這樣的試驗(yàn)抗體將降低DF200與每種KIR2DL抗原的結(jié)合至少約90%(例如，約95%)。[0113]例如，可以通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法試驗(yàn)對(duì)競(jìng)爭(zhēng)性進(jìn)行評(píng)估。在這樣的試驗(yàn)中，帶有給定KIR的細(xì)胞可以首先用例如DF200加以孵育，然后用熒光色素或生物素標(biāo)記的試驗(yàn)抗體加以孵育。如果在用飽和量的DF200預(yù)孵育以后獲得的結(jié)合是在沒有用DF200預(yù)孵育的情況下由抗體獲得的結(jié)合(如借助于熒光測(cè)得的)的約80%、優(yōu)選約50%、約40%或更小(例如，約30%)，則認(rèn)為抗體與DF200競(jìng)爭(zhēng)。可替換地，如果在用飽和量的試驗(yàn)抗體預(yù)孵育的細(xì)胞上用(通過(guò)熒光色素或生物素)標(biāo)記的DF200獲得的結(jié)合是在沒有用抗體預(yù)孵育的情況下獲得的結(jié)合的約80%、優(yōu)選約50%、約40%、或更小(例如，約30%)，則認(rèn)為抗體與DF200競(jìng)爭(zhēng)。[0114]也可以有利地采用一種簡(jiǎn)單的競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定，其中試驗(yàn)抗體被預(yù)吸附并以飽和濃度施加于一個(gè)表面，其上還固定了KIR2DL1及KIR2DL2/3。在此簡(jiǎn)單的競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定中的表面優(yōu)選為BIACORE芯片(或其它適用于表面等離子共振分析的介質(zhì))。然后將對(duì)照抗體(例如，DF200)與具有KIR2DL1及KIR2DL2/3飽和濃度的表面接觸，并測(cè)量對(duì)照抗體的KIR2DL1及KIR2DL2/3表面結(jié)合。將對(duì)照抗體的這種結(jié)合與在沒有試驗(yàn)抗體的情況下對(duì)照抗體與含有KIR2DL1及KIR2DL2/3的表面的結(jié)合進(jìn)行比較。在一試驗(yàn)測(cè)定中，在有試驗(yàn)抗體存在的情況下，對(duì)照抗體對(duì)含有KIR2DL1及KIR2DL2/3的表面的結(jié)合的顯著降低表明，試驗(yàn)抗體識(shí)別實(shí)質(zhì)上與對(duì)照抗體相同的抗原決定部位，以致該試驗(yàn)抗體與對(duì)照抗體進(jìn)行“交叉反應(yīng)”。降低對(duì)照抗體(如DF200)與每種KIR2DL1和KIR2DL2/3抗原的結(jié)合至少約30%或更優(yōu)選約40%的任何試驗(yàn)抗體都可以被認(rèn)為是結(jié)合于實(shí)質(zhì)上與對(duì)照抗體(例如，DF200)相同的抗原決定部位或決定簇的抗體。優(yōu)選地,這樣的試驗(yàn)抗體將降低對(duì)照抗體(例如，DF200)與每種KIR2DL抗原的結(jié)合至少約50%(例如，至少約60%、至少約70%、或更大)。應(yīng)當(dāng)明了，對(duì)照抗體和試驗(yàn)抗體的次序可以顛倒:即，對(duì)照抗體可以首先結(jié)合于表面，其后在競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定中將試驗(yàn)抗體與表面接觸。優(yōu)選地，對(duì)于KIR2DL1及KIR2DL2/3抗原具有更高親和性的抗體被首先結(jié)合于含有KIR2DL1和KIR2DL2/3的表面，如可以預(yù)期的，對(duì)于第二抗體所看到的結(jié)合降低(假定抗體正進(jìn)行交叉反應(yīng))將具有更大的幅度。這樣的測(cè)定的另外的實(shí)施例在實(shí)施例中提供以及在，例如，SaunalandRegenmortel,(1995)J.1mmunol.Methodsl83:33-41中提供，將其披露的內(nèi)容以引用方式結(jié)合于本文中。[0115]雖然為了舉例的目的在DF200的范圍內(nèi)加以描述，但應(yīng)當(dāng)明了，上述免疫篩選測(cè)定也可以用來(lái)鑒定和NKVSF1、1-7F9、EB6、GL183、以及根據(jù)本發(fā)明的其它抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)的抗體。[0116]在脊椎動(dòng)物或細(xì)胞中進(jìn)行免疫作用和產(chǎn)生抗體以后，可以進(jìn)行特定的選擇步驟，以分離如要求保護(hù)的抗體。在這方面，在一特定的【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明還涉及產(chǎn)生這樣抗體的方法，包括:[0117](a)用包括抑制性KIR多肽的免疫原免疫非人哺乳動(dòng)物；[0118](b)由所述經(jīng)免疫的動(dòng)物制備抗體，其中所述抗體與所述KIR多肽相結(jié)合，[0119](C)選擇(b)的抗體，這些抗體與至少兩種不同的抑制性KIR基因產(chǎn)物進(jìn)行交叉反應(yīng)，以及[0120](d)選擇(C)的抗體，這些抗體對(duì)表達(dá)所述至少兩種不同的人抑制性KIR受體基因產(chǎn)物的NK細(xì)胞種群能夠中和KIR-介導(dǎo)的NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性的抑制作用。[0121]選擇與至少兩種不同的抑制性KIR基因產(chǎn)物進(jìn)行交叉反應(yīng)的抗體可以通過(guò)相對(duì)于兩種或更多種不同的抑制性KIR抗原，例如，如上所述的抗原，對(duì)抗體進(jìn)行篩選來(lái)實(shí)現(xiàn)。[0122]在一種更優(yōu)選的【具體實(shí)施方式】中，在步驟(b)中制備的抗體是單克隆抗體。因而，如在本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“從所述經(jīng)免疫的動(dòng)物制備抗體”包括由經(jīng)免疫的動(dòng)物獲得B細(xì)胞以及利用那些B細(xì)胞以產(chǎn)生表達(dá)抗體的雜交瘤，以及直接由經(jīng)免疫動(dòng)物的血清獲得抗體。在另一優(yōu)選的【具體實(shí)施方式】中，在步驟(c)中選擇的抗體是那些與至少KIR2DL1及KIR2DL2/3進(jìn)行交叉反應(yīng)的抗體。[0123]在又一優(yōu)選的【具體實(shí)施方式】中，與在和NK細(xì)胞(未被它們的KIR阻斷)相同的效應(yīng)物/靶比率下獲得的溶解或細(xì)胞毒性相比，相對(duì)于表達(dá)關(guān)連HLA類型I分子，在步驟(d)中選擇的抗體引起至少約10%的由NK細(xì)胞(顯示至少一種由抗體識(shí)別的KIR)介導(dǎo)的特異性溶解，以及優(yōu)選至少約40%的特異性溶解，至少約50%的特異性溶解，或更優(yōu)選至少約70%的特異性溶解(例如，約60-100%的特異性溶解)，如用標(biāo)準(zhǔn)鉻釋放測(cè)定所測(cè)得的?？商鎿Q地，當(dāng)在步驟(d)中選擇的抗體用于鉻測(cè)定時(shí)，其中鉻測(cè)定采用表達(dá)一種或數(shù)種抑制性KIR的NK細(xì)胞克隆以及僅表達(dá)一種HLA等位基因(其由NK克隆上的KIR之一加以識(shí)別)的靶細(xì)胞，用該抗體獲得的細(xì)胞毒性水平應(yīng)是用阻斷抗MHC類型I單克隆抗體如W6/32抗MHC類型I抗體所獲得的細(xì)胞毒性的至少約20%，優(yōu)選至少約30%，或更多。[0124]可以改變以上剛剛描述的方法的步驟(C)和(d)的次序?？蛇x地，該方法還可以或可替換地可以進(jìn)一步包括另外的步驟:制備單克隆抗體的片段或單克隆抗體或這樣的片段的衍生物，例如，如在本文中的其它地方所描述的。[0125]在一優(yōu)選的【具體實(shí)施方式】中，用來(lái)根據(jù)本發(fā)明的可適用方法產(chǎn)生抗體的非人動(dòng)物是哺乳動(dòng)物，如嚙齒動(dòng)物(例如，小鼠、大鼠等)、牛、豬、馬、兔、山羊、綿羊等。此外，非人哺乳動(dòng)物可以被基因修飾或基因工程化以產(chǎn)生“人”抗體，如Xenomouse?(Abgenix)或HuMAb-Mouse?(Medarex)0[0126]在另一種變化方案中，本發(fā)明提供了獲得抗體的方法，包括:[0127](a)從單克隆抗體的文庫(kù)或表達(dá)譜中選擇單克隆抗體、單克隆抗體的片段、或二者任一種的衍生物，其與至少兩種不同的人抑制性KIR2DL受體基因產(chǎn)物進(jìn)行交叉反應(yīng)，以及[0128](b)選擇(a)的抗體、片段、或衍生物，其在表達(dá)所述至少兩種不同的人抑制性KIR2DL受體基因產(chǎn)物的NK細(xì)胞種群中能夠中和KIR-介導(dǎo)的NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性的抑制作用。[0129]所述表達(dá)譜可以是抗體或其片段的任何(重組體)表達(dá)譜，可任選通過(guò)何種適宜的結(jié)構(gòu)(例如，噬菌體、細(xì)菌、合成的復(fù)合物等)加以顯示。抑制性抗體的選擇可以如上所披露的那樣進(jìn)行，并進(jìn)一步在實(shí)施例中加以說(shuō)明。[0130]根據(jù)另一【具體實(shí)施方式】，本發(fā)明提供了包括來(lái)自非人宿主的B細(xì)胞的雜交瘤，其中所述B細(xì)胞產(chǎn)生一種抗體，該抗體與存在于至少兩種不同的人抑制性KIR受體基因產(chǎn)品上的決定簇相結(jié)合，并且所述抗體能夠中和所述受體的抑制性活性。更優(yōu)選地，本發(fā)明的此方面的雜交瘤不是產(chǎn)生單克隆抗體NKVSFl的雜交瘤。根據(jù)本發(fā)明的此方面的雜交瘤，可以如上所述通過(guò)用永生化細(xì)胞系融合來(lái)自經(jīng)免疫的非人哺乳動(dòng)物的脾細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生。如在本文的其它地方所描述的，可以對(duì)于這樣的交叉反應(yīng)抗體的存在，篩選通過(guò)這種融合所產(chǎn)生的雜交瘤。優(yōu)選地，該雜交瘤產(chǎn)生一種抗體，其可識(shí)別存在于至少兩種不同的KIR2DL基因產(chǎn)物上的決定簇，以及增強(qiáng)表達(dá)至少那些KIR受體之一的NK細(xì)胞。甚至更優(yōu)選地，該雜交瘤產(chǎn)生一種抗體,該抗體結(jié)合于實(shí)質(zhì)上與DF200相同的抗原決定部位或決定簇并且該抗體增強(qiáng)NK細(xì)胞活性。最優(yōu)選地，所述雜交瘤是產(chǎn)生單克隆抗體DF200的雜交瘤DF200。[0131]已經(jīng)證實(shí)產(chǎn)生本發(fā)明的單克隆抗體的雜交瘤可以更大量地生長(zhǎng)在適宜的培養(yǎng)基中，如DMEM或RPM1-1640。可替換地，該雜交瘤細(xì)胞可以在體內(nèi)如動(dòng)物的腹水瘤中生長(zhǎng)。[0132]在足夠生長(zhǎng)以產(chǎn)生所希望的單克隆抗體以后，將含有單克隆抗體的生長(zhǎng)培養(yǎng)基(或腹水液)與細(xì)胞分開，并純化存在于其中的單克隆抗體。純化通常是借助于凝膠電泳、透析、利用蛋白A或蛋白G瓊脂糖凝膠的層析法、或連接于載體如瓊脂糖或瓊脂糖凝膠珠的抗鼠Ig來(lái)實(shí)現(xiàn)(例如，全部描述在theAntibodyPurificationHandbook,AmershamBiosciences,publicationN0.18-1037-46，EditionAC，將其披露的內(nèi)容以引用方式結(jié)合于本文中)。結(jié)合的抗體通常是利用低PH緩沖液(pH為3.0或更低的甘氨酸或乙酸緩沖液)洗脫自蛋白A/蛋白G柱，同時(shí)立即中和包含抗體的部分。按需要，對(duì)這些部分進(jìn)行集中、透析、以及濃縮。[0133]根據(jù)一種可替換的【具體實(shí)施方式】，一種抗體結(jié)合在存在于至少兩種不同的人抑制性KIR受體基因產(chǎn)物的決定簇上，對(duì)該抗體進(jìn)行編碼的DNA分離自本發(fā)明的雜交瘤，并置于適宜的表達(dá)載體中，用于轉(zhuǎn)染到適宜的宿主。然后該宿主被用于重組產(chǎn)生抗體、或其變異體，如單克隆抗體的人源化形式、抗體的活性片段、或包括抗體的抗原識(shí)別部分的嵌合抗體。優(yōu)選地，在本【具體實(shí)施方式】中使用的DNA所編碼的一種抗體可識(shí)別存在于至少兩種不同的KIR2DL基因產(chǎn)物上的決定簇，并使表達(dá)至少那些KIR受體之一的NK細(xì)胞得到增強(qiáng)。甚至更優(yōu)選地，該DNA編碼的一種抗體結(jié)合于實(shí)質(zhì)上與DF200相同的抗原決定部位或決定簇并且增強(qiáng)NK細(xì)胞活性。最優(yōu)選地，所述DNA對(duì)單克隆抗體DF200進(jìn)行編碼。[0134]利用常規(guī)程序(例如，利用能夠特異性地結(jié)合于編碼鼠抗體的重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)可容易地分離對(duì)本發(fā)明的單克隆抗體進(jìn)行編碼的DNA并進(jìn)行測(cè)序。一旦分離以后，可以將DNA置于表達(dá)載體中，然后將其轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞如，本來(lái)并不產(chǎn)生免疫球蛋白的大腸桿菌細(xì)胞、猿猴COS細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、或骨髓瘤細(xì)胞，從而在重組體宿主細(xì)胞中獲得合成的單克隆抗體。在細(xì)菌中重組表達(dá)抗體編碼的DNA在本【
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】是熟知的(參見，例如，Skerraetal.,Curr.0pinioninTmmunol.,5,dd.256(1993);以及Pluckthun.Tmmunol.Revs..130.nn.151(1992))。[0135]單克隆抗體的片段和衍生物[0136]本發(fā)明的抗體的片段和衍生物(如在本申請(qǐng)中所使用的，其由術(shù)語(yǔ)“抗體”所涵蓋，除非另有說(shuō)明或明顯與上下文相矛盾)，優(yōu)選為DF-200-樣抗體，可以通過(guò)本【
技術(shù)領(lǐng)域：
】已知的技術(shù)來(lái)產(chǎn)生?！懊庖叻磻?yīng)片段”包括完整抗體的一部分，通常是抗原結(jié)合部位或可變區(qū)。抗體片段的實(shí)例包括:Fab、Fab'、Fab'_SH、F(ab')2、以及Fv片段；雙功能抗體；任何抗體片段，其是具有一級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽，其中一級(jí)結(jié)構(gòu)由鄰近氨基酸殘基的一個(gè)未中斷序列(在本文中稱作“單鏈抗體片段”或“單鏈多肽”)構(gòu)成，包括但不限于(I)單鏈Fv(scFv)分子(2)僅包含一個(gè)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的單鏈多肽，或其包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的三個(gè)CDR、而沒有相聯(lián)的重鏈部分的片段以及(3)僅包含一個(gè)重鏈可變區(qū)的單鏈多肽，或其包含重鏈可變區(qū)的三個(gè)CDR、而沒有相聯(lián)的輕鏈部分的片段；以及形成自抗體片段的多特異性抗體。例如，F(xiàn)ab或F(ab')2片段可以按照常規(guī)技術(shù)通過(guò)蛋白酶消化分離的抗體來(lái)產(chǎn)生。應(yīng)當(dāng)明了，可以利用已知方法來(lái)修飾免疫反應(yīng)片段，例如為了放慢體內(nèi)清除率和獲得更合乎要求的藥物動(dòng)力學(xué)曲線，可以用聚乙二醇(PEG)對(duì)片段進(jìn)行修飾。用于將PEG偶聯(lián)于以及部位特異性地結(jié)合于Fab'片段的方法描述在,例如，Leongetal,Cytokinel6(3):106-119(2001)以及Delgadoetal.Br.T.Cancer73(2):175-182(1996)中，將其披露的內(nèi)容以引用方式結(jié)合于本文中。[0137]在一特定方面，本發(fā)明提供了抗體、抗體片段、以及抗體衍生物，其包括如圖12示出的DF-200的輕鏈可變區(qū)序列。在另一個(gè)特定方面，本發(fā)明提供了抗體，抗體片段，以及抗體衍生物，其包括如圖12示出的Pan2D的輕鏈可變區(qū)序列。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了抗體，抗體片段，以及其衍生物，其包括如圖12示出的DF-200的一個(gè)或多個(gè)輕可變區(qū)CDR。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供了抗體，抗體片段，以及其衍生物，其包括如圖12示出的Pan2D的一個(gè)或多個(gè)輕可變區(qū)CDR。通過(guò)利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，在這些所披露的氨基酸序列中進(jìn)行適當(dāng)?shù)娜〈?、添加、?或缺失，就可以產(chǎn)生這類序列的功能性變異體/類似物，其可以在序列比較的幫助下進(jìn)行。因而，例如，保存在Pan2D和DF-200之間的CDR殘基可以是用于修飾的適宜的靶標(biāo)，因?yàn)檫@樣的殘基在這些抗體相對(duì)于本文披露的其它抗體的競(jìng)爭(zhēng)中不會(huì)影響不同的圖形(雖然Pan2D和DF-200確實(shí)競(jìng)爭(zhēng))，因而不會(huì)影響這些抗體對(duì)于它們特定的相應(yīng)抗原決定部位的特異性。在另一個(gè)方面，殘基存在于這些抗體之一的序列中但不存在于另一種抗體序列中的位置可以適用于缺失、取代、和/或插入。[0138]在一特定方面，本發(fā)明提供了抗體，抗體片段，以及抗體衍生物，其包括如圖13示出的DF-200的重鏈可變區(qū)序列。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了抗體，抗體片段，以及其衍生物，其包括如圖13示出的DF-200的一個(gè)或多個(gè)重可變區(qū)⑶R。通過(guò)利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，在這些所披露的氨基酸序列中進(jìn)行適當(dāng)?shù)娜〈?、添加、?或缺失，就可以產(chǎn)生這類序列的功能性變異體/類似物，其可以在序列比較的幫助下進(jìn)行。在另一個(gè)方面，殘基存在于這些抗體之一的序列中但不存在于另一種抗體序列中的位置可以適用于缺失、取代、和/或插入。[0139]可替換地，產(chǎn)生本發(fā)明的抗體的雜交瘤的DNA，優(yōu)選為DF-200-樣抗體，可以加以修飾以便為本發(fā)明的片段加以編碼。然后將經(jīng)修飾的DNA插入表達(dá)載體中，并用來(lái)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染適當(dāng)?shù)募?xì)胞，然后由其表達(dá)所希望的片段。[0140]在一種可替換的【具體實(shí)施方式】中，產(chǎn)生本發(fā)明的抗體的雜交瘤的DNA，優(yōu)選為DF-200-樣抗體，可以在插入表達(dá)載體中以前加以修飾，例如，通過(guò)用編碼序列取代人重鏈和輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域，以代替異體同源非人序列(例如，Morrisonetal.,Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.,81,pp.6851(1984))，或通過(guò)將用于非免疫球蛋白多肽的所有或部分編碼序列共價(jià)連接于免疫球蛋白來(lái)編碼序列。用此方式，可以制備“嵌合”或“雜交”抗體，這些抗體具有最初抗體的結(jié)合特異性。通常，用這樣的非免疫球蛋白多肽代替本發(fā)明的抗體的恒定結(jié)構(gòu)域。[0141]因而，根據(jù)另一【具體實(shí)施方式】，本發(fā)明的抗體，優(yōu)選為DF-200-樣抗體，被人源化。根據(jù)本發(fā)明抗體的“人源化”形式是特異的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(如Fv、Fab>Fab;、F(ab')2,或抗體的其它抗原結(jié)合亞序列),其包含衍生自鼠免疫球蛋白的最小序列。對(duì)于大部分來(lái)說(shuō)，人源化抗體是人免疫球蛋白(受體抗體)，其中用來(lái)自最初抗體(供體抗體)的CDR的殘基代替來(lái)自受體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的殘基，同時(shí)保持最初抗體的所希望的特異性、親和力、以及能力。在一些情況下，人免疫球蛋白的Fv骨架區(qū)殘基可以被相應(yīng)的非人殘基所代替。此外，人源化抗體可以包括在受體抗體或在輸入的CDR或骨架序列中未發(fā)現(xiàn)的殘基。進(jìn)行這些修飾以進(jìn)一步改善和優(yōu)化抗體性能。一般而言，人源化抗體將包括實(shí)質(zhì)上所有的可變結(jié)構(gòu)域的至少一種、以及通常兩種可變結(jié)構(gòu)域，其中所有或?qū)嵸|(zhì)上所有的CDR區(qū)對(duì)應(yīng)于最初抗體的那些CDR區(qū)，并且所有或?qū)嵸|(zhì)上所有的FR區(qū)是人免疫球蛋白共有序列的那些FR區(qū)。人源化抗體最佳還將包括至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。對(duì)于進(jìn)一步的細(xì)節(jié)參見Jonesetal.,Nature,321,pp.522(1986);Reichmannetal.,Nature,332,pp.323(1988):以及Presta,Curr.0p.Struct.Biol.,2,pp.593(1992)。[0142]對(duì)本發(fā)明的抗體進(jìn)行人源化的方法在本【
技術(shù)領(lǐng)域：
】是熟知的。通常，根據(jù)本發(fā)明的人源化抗體具有一種或多種從最初抗體引入的氨基酸殘基。這些鼠或其它非人氨基酸殘基經(jīng)常稱作“輸入”殘基，這些殘基通常取自“輸入”可變結(jié)構(gòu)域。實(shí)質(zhì)上可以按照Winter以及合作者的方法進(jìn)行人源化(Jonesetal.,Nature,321,pp.522(1986);Riechmannetal.,Nature,332,pp.323(1988);Verhoeyenetal.,Science,239,pp.1534(1988))。因此，這樣的“人源化”抗體是嵌合抗體(Cabillyetal.，美國(guó)專利第4，816，567號(hào))，其中顯著小于完整的人可變結(jié)構(gòu)域的可變結(jié)構(gòu)域已被來(lái)自最初抗體的相應(yīng)序列所取代。實(shí)際上，根據(jù)本發(fā)明的人源化抗體通常是人抗體，其中一些CDR殘基以及可能的一些FR殘基被來(lái)自最初抗體中的類似位點(diǎn)(部位)的殘基所取代。[0143]為了降低抗原性，對(duì)用于制備人源化抗體的人可變結(jié)構(gòu)域(輕可變結(jié)構(gòu)域和重可變結(jié)構(gòu)域)的選擇是非常重要的。根據(jù)所謂的“最佳配合”方法，本發(fā)明的抗體的可變結(jié)構(gòu)域的序列是針對(duì)已知的人可變結(jié)構(gòu)域序列的整個(gè)文庫(kù)加以篩選的。然后將最接近鼠序列的人序列當(dāng)作人源化抗體的人骨架(FR)(Simsetal.,T.1mmunol.,151,pp.2296(1993):Chothia和Lesk,T.Mol.Biol..196,pp.901(1987))。另一種方法使用特定的骨架，該骨架是來(lái)自輕鏈或重鏈的特定亞組的所有人抗體的共有序列。相同的骨架可以用于幾種不同的人源化抗體(Carteretal.,Proc.Natl.Acad.ScLU.S.A.,89,pp.4285(1992);Prestaetal.,T.Tmmunol..51,pp.1993))。[0144]更重要的是，對(duì)抗體進(jìn)行人源化時(shí)保留對(duì)多種抑制性KIR受體的高親和力以及其它有利的生物性能。為了達(dá)到此目的，根據(jù)一種優(yōu)選的方法，人源化抗體是通過(guò)利用親代和人源化序列的三維模型分析親代序列和各種概念性人源化產(chǎn)物來(lái)制備的。通?？色@得三維免疫球蛋白模型，并且為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知?？色@得計(jì)算機(jī)程序，其說(shuō)明和顯示選擇的候選免疫球蛋白序列的可能的三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)。檢查這些顯像允許分析殘基在候選免疫球蛋白序列的功能中可能的作用，即，分析殘基影響候選免疫球蛋白結(jié)合其抗原的能力。這樣，可以選擇FR殘基并使之由共有序列和輸入序列組合，以致可以獲得所希望的抗體特性，如對(duì)于靶抗原的增加的親和力。一般而言，CDR殘基直接并最顯著地涉及影響抗原結(jié)合。[0145]制備“人源化”單克隆抗體的另一種方法是使用XenoMouse⑧(Abgenix,Fremont,CA)作為用于免疫作用的小鼠。XenoMouse是根據(jù)本發(fā)明的鼠宿主，其免疫球蛋白基因已被功能性人免疫球蛋白基因所取代。因而，由此鼠產(chǎn)生的或在制備自這種鼠的B細(xì)胞的雜交瘤中的抗體已經(jīng)被人源化。美國(guó)專利第6，162，963號(hào)描述了XenoMouse,將該專利全文以引用方式結(jié)合于本文中。利用HuMAb-Mouse?(Medarex)可以實(shí)現(xiàn)一種類似的方法。[0146]按照各種其它技術(shù)也可以制備人抗體，如，為了免疫，利用其它轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，這些轉(zhuǎn)基因動(dòng)物已加以基因工程化以表達(dá)人抗體表達(dá)譜(Jakobovitzetal.,Nature362(1993)255)，或通過(guò)利用噬菌體顯示法選擇抗體表達(dá)譜。這樣的技術(shù)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的，并且如在本申請(qǐng)中所披露的可以從單克隆抗體開始進(jìn)行實(shí)施。[0147]本發(fā)明的抗體，優(yōu)選為DF-200-樣抗體，也可以被衍生為“嵌合”抗體(免疫球蛋白)，其中一部分重鏈和/或輕鏈與最初抗體的相應(yīng)序列相同或異體同源，同時(shí)鏈的剩余部分與在一些抗體中的相應(yīng)序列相同或異體同源，其中所述抗體衍生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類或亞類、以及這樣的抗體的片段，只要它們呈現(xiàn)所希望的生物活性(Cabillyetal.,supra;Morrisonetal.,Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.,81,pp.6851(1984))。[0148]在本發(fā)明范圍內(nèi)的其它衍生物包括官能化抗體，即，將抗體共軛或共價(jià)結(jié)合于:毒素，如蓖麻毒蛋白、白喉毒素、相思豆毒素和假單胞菌外毒素；可檢測(cè)部分，如熒光部分、放射性同位素或成像劑；或載體，如瓊脂糖珠或類似物。將這些其它藥劑與抗體共軛或共價(jià)結(jié)合的方法在本【
技術(shù)領(lǐng)域：
】是熟知的。[0149]共軛于毒素可用于靶向殺傷NK細(xì)胞，這些細(xì)胞在其細(xì)胞表面呈現(xiàn)為交叉反應(yīng)KIR受體之一。一旦本發(fā)明的抗體結(jié)合于這樣細(xì)胞的細(xì)胞表面以后，它被內(nèi)在化并將毒素釋放在細(xì)胞內(nèi)，從而選擇性地殺傷所述細(xì)胞。這樣的應(yīng)用是本發(fā)明的一種可替換的【具體實(shí)施方式】。[0150]當(dāng)本發(fā)明的抗體用于診斷目的時(shí)，共軛于可檢測(cè)部分是有用的。這樣的目的包括但不限于測(cè)定生物樣品中存在其細(xì)胞表面帶有交叉反應(yīng)KIR的NK細(xì)胞，以及檢測(cè)活生物中存在帶有交叉反應(yīng)KIR的NK細(xì)胞。這樣的測(cè)定和檢測(cè)方法也是本發(fā)明的可替換【具體實(shí)施方式】。[0151]本發(fā)明的抗體共軛于固相支撐體可用作親和純化來(lái)自如生物液的在它們的細(xì)胞表面上帶有交叉反應(yīng)KIR的NK細(xì)胞的工具。這種純化方法是本發(fā)明的另一種可替換的【具體實(shí)施方式】，作為得到的NK細(xì)胞的純化種群。[0152]在一種可替換的【具體實(shí)施方式】中，與存在于至少兩種不同的人抑制性KIR受體基因產(chǎn)物上的共同決定簇相結(jié)合的抗體可以單獨(dú)或與另一種用于靶向遞送到動(dòng)物的物質(zhì)一起結(jié)合到脂質(zhì)體(“免疫脂質(zhì)體”)中，其中所述抗體對(duì)表達(dá)本發(fā)明的所述兩種不同的人抑制性KIR受體的至少之一的NK細(xì)胞能夠中和KIR-介導(dǎo)的NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性的抑制作用，包括NKVSF1。這樣的其它物質(zhì)包括遞送用于基因治療的基因或遞送用于抑制NK細(xì)胞中基因的反義RNA、RNAi或siRNA的核酸，或用于靶向殺傷NK細(xì)胞的毒素或藥物。[0153]基于它們公布的晶體結(jié)構(gòu)，對(duì)KIR2DL1、_2和_3(KIR2DL1-3)的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的計(jì)算機(jī)模擬(Maenakaetal.(1999),Fanetal.(2001),Boyingtonetal.(2000)),預(yù)測(cè)在KIR2DL1和KIR2DL1-3交叉反應(yīng)鼠單克隆抗體DF200以及NKVSFl之間的相互作用中涉及KIR2DLU-2和-3的某些區(qū)。因而，在一種【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明提供了唯一結(jié)合于由氨基酸殘基(105，106，107，108，109，110，111，127，129，130，131，132，133，134，135，152，153，154，155，156，157，158，159，160，161，162，163，181，192)限定的區(qū)之內(nèi)的KIR2DL1的抗體。在另一種【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明提供了結(jié)合于KIR2DL1和KIR2DL2/3而不與在由殘基(105，106，107，108，109，110，111，127，129，130，131，132，133，134，135，152，153，154，155，156，157，158，159，160，161，162，163，181，192)所限定的區(qū)以外的氨基酸殘基相互作用的抗體。[0154]在另一種【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明提供了結(jié)合于KIR2DL1而不結(jié)合于KIR2DL1的其中R131是丙氨酸的突變體的抗體。[0155]在另一種【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明提供了結(jié)合于KIR2DL1而不結(jié)合于KIE2DL1的其中R157是丙氨酸的突變體的抗體。[0156]在另一種【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明提供了結(jié)合于KIR2DL1而不結(jié)合于KIE2DL1的其中R158是丙氨酸的突變體的抗體。[0157]在另一種【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明提供了結(jié)合于KIR2DL1殘基(131，157，158)的抗體。[0158]在另一種【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明提供了結(jié)合于KIR2DS3(R131W)、但不結(jié)合于野生型KIR2DS3的抗體。[0159]在另一種【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明提供了結(jié)合于KIR2DL1和KIR2DL2/3以及KIR2DS4的抗體。[0160]在另一種【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明提供了結(jié)合于KIR2DL1和KIR2DL2/3、但不結(jié)合于KIR2DS4的抗體。[0161]確定抗體是否結(jié)合在上述限定的抗原決定部位區(qū)之一以內(nèi)可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方式進(jìn)行。作為這樣的作圖/表征方法的一個(gè)實(shí)例，用于抗-KIR抗體的抗原決定部位區(qū)可以通過(guò)利用KIR2DL1或KIR2DL2/3蛋白中的暴露的胺/羧基的化學(xué)修飾的抗原決定部位“足跡法”來(lái)確定。這樣的足跡技術(shù)的一個(gè)特定的實(shí)例是使用HXMS(通過(guò)質(zhì)譜測(cè)定法檢測(cè)的氫-氘交換)，其中發(fā)生受體和配體蛋白酰胺質(zhì)子的氫/氘交換、結(jié)合、以及逆向交換，其中參與蛋白結(jié)合的主鏈酰胺基免受逆向交換，因此將仍然是氘化的。這里，相關(guān)區(qū)可以通過(guò)胃蛋白水解、快速微孔高效液相色譜分離、和/或電噴射電離質(zhì)譜測(cè)定法加以鑒定。參見，例如，EhringH,AnalyticalBiochemistry,Vol.267(2)pp.252-259(1999)和/或Engen，J.R.和Smith,D.L.(2001)Anal.Chem.73，256A-265A。適宜的抗原決定部位鑒定技術(shù)的另一個(gè)實(shí)例是核磁共振(NMR)抗原決定部位作圖，其中通常比較在二維NMR譜中游離抗原和與抗原結(jié)合肽(如抗體)復(fù)合的抗原的信號(hào)位置?？乖ǔＳ?5N選擇性地進(jìn)行同位素標(biāo)記，以致在NMR譜中僅看到對(duì)應(yīng)于抗原的信號(hào)而看不到來(lái)自抗原結(jié)合肽的信號(hào)。起源于氨基酸(涉及與抗原結(jié)合肽的相互作用)的抗原信號(hào)在復(fù)合物的譜中與游離抗原的譜相比通常將移動(dòng)位置，因而用這種方式可以鑒定涉及結(jié)合的氨基酸。參見，例如，ErnstScheringResFoundWorkshop.2004;(44):149-67;Huangetal,JournalofMolecularBiology,Vol.281(I)pp.61-67(1998);以及Satio和Patterson,Methods.1996Jun;9(3):516-24。[0162]抗原決定部位作圖/表征也可以利用質(zhì)譜測(cè)定法來(lái)進(jìn)行。參見，例如，Downward,JMassSpectrom.2000Apr;35(4):493-503以及Kiselar和Downard,AnalChem.1999Mayl;71(9):1792-801。[0163]蛋白酶消化技術(shù)也可以用于抗原決定部位作圖和鑒定。抗原決定簇相關(guān)區(qū)/序列可以通過(guò)蛋白酶消化加以確定，例如，利用胰蛋白酶與KIR2DL1或KIR2DL2/3按約1:50比率在37°C以及pH7-8下進(jìn)行消化，接著通過(guò)用于肽鑒定的質(zhì)譜測(cè)定法(MS)進(jìn)行分析。由抗KIR粘合劑保護(hù)而免受胰蛋白酶斷裂的肽可以隨后通過(guò)將經(jīng)受胰蛋白酶消化的樣品和用抗體孵育、然后再經(jīng)受例如胰蛋白酶消化的樣品進(jìn)行比較來(lái)加以鑒定(從而揭示粘合劑的足跡)。其它酶如胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶等也可以或可替換地用于類似的抗原決定部位表征方法中。并且，酶消化可以提供快速方法，用來(lái)在未表面暴露的抗KIR多肽的范圍內(nèi)分析一個(gè)潛在的抗原決定簇序列是否在KIR2DL1的區(qū)內(nèi)，因而就免疫原性/抗原性而言最可能不相關(guān)。對(duì)于類似技術(shù)的討論，參見，例如，Manca,Ann1stSuperSanita.1991;27(I):15-9。[0164]與食蟹猴的交叉反應(yīng)度[0165]已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，抗體NKVSFl也結(jié)合于來(lái)自食蟹猴的NK細(xì)胞，參見實(shí)施例7。因此本發(fā)明提供了一種抗體、以及其片段和衍生物，其中所述抗體、片段或衍生物與在人NK細(xì)胞表面的至少兩種抑制性人KIR受體進(jìn)行交叉反應(yīng)，而且此外它還與來(lái)自食蟹猴的NK細(xì)胞相結(jié)合。在關(guān)于此的一【具體實(shí)施方式】中，該抗體不是抗體NKVSFl。本發(fā)明還提供了一種抗體、以及其片段和衍生物的毒性的試驗(yàn)方法，其中所述抗體、片段或衍生物與在人NK細(xì)胞表面的至少兩種抑制性人KIR受體進(jìn)行交叉反應(yīng)，其中該方法包括試驗(yàn)在食蟹猴體內(nèi)的抗體。[0166]鉬合物和給藥[0167]本發(fā)明還提供了藥物組合物，包括一種抗體、以及其片段和衍生物，其中所述抗體、片段或衍生物與在NK細(xì)胞表面的至少兩種抑制性KIR受體進(jìn)行交叉反應(yīng)，并且在患者體內(nèi)或在包括NK細(xì)胞的生物樣品中以任何適宜的載體和可檢測(cè)地增強(qiáng)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性的有效量來(lái)中和它們的抑制信號(hào)并增強(qiáng)那些細(xì)胞的活性。該組合物進(jìn)一步包括藥用可接受的載體。這樣的組合物也稱作“本發(fā)明的抗體組合物”。在一【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明的抗體組合物包括在上述的抗體【具體實(shí)施方式】中所披露的抗體?？贵wNKVSFl包括在可以存在于本發(fā)明的抗體組合物中的抗體的范圍內(nèi)。[0168]如在本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“生物樣品”包括但不限于生物液(例如血清、淋巴液、血液)、細(xì)胞樣品或組織樣品(例如骨髓)。[0169]可以在這些組合物中使用的藥用可接受載體包括但不限于:離子交換劑，氧化鋁，硬脂酸鋁，卵磷脂，血清蛋白，如人清血白蛋白，緩沖物質(zhì)如磷酸鹽，甘氨酸，山梨酸，山梨酸鉀，飽和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物，水，鹽或電解質(zhì)，如硫酸魚精蛋白，磷酸氫二鈉，磷酸氫鉀，氯化鈉，鋅鹽，膠體二氧化硅，三硅酸鎂，聚乙烯吡咯烷酮，纖維素基物質(zhì)，聚乙二醇，羧甲基纖維素鈉，聚丙烯酸酯，蠟，聚乙烯-聚氧化丙烯嵌段聚合物，聚乙二醇以及羊毛脂。[0170]本發(fā)明的組合物可以用于增強(qiáng)患者或生物樣品中的NK細(xì)胞活性的方法中。該方法包括用所述組合物與所述患者或生物樣品接觸的步驟。這樣的方法將可用于診斷和治療目的。[0171]為了與生物樣品一起使用，可以通過(guò)與樣品簡(jiǎn)單混合或直接施加于該樣品來(lái)給予抗體組合物，其取決于樣品的特性(液體或固體)。生物樣品可以與在任何適宜裝置(平板、囊、瓶等)中的抗體直接接觸。為了與患者一起使用，該組合物必須加以配制以便為患者給藥。[0172]本發(fā)明的組合物可以通過(guò)下述方式給藥:口服、腸胃外、通過(guò)吸入噴霧、局部、直腸、鼻、口頰、陰道或經(jīng)過(guò)植入的貯存器。如在本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“腸胃外”包括皮下，靜脈內(nèi)，肌內(nèi)，關(guān)節(jié)內(nèi)，滑膜內(nèi)，胸內(nèi)，鞘內(nèi)，肝內(nèi)，病灶內(nèi)及顱內(nèi)注射或輸注技術(shù)。優(yōu)選地，這些組合物是通過(guò)口服、腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)來(lái)給藥。[0173]本發(fā)明的組合物的無(wú)菌可注射形式可以是水性或油性懸浮液。根據(jù)本領(lǐng)域已知的技術(shù)，并使用適宜的分散劑或濕潤(rùn)劑及懸浮劑就可以配制這些懸浮液。無(wú)菌可注射制劑也可以是在非毒性的腸胃外可接受稀釋劑或溶劑中的無(wú)菌可注射溶液或懸浮液，例如作為在1，3-丁二醇中的溶液。在可以采用的可接受載體和溶劑當(dāng)中有水、林格氏液以及等滲氯化鈉溶液。此外，無(wú)菌的不揮發(fā)油按常規(guī)用作溶劑或懸浮介質(zhì)。為此目的，可以采用任何刺激性小的不揮發(fā)油，包括合成的單甘油酯或甘油二酯。脂肪酸，如油酸及其甘油酯衍生物可用于可注射物的制備，同樣有天然藥用可接受的油，如橄欖油或蓖麻油，尤其是以它們的聚氧乙基化形式。這些油溶液或懸浮液也可以包含長(zhǎng)鏈醇稀釋劑或分散劑，如羧甲基纖維素或類似的分散劑，其通常用于配制包括乳劑和混懸劑的藥用可接受劑型。其它通常使用的表面活性劑，如吐溫，司盤及其它乳化劑或通常用于制造藥用固體、液體、或其它劑型的生物利用度增強(qiáng)劑也可以用于配制的目的。[0174]本發(fā)明的組合物可以用任何口服可接受劑型口服給藥，所述劑型包括但不限于膠囊劑、片劑、水性混懸劑或溶液。在用于口服的片劑的情況下，通常使用的載體包括乳糖和玉米淀粉。通常還加入潤(rùn)滑劑，如硬脂酸鎂。對(duì)于以膠囊劑形式進(jìn)行的口服給藥，有用的稀釋劑包括乳糖和干燥的玉米淀粉。當(dāng)需要水性混懸劑用于口服時(shí)，活性組分則和乳化劑和懸浮劑結(jié)合。如果需要的話，也可以加入某些甜味劑、香味劑或著色劑。[0175]可替換地，本發(fā)明的組合物可以用栓劑的形式給藥，用于直腸給藥。這些栓劑可以通過(guò)將藥劑和適宜的非刺激性賦形劑進(jìn)行混合來(lái)加以制備，其中賦形劑在室溫下是固體但在直腸溫度下是液體，因此將在直腸中熔化以釋放藥物。這樣的物質(zhì)包括可可脂、蜂蠟及聚乙二醇。[0176]本發(fā)明的組合物也可以局部給藥，尤其當(dāng)治療的靶標(biāo)包括通過(guò)局部施加容易達(dá)到的區(qū)域或器官時(shí)，包括眼、皮膚、或下腸道的疾病。對(duì)于這些區(qū)域或器官適宜的局部劑型很各易制備。[0177]用于下腸道的局部應(yīng)用可以用直腸栓劑劑型(參見上述)或以適宜的灌腸劑劑型進(jìn)行。也可以使用局部透皮貼劑。[0178]對(duì)于局部應(yīng)用，這些組合物可以配制在適宜的懸浮或溶解在一種或多種載體中的含有活性成分的軟膏劑中。本發(fā)明化合物局部給藥的載體包括但不限于:礦物油、液態(tài)石蠟、白礦蠟、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯化合物、乳化蠟以及水?？商鎿Q地，這些組合物可以配制在適宜的懸浮或溶解在一種或多種藥用載體中的含有活性成分的洗液或乳膏中。適宜的載體包括但不限于礦物油、失水山梨糖醇單硬脂酸酯、聚山梨酸酯60、十六烷基酯蠟、十六/十八醇(cetearylalcohol)、2_辛基十二燒醇、苯甲醇以及水。[0179]對(duì)于眼科使用，這些組合物可以配制成在等滲、pH調(diào)節(jié)的無(wú)菌鹽水中的微粉化懸浮液，或優(yōu)選地，配制成在等滲、PH調(diào)節(jié)的無(wú)菌鹽水中的溶液，其中含有或不含有防腐劑如苯扎氯銨(benzylalkoniumchloride)。可替換地,對(duì)于眼科使用，這些組合物可以配制在油膏如凡士林中。[0180]本發(fā)明的組合物也可以通過(guò)鼻氣霧劑或吸入劑給藥。這樣的組合物是根據(jù)藥劑劑型【
技術(shù)領(lǐng)域：
】中熟知的技術(shù)加以制備的，并且可以制備成鹽水溶液，其中采用苯甲醇或其它適宜的防腐劑、用以增強(qiáng)生物利用度的吸收促進(jìn)劑、碳氟化合物、和/或其它常規(guī)的增溶劑或分散劑。[0181]數(shù)種單克隆抗體已經(jīng)表明在臨床狀況下是有效的，如美羅華(Rituxan)(利妥昔單抗,Rituximab)、赫斯汀(Herceptin)(曲妥珠單抗,Trastuzumab)或Xolair(奧馬佐單抗，Omalizumab)，并且類似的給藥方案(B卩，劑型和/或劑量和/或給藥程序)可以和本發(fā)明的抗體一起使用。本發(fā)明藥物組合物中抗體的給藥時(shí)間進(jìn)程和劑量可以按照用于這些產(chǎn)品的已知方法加以確定，例如利用制造商的說(shuō)明書。例如，存在于本發(fā)明藥物組合物中的抗體可以用10mg/mL的濃度在IOOmg(IOmL)或500mg(50mL)的單次使用小瓶中供藥。產(chǎn)品是配制在9.0mg/mL氯化鈉、7.35mg/mL檸檬酸鈉二水合物、0.7mg/mL聚山梨酸酯80、以及注射用滅菌水中，用于IV給藥。pH被調(diào)節(jié)到6.5。用于本發(fā)明的藥物組合物中的抗體的典型的適宜劑量范圍可以是在約10mg/m2和500mg/m2之間。然而,應(yīng)當(dāng)明了，這些規(guī)范是示范性的，并且考慮到在藥物組合物中的特定抗體的親和力和可耐受性(其必須用臨床試驗(yàn)確定)，可以采用最佳的規(guī)范和方案。在本發(fā)明的藥物組合物中使NK細(xì)胞飽和24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)或一周或一個(gè)月的抗體的注射量和時(shí)間進(jìn)程，將鑒于抗體的親和力以及其藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)來(lái)加以確定。[0182]根據(jù)另一種【具體實(shí)施方式】，本發(fā)明的抗體組合物可以進(jìn)一步包括另一種治療藥劑，該藥劑包括通常用于特定治療目的(為其給予該抗體)的藥劑。該另外的治療藥劑將通常以一定量存在于組合物中，所述量通常是在單藥治療中對(duì)于要治療的特定疾病或病情所使用的量。這樣的治療藥劑包括但不限于:用于治療癌癥的治療藥劑、用來(lái)治療傳染性疾病的治療藥劑、用于其它免疫療法的治療藥劑、細(xì)胞因子(如白介素-2或白介素-15)、其它抗體及其它抗體的片段。[0183]例如，多種治療藥劑可用于治療癌癥。本發(fā)明的抗體組合物和方法可以和任何通常用于治療特定的疾病，尤其是腫瘤、癌癥、或患者呈現(xiàn)的其它疾病或障礙的其它方法結(jié)合。只要特定的治療方式對(duì)患者狀態(tài)本身不是已知有害，以及不顯著地抵消本發(fā)明的藥物組合物中的抗體的活性，則可以設(shè)想其與本發(fā)明的結(jié)合。[0184]有關(guān)實(shí)體腫瘤治療，本發(fā)明的藥物組合物可以與經(jīng)典的方式聯(lián)合在一起加以使用，如外科手術(shù)、放射療法、化學(xué)療法等等。因此本發(fā)明提供了綜合治療，其中本發(fā)明的藥物組合物和外科手術(shù)或放射治療同時(shí)使用、在外科手術(shù)或放射治療之前或之后使用；或與常規(guī)化療藥物、放射治療藥劑或抗血管形成劑、或靶向免疫毒素或凝血配基(coaguligands)同時(shí)、之前、或之后給予患者。[0185]當(dāng)在治療方案中一種或多種藥劑與本發(fā)明的含有抗體的組合物聯(lián)合使用時(shí)，并不要求聯(lián)合用藥的結(jié)果是當(dāng)分開進(jìn)行每種治療時(shí)所觀察到的效應(yīng)的相加。雖然一般希望至少為相加效應(yīng)，但任何高于單項(xiàng)治療的抗癌效應(yīng)的增加都將是有益的。此外，并不特定要求綜合治療呈現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)，雖然這無(wú)疑是可能的和有利的。[0186]為了實(shí)施綜合抗癌治療，可以用在動(dòng)物體內(nèi)有效導(dǎo)致它們的聯(lián)合抗癌作用的方式，簡(jiǎn)單地將本發(fā)明的抗體組合物連同另一種抗癌藥劑給予動(dòng)物。因此，將提供有效量的所述藥劑以及一段有效的時(shí)間用以導(dǎo)致它們?cè)谀[瘤脈管系統(tǒng)中的聯(lián)合存在以及它們?cè)谀[瘤環(huán)境中的聯(lián)合作用。為了達(dá)到此目的，本發(fā)明的抗體組合物和抗癌藥劑可以同時(shí)給予動(dòng)物，既可用單一的聯(lián)合組合物，或利用不同給藥途徑作為兩種性質(zhì)不同的組合物。[0187]可替換地，本發(fā)明的抗體組合物的給藥可以在抗癌藥劑治療之前或以后，間隔范圍，例如，為數(shù)分鐘至數(shù)周以及數(shù)月。應(yīng)當(dāng)確保，抗癌藥劑和本發(fā)明的抗體組合物中的抗體對(duì)癌癥施加有利的聯(lián)合效應(yīng)。[0188]在抗血管形成治療中，大多數(shù)抗癌藥劑是在給予本發(fā)明的抑制性KIR抗體組合物以前給藥。然而，當(dāng)在本發(fā)明的抗體組合物中使用抗體的免疫連接物時(shí)，則可以同時(shí)或連續(xù)給予各種抗癌藥劑。[0189]在一些情況下，甚至可以希望顯著延長(zhǎng)治療時(shí)間，其中在相應(yīng)的給予抗癌藥劑或抗癌治療與給予本發(fā)明的抗體組合物之間間隔數(shù)天(2，3，4，5，6或7)、數(shù)周(1，2，3，4，5，6，7或8)或甚至數(shù)月(1，2，3，4，5，6，7或8)。這在下述情況下是有利的:抗癌治療是用來(lái)實(shí)質(zhì)上破壞腫瘤，如外科手術(shù)或化學(xué)治療，而給予本發(fā)明的抗體組合物是用來(lái)防止微轉(zhuǎn)移或腫瘤再生長(zhǎng)。[0190]還可以預(yù)期，利用本發(fā)明的抑制性KIR抗體基組合物或抗癌藥劑時(shí)將會(huì)多于一次給藥。基于交替的數(shù)天或數(shù)周，可以可互換地給予這些藥劑；或在用本發(fā)明的抑制性KIR抗體組合物進(jìn)行的治療周期以后進(jìn)行抗癌藥劑治療周期。在任何情況下，為了利用綜合治療達(dá)到腫瘤消退，全部的需要就是以一個(gè)聯(lián)合有效量遞送兩種藥劑，以施加抗腫瘤效應(yīng)，無(wú)論給藥時(shí)間如何。[0191]就外科手術(shù)而論，可以與本發(fā)明結(jié)合實(shí)施任何外科介入。在放射治療方面，可以設(shè)想在癌細(xì)胞內(nèi)局部誘導(dǎo)DNA損傷的任何機(jī)制，如Y-輻照、X-射線、紫外線輻照、微波以及甚至電子發(fā)射等等。也可以設(shè)想向癌細(xì)胞定向遞送放射性同位素，并且這可以連同靶向抗體或其它祀向方式一同使用。[0192]在其它方面，可以與本發(fā)明的抗體組合物結(jié)合或作為本發(fā)明的抗體組合物的一部分給予免疫調(diào)節(jié)化合物或攝入。免疫調(diào)節(jié)化合物的優(yōu)選實(shí)例包括細(xì)胞因子。在這樣的聯(lián)合方式中可以采用各種細(xì)胞因子。可用于由本發(fā)明設(shè)想的聯(lián)合中的細(xì)胞因子的實(shí)例包括白介素-1α、白介素-1β、白介素_2、白介素-3、白介素_4、白介素-5、白介素_6、白介素_7、白介素_8、白介素_9、白介素-10、白介素-11、白介素-12、白介素-13、白介素-15、白介素-21、TGF-β、GM-CSF、M-CSF、G-CSF、TNF-α、TNF-β、LAF、TCGF、BCGF、TRF、BAF、BDG、MP、LIF、OSM、TMF、TOGF、a-干擾素、β-干擾素、Y-干擾素。在本發(fā)明的聯(lián)合治療或組合物中使用的細(xì)胞因子是按照標(biāo)準(zhǔn)方案給藥的，并符合臨床指征如患者狀態(tài)和細(xì)胞因子的相對(duì)毒性。[0193]在一些【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明的包括交叉反應(yīng)抑制性KIR抗體的治療組合物可以與化療藥物或激素藥劑聯(lián)合給藥，或可以進(jìn)一步包括化療藥物或激素藥劑。在本文披露的聯(lián)合治療方法中可以使用各種激素治療藥劑和化療藥物。設(shè)想為示范性的化療藥物包括但不限于烷化劑，抗代謝藥，細(xì)胞毒抗生素，長(zhǎng)春花生物堿，例如，阿霉素，更生霉素，絲裂霉素，洋紅霉素(去甲柔紅霉素)，道諾霉素，多柔比星(多索魯比辛)，他莫昔芬，紫杉酚(泰素)，泰索帝，長(zhǎng)春新堿，長(zhǎng)春堿，長(zhǎng)春瑞賓，依托泊苷(VP-16)，5-氟尿嘧啶(5FU)，阿糖胞苷，環(huán)磷酰胺，噻替派，甲氨蝶呤，喜樹堿，放線菌素-D、絲裂霉素C、順鉬(CDDP)、氨基蝶呤，康布瑞塔卡汀(考布他汀)，以及其衍生物和前藥。[0194]激素藥物包括但不限于，例如，LHRH促效劑如亮丙瑞林、戈舍瑞林、曲普瑞林、以及布舍瑞林；抗雌激素藥物如他莫昔芬和托瑞米芬；抗雄激素藥物如氟他胺、尼魯?shù)仄?、環(huán)丙孕酮以及比卡魯胺；芳香酶抑制劑如阿那曲唑、依西美坦、來(lái)曲唑以及法倔唑；以及孕激素如甲輕孕酮(medroxy)、氯地孕酮以及甲地孕酮。[0195]如本領(lǐng)域技術(shù)人員所明了的，化療藥物的適當(dāng)劑量將接近那些已經(jīng)在臨床治療中采用的劑量，其中該化療藥物單獨(dú)或與其它化療藥物聯(lián)合給藥。僅就舉例而言，可以使用藥劑如順鉬，以及其它烷化DNA。順鉬已經(jīng)被廣泛用來(lái)治療癌癥，其中在臨床應(yīng)用中所用的有效劑量為20mg/m2，每3周5天，總共三個(gè)療程。順鉬口服不吸收，因此必須經(jīng)過(guò)靜脈、皮下、腫瘤內(nèi)或腹膜內(nèi)注射來(lái)遞送。[0196]另外有用的化療藥物包括那些干擾DNA復(fù)制、有絲分裂和染色體分離的化合物，以及那些中斷多核苷酸前體的合成和重現(xiàn)性的藥劑。用于綜合治療的多種典型的化療藥物列在美國(guó)專利第6，524，583號(hào)的表C中，將其所披露的藥劑和適應(yīng)癥以引用方式結(jié)合于本文中。列出的每一種藥劑是示范性的和非限制性的。本領(lǐng)域技術(shù)人員被“Remington’sPharmaceuticalSciences”第15版,第33章,尤其是624-652頁(yè)所教導(dǎo)。取決于要治療的病情，可以改變劑量。實(shí)施治療的醫(yī)師將能夠?yàn)閭€(gè)別受治療者確定適當(dāng)?shù)膭┝俊0197]本發(fā)明的交叉反應(yīng)抑制性KIR抗體組合物可以與任何一種或多種其它抗血管形成療法聯(lián)合使用，或可以進(jìn)一步包括抗血管形成劑。這樣藥劑的實(shí)例包括中和抗體、反義RNA、siRNA、RNA1、RNA適體以及核酶，將每種制劑對(duì)準(zhǔn)VEGF或VEGF受體(美國(guó)專利第6，524，583號(hào)，將其披露的內(nèi)容以引用方式結(jié)合于本文中)。如在W098/16551中所描述的，也可以采用具有拮抗性能的VEGF的變異體，將其內(nèi)容以引用方式結(jié)合于本文中。可連同綜合治療使用的另外的典型抗血管形成劑列在美國(guó)專利第6，524，583號(hào)的表D中，將其所披露的藥劑和適應(yīng)癥特別以引用方式結(jié)合于本文中。[0198]本發(fā)明的抑制性KIR抗體組合物也可以有利地與誘導(dǎo)凋亡的方法一起聯(lián)合使用，或者也可以包括凋亡劑。例如，已經(jīng)鑒定了多種抑制凋亡、或程序性細(xì)胞死亡的癌基因。在此種類中的典型的癌基因包括但不限于:bcr-abl，bcl-2(不同于bcl_l、細(xì)胞周期蛋白Dl；基因庫(kù)訪問號(hào)碼M14745，X06487;美國(guó)專利第5，650,491號(hào)以及第5，539，094號(hào)；將每一個(gè)以引用方式結(jié)合于本文中)以及家族成員，其包括Bcl-Xl、Mcl-l、Bak、Al、W&A20。首先在T細(xì)胞淋巴瘤中發(fā)現(xiàn)了bcl-2的過(guò)表達(dá)。癌基因bcl-2通過(guò)結(jié)合和滅活Bax，一種在凋亡途徑中的蛋白質(zhì)，而起作用。bcl-2功能的抑制可防止Bax的失活，并使凋亡途徑能夠繼續(xù)進(jìn)行。這類癌基因的抑制，例如，可以預(yù)期利用反義核苷酸序列、RNA1、siRNA或小分子化合物供本發(fā)明之用以增強(qiáng)凋亡(美國(guó)專利第5，650，491號(hào)、第5，539，094號(hào)、以及第5，583，034號(hào)，將其每一個(gè)以引用方式結(jié)合于本文中)。[0199]本發(fā)明的抑制性KIR抗體組合物也可以包括或與一些分子聯(lián)合使用，其中所述分子包括靶向部分，例如，抗體、配體、或其軛合物，其指向靶細(xì)胞的特異性標(biāo)記物(“靶向劑”)，例如靶腫瘤細(xì)胞。一般來(lái)說(shuō)，供本發(fā)明的這些另外方面之用的靶向劑將優(yōu)選識(shí)別易接近的腫瘤抗原，這些腫瘤抗原優(yōu)先地、或特異性地表達(dá)在腫瘤部位。通常該靶向劑將結(jié)合于腫瘤細(xì)胞的表面表達(dá)成分、表面可及成分或表面定域成分。這些靶向劑還將優(yōu)選呈現(xiàn)較高親和力的性能；并且將不會(huì)對(duì)維持生命的正常組織在體內(nèi)施加顯著的副作用，如選自下述的一種或多種組織:心臟、腎、腦、肝、骨髓、結(jié)腸、胸、前列腺、甲狀腺、膽囊、肺、腎上腺、肌肉、神經(jīng)纖維、胰、皮膚、或人體中的其它維持生命的器官或組織。如在本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“不施加顯著的副作用”是指以下事實(shí):當(dāng)在體內(nèi)給藥時(shí)，靶向劑將僅產(chǎn)生可忽略的或臨床上易處理的副作用，如那些通常在化療期間遇到的副作用。[0200]在治療腫瘤時(shí)，本發(fā)明的抗體組合物可以另外包括或可以與附加化合物聯(lián)合使用。附加化合物可以包括例如鎮(zhèn)吐藥如血清素拮抗劑和治療藥如吩噻嗪，取代的苯甲酰胺，抗組胺，丁酰苯，皮質(zhì)類固醇，苯并二氮雜草類，以及大麻素；二磷酸鹽如唑來(lái)膦酸和帕米膦酸；以及造血生長(zhǎng)因子如紅細(xì)胞生成素和G-CSF，例如非格司亭、來(lái)格司亭以及達(dá)貝泊汀(darbepoietin,促紅細(xì)胞生成刺激蛋白)。[0201]在另一種【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明的具有不同交叉反應(yīng)度的兩種或更多種抗體(包括NKVSFl)可以結(jié)合在單個(gè)組合物中，以便中和盡可能多的抑制性KIR基因產(chǎn)物的抑制效應(yīng)。包括結(jié)合本發(fā)明的交叉反應(yīng)抑制性KIR抗體、或其片段或衍生物的組合物將允許進(jìn)行甚至更廣泛的應(yīng)用，因?yàn)榭赡艽嬖谛“俜直鹊娜巳?，其可能缺乏由單一交叉反?yīng)抗體識(shí)別的每一種抑制性KIR基因產(chǎn)物。類似地，本發(fā)明的抗體組合物可以進(jìn)一步包括一種或多種抗體，這些抗體識(shí)別單一抑制性KIR亞型。這樣的結(jié)合將再次提供在治療調(diào)整中的更廣泛的應(yīng)用。[0202]本發(fā)明還提供了為有需要的患者增強(qiáng)NK細(xì)胞活性的方法，該方法包括將根據(jù)本發(fā)明的組合物給予所述患者的步驟。該方法更具體地涉及在患有疾病(其中增加的NK細(xì)胞活性是有益的)的患者中增加NK細(xì)胞活性，其涉及、影響或由對(duì)由NK細(xì)胞進(jìn)行的溶解敏感的細(xì)胞所引起，或其由不足的NK細(xì)胞活性所引起或特點(diǎn)在于NK細(xì)胞活性不足，如癌癥、另一種增生性病癥、傳染性疾病或免疫性疾病。更具體地說(shuō)，本發(fā)明的方法用于治療各種癌癥以及其它增生性病癥，其包括但不限于:癌，包括膀胱癌，乳房癌，結(jié)腸癌，腎癌，肝癌，肺癌，卵巢癌，前列腺癌，胰癌，胃癌，頸癌，甲狀腺癌以及皮膚癌，包括鱗狀細(xì)胞癌；淋巴樣譜系的造血腫瘤，包括白血病，急性淋巴細(xì)胞白血病，急性成淋巴細(xì)胞白血病，B細(xì)胞淋巴瘤，T細(xì)胞淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，多毛細(xì)胞淋巴瘤以及伯基特淋巴瘤(Burkittslymphoma);骨髓樣譜系的造血腫瘤，包括急性和慢性髓細(xì)胞源性白血病以及前髓細(xì)胞白血病；間充質(zhì)起源的腫瘤，包括纖維肉瘤和橫紋肌肉瘤；其它腫瘤，包括黑色素瘤，精原細(xì)胞瘤，畸胎癌，成神經(jīng)細(xì)胞瘤以及膠質(zhì)瘤；中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤，包括星形細(xì)胞瘤，成神經(jīng)細(xì)胞瘤，膠質(zhì)瘤，以及神經(jīng)鞘瘤(施萬(wàn)鞘瘤)；間充質(zhì)起源的腫瘤，包括纖維肉瘤，橫紋肌肉瘤，以及骨肉瘤；以及其它腫瘤，包括黑色素瘤，著色性干皮病，角化棘皮瘤，精原細(xì)胞瘤，甲狀腺濾泡性癌以及畸胎癌。[0203]根據(jù)本發(fā)明可以治療的優(yōu)選病癥包括:淋巴樣譜系的造血腫瘤,例如T細(xì)胞和B細(xì)胞腫瘤，包括但不限于T細(xì)胞病癥如T前淋巴細(xì)胞白血病(T-PLL)，包括小細(xì)胞和腦樣細(xì)胞型；優(yōu)選T細(xì)胞型的大顆粒淋巴細(xì)胞白血病(LGL);塞澤里綜合征(SS);成人T細(xì)胞白血病淋巴瘤(ATLL)；a/dT-NHL肝脾淋巴瘤；周圍/后胸腺T細(xì)胞淋巴瘤(多形和成免疫細(xì)胞亞型)；血管成免疫細(xì)胞T細(xì)胞淋巴瘤；血管源性(鼻)T細(xì)胞淋巴瘤；間變性(退行性)(Kil+)大細(xì)胞淋巴瘤；腸T細(xì)胞淋巴瘤；T成淋巴細(xì)胞；以及淋巴瘤/白血病(T-Lbly/T-ALL)。[0204]根據(jù)本發(fā)明也可以治療其它增生性病癥，包括例如增生，纖維化(尤其是肺纖維化，而且其它類型的纖維化如腎纖維化)，血管發(fā)生，銀屑病，血管中的動(dòng)脈粥樣硬化和平滑肌增生，如狹窄或血管成形術(shù)以后的再狹窄。[0205]本發(fā)明的交叉反應(yīng)抑制性KIR抗體可以用來(lái)治療或預(yù)防傳染性疾病，優(yōu)選包括由病毒、細(xì)菌、原生動(dòng)物、霉菌或真菌引起的任何感染。這樣的病毒傳染性生物包括但不限于:甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、流行性感冒、水痘、腺病毒、單純皰疹病毒I型(HSV-1)、單純皰疹病毒II型(HSV-2)、牛瘟、鼻病毒、艾柯病毒、輪狀病毒、呼吸道合胞病毒、乳頭狀瘤病毒、乳頭狀瘤病毒、巨細(xì)胞病毒、棘病毒(echinovirus)、蟲媒病毒、huntavirus、柯薩奇病毒、流行性腮腺炎病毒、麻疹病毒、風(fēng)疹病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒以及人免疫缺陷病毒I型或[0206]根據(jù)本發(fā)明可以治療的細(xì)菌性感染包括但不限于由下述引起的感染:葡萄球菌屬；鏈球菌屬，包括化膿鏈球菌；腸球菌(Enterococcl);桿菌屬，包括炭疽桿菌；乳酸桿菌屬；利斯特桿菌屬；白喉棒狀桿菌；加德納氏菌屬，包括陰道加德納氏菌；諾卡氏菌屬；鏈霉菌屬；普通高溫放線菌；密螺旋體屬；螺旋體屬(Treponerna);假單胞菌屬，包括Raeruginosa;軍團(tuán)菌屬；奈瑟菌屬，包括淋病奈瑟菌和腦膜炎奈瑟菌；黃桿菌屬，包括腦膜膿毒性黃桿菌和芳香黃桿菌；布魯氏菌屬；博德特氏桿菌屬，包括百日咳博德特氏菌和支氣管敗血性博德特氏菌；埃希氏菌屬，包括大腸埃希氏菌；克雷白氏菌屬；腸桿菌屬；沙雷氏菌屬，包括粘質(zhì)沙雷氏菌和液化沙雷氏菌；愛德華菌屬；變形桿菌屬，包括奇異變形桿菌和普通變形桿菌；鏈桿菌屬；立克次體科,包括立氏立克次體(R.rickettsii);衣原體屬，包括鸚鵡熱衣原體和沙眼衣原體；分枝桿菌屬，包括結(jié)核分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌(M.fortuitum)、麻風(fēng)分枝桿菌(M.leprae)、鳥分枝桿菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、以及鼠麻風(fēng)分枝桿菌；以及諾卡氏菌屬。[0207]根據(jù)本發(fā)明可以治療的原生動(dòng)物感染包括但不限于由利什曼原蟲、kokzidioa、以及錐蟲屬引起的感染。在疾病控制中心(CDC)的傳染病國(guó)家中心(NCID)的萬(wàn)維網(wǎng)站(http://www.cdc.gov/ncidod/diseases/),可以找到傳染病的完整清單,將該清單以引用方式結(jié)合于本文中。所有所述疾病都是利用本發(fā)明的交叉反應(yīng)抑制性KIR抗體進(jìn)行治療的候選疾病。[0208]這樣的治療各種傳染性疾病的方法可以采用本發(fā)明的抗體組合物，單獨(dú)或與已知用于治療這樣的疾病的其它治療和/或治療藥劑聯(lián)合使用，包括抗病毒藥、抗真菌藥、抗菌藥、抗生素、抗寄生蟲藥以及抗原蟲藥。當(dāng)這些方法涉及用另外的治療藥劑進(jìn)行另外的治療時(shí)，那些藥劑可以作為單劑型或作為分開的多劑型與本發(fā)明的抗體一起給藥。當(dāng)作為分開的劑型給藥時(shí)，另外的藥劑可以在給予本發(fā)明的抗體以前、同時(shí)、或以后給藥。[0209]本發(fā)明的另外方面和優(yōu)點(diǎn)將在以下的實(shí)驗(yàn)部分加以披露，其應(yīng)被認(rèn)為是說(shuō)明性的而不限制本申請(qǐng)的保護(hù)范圍。[0210]實(shí)施例1[0211]PBL的純化以及多克隆或克隆NK細(xì)胞系的產(chǎn)生[0212]借助FicollHypaque梯度和排除可塑粘附細(xì)胞，PBL衍生自健康供體。為了獲得富集的NK細(xì)胞，用抗⑶3、抗⑶4以及抗HLA-DR單克隆抗體(在4°C下30分鐘)，接著用山羊抗鼠磁珠(Dynal)(在4°C下30分鐘)對(duì)PBL進(jìn)行溫育，然后用本【
技術(shù)領(lǐng)域：
】已知的方法進(jìn)行免疫磁性選擇(Pendeetal.，1999)。在照射喂養(yǎng)細(xì)胞和100U/ml白介素2(普羅留因，Chiron公司)以及1.5ng/ml植物血凝素A(GibcoBRL)上培養(yǎng)CD3—、CD4—、DR—細(xì)胞，以獲得多克隆NK細(xì)胞種群。通過(guò)限制稀釋克隆了NK細(xì)胞，并且NK細(xì)胞的克隆通過(guò)用于細(xì)胞表面受體表達(dá)的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法來(lái)表征。[0213]使用的單克隆抗體是JT3A(IgG2a，抗CD3)、EB6和GL183(分別為IgGl抗KIR2DL1和KIR2DL3)、XA-141IgM(抗KIR2DL1，具有和EB6相同的特異性)、抗CD4(HP2.6)以及抗DR(D1.12,IgG2a)?？梢允褂每缮虡I(yè)獲得的具有相同特異性的單克隆抗體(BeckmanCoulter公司，F(xiàn)ullerton,CA)代替由本申請(qǐng)人:制備的JT3A、HP2.6、以及DRl.12AB6和GL183可商業(yè)獲得(BeckmanCoulter公司，F(xiàn)ullerton,CA)。XA-141不能商業(yè)獲得，但EB6如在(Morettaetal.，1993)中所描述的可以用于溶解的對(duì)照重構(gòu)。[0214]用適宜的抗體(在4°C下30分鐘)、接著用PE或FITC共軛的多克隆抗鼠抗體(SouthernBiotechnologyAssociatesInc)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。用FACSAN儀器(BectonDickinson,MountainView,CA)并通過(guò)細(xì)胞突光測(cè)定分析對(duì)樣品進(jìn)行分析。[0215]下述克隆用于本研究中。CP11、CN5以及CN505是KIR2DL1陽(yáng)性克隆并且用EB6(IgGl抗KIR2DL1)或XA-141(IgM抗KIR2DL1，和EB6抗體相比其具有相同的特異性)加以染色。CN12和CP502是KIR2DL3陽(yáng)性克隆，并且用GL183抗體(IgGl抗KIR2DL3)進(jìn)行染色。[0216]NK克隆的細(xì)胞溶解活性是通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)4小時(shí)51Cr釋放測(cè)定來(lái)評(píng)估的，其中用Cw3或Cw4陽(yáng)性細(xì)胞系(因其對(duì)NK細(xì)胞溶解的敏感性而眾所周知)對(duì)效應(yīng)物NK細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。在微量滴定板中以5000個(gè)細(xì)胞/孔使用所有的靶標(biāo)，并且效應(yīng)物:靶的比率表示在圖中(通常為4效應(yīng)物/靶細(xì)胞)。在有或沒有指定的以1/2稀釋的單克隆抗體的上清液的情況下，進(jìn)行細(xì)胞溶解測(cè)定。該程序?qū)嵸|(zhì)上與在(Morettaetal.，1993)中描述的相同。[0217]實(shí)施例2[0218]新單克隆抗體的產(chǎn)生[0219]如在(Morettaetal.，1993)中所述，通過(guò)用激活的多克隆或單克隆NK細(xì)胞系免疫5周齡BalbC小鼠來(lái)產(chǎn)生單克隆抗體。在不同的細(xì)胞融合以后，考慮到單克隆抗體與EB6和GL183陽(yáng)性NK細(xì)胞系進(jìn)行交叉反應(yīng)以及克隆的能力，首先對(duì)單克隆抗體進(jìn)行選擇。針對(duì)它們的重構(gòu)溶解的能力，對(duì)陽(yáng)性單克隆抗體進(jìn)一步進(jìn)行篩選，其中溶解是分別通過(guò)Cw4或Cw3陽(yáng)性靶的EB6陽(yáng)性或GL183陽(yáng)性NK克隆進(jìn)行的。[0220]細(xì)胞染色是按如下所述進(jìn)行的。用一組抗體(Iμg/ml或50μI上清液，在4°C下30分鐘)、接著用PE共軛的山羊F(ab')2片段抗-鼠IgG(H+L)或PE共軛的山羊F(ab')2片段抗-人IgG(FeY)抗體(BeckmanCoulter)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。用EpicsXL.MCL儀器(BeckmanCoulter)進(jìn)行細(xì)胞突光測(cè)定分析。[0221]研究發(fā)現(xiàn)，單克隆抗體之一，DF200mAb，與KIR家族的各種成員(包括KIR2DL1、KIR2DL2/3)進(jìn)行反應(yīng)。用DF200mAb鮮明地對(duì)KIR2DL1+和KIR2DL2/3+NK細(xì)胞進(jìn)行染色(圖1)。[0222]表達(dá)這些HLA類型I特異抑制性受體的一種或另一種(或甚至兩者)的NK克隆用作相對(duì)于表達(dá)一種或多種HLA等位基因的靶細(xì)胞的效應(yīng)物細(xì)胞。如下所述進(jìn)行了細(xì)胞毒性測(cè)定。用標(biāo)準(zhǔn)4小時(shí)51Cr釋放測(cè)定評(píng)估了YTS-KIR2DL1或YTS-Eco細(xì)胞系的細(xì)胞溶解活性。用HLA-Cw4陽(yáng)性或陰性EBV細(xì)胞系和HLA_Cw4轉(zhuǎn)染721.221細(xì)胞試驗(yàn)了效應(yīng)物細(xì)胞。在微量滴定板中以3000細(xì)胞/孔使用所有的靶標(biāo)。效應(yīng)物/靶比率表示在圖中。在有或沒有單克隆鼠或人抗體的指定全長(zhǎng)或F(ab')2片段的情況下，進(jìn)行細(xì)胞溶解測(cè)定。如所預(yù)期的，KIR2DL1+NK克隆對(duì)表達(dá)HLA_Cw4的靶細(xì)胞顯示很小的(如果有的話)細(xì)胞溶解活性，而KIR2DL3+NK克隆對(duì)Cw3陽(yáng)性靶標(biāo)顯示很小的活性或不顯示活性。然而，在有DF200mAb(用來(lái)掩蔽它們的KIR2DL受體)存在的情況下，NK克隆變得不能識(shí)別它們的HLA-C配體并對(duì)Cw3或Cw4靶標(biāo)顯示強(qiáng)的細(xì)胞溶解活性。[0223]例如，由KIR2DL1+NK克隆(CN5/CN505)未殺傷ClR細(xì)胞系(CW4+EBV細(xì)胞系，ATCCn0CRL1993)，但利用DF200或常規(guī)的抗KIR2DLlmAb可有效逆轉(zhuǎn)抑制作用。另一方面，表達(dá)KIR2DL2/3+KIR2DL1—表型(CN12)的NK克隆有效地殺傷了ClR細(xì)胞并且這種殺傷不受DF200mAb的影響(圖2)。對(duì)Cw3陽(yáng)性靶標(biāo)用KIR2DL2-或KIR2DL3-陽(yáng)性NK克隆獲得了類似的結(jié)果。[0224]類似地，KIR2DL1+轉(zhuǎn)染NK細(xì)胞未殺傷Cw4+221EBV細(xì)胞系，但利用DF200，一種DF200Fab片段，或常用的抗KIR2DLlmAbEB6或XA141可有效逆轉(zhuǎn)抑制作用。此外，由KIR2DL2+NK細(xì)胞未殺傷Cw3+221EBV細(xì)胞系，但利用DF200或一種DF200Fab片段可逆轉(zhuǎn)這種抑制。最后，由KIR2DL3+NK細(xì)胞未殺傷后者03+221EBV細(xì)胞系，但利用DF200Fab片段或常用的抗KIR2DL3mAbGL183或Y249可逆轉(zhuǎn)這種抑制作用。結(jié)果示于圖3中。[0225]為了確定它們重構(gòu)Cw4陽(yáng)性靶標(biāo)的溶解能力還對(duì)F(ab')2片段進(jìn)行了試驗(yàn)。DF200和EB6Abs的F(aY)2片段均能夠逆轉(zhuǎn)通過(guò)Cw4轉(zhuǎn)染的221細(xì)胞系和Cw4+TUB0EBV細(xì)胞系的KIR2DL1轉(zhuǎn)染的NK細(xì)胞的溶解的抑制作用。結(jié)果示于圖4中。[0226]實(shí)施例4[0227]新的人單克隆抗體的產(chǎn)生[0228]人單克隆抗KIR抗體(Abs)是通過(guò)使轉(zhuǎn)基因鼠免疫而產(chǎn)生，該轉(zhuǎn)基因鼠經(jīng)工程化用重組體KIR蛋白來(lái)表達(dá)人抗體表達(dá)譜。在不同的細(xì)胞融合以后，首先相對(duì)于它們與經(jīng)固定的KIR2DL1及KIR2DL2蛋白進(jìn)行交叉反應(yīng)的能力來(lái)選擇單克隆抗體。研究發(fā)現(xiàn)，數(shù)種單克隆抗體，包括1-7F9、1-4F1、1-6F5以及1-6F1，與KIR2DL1以及KIR2DL2/3反應(yīng)。[0229]相對(duì)于它們通過(guò)表達(dá)Cw4陽(yáng)性靶細(xì)胞的KIR2DL1的EB6陽(yáng)性NK轉(zhuǎn)染子重構(gòu)溶解的能力，進(jìn)一步篩選陽(yáng)性單克隆抗體。表達(dá)HLA類型I特異抑制性受體的NK細(xì)胞用作相對(duì)于表達(dá)一種或多種HLA-C等位基因的靶細(xì)胞的效應(yīng)物細(xì)胞(圖5和圖6)。如上所述進(jìn)行細(xì)胞毒性測(cè)定。效應(yīng)物/靶比率表示在圖中，并且以10μg/ml或30μg/ml使用抗體。[0230]如所預(yù)期的，KIR2DL1+NK細(xì)胞相對(duì)于表達(dá)HLA_Cw4的靶細(xì)胞顯示很小的(如果有的話)細(xì)胞溶解活性。然而，在有l(wèi)_7F9mAb存在的情況下，NK細(xì)胞變得不能識(shí)別它們的HLA-C配體并且對(duì)Cw4靶標(biāo)顯示強(qiáng)的細(xì)胞溶解活性。例如，KIR2DL1+NK細(xì)胞未殺傷兩個(gè)試驗(yàn)的細(xì)胞系(HLA-Cw4轉(zhuǎn)染的721.221和CW4+EBV細(xì)胞系)，但利用Mabl_7F9或常規(guī)抗KIR2DLlmAbEB6可有效逆轉(zhuǎn)抑制作用。將抗體DF200和panKIR(也稱作NKVSFl)與1-7F9進(jìn)行比較。另一方面，抗體1-4F1U-6F5以及1-6F1不能重構(gòu)NK細(xì)胞對(duì)Cw4陽(yáng)性靶標(biāo)的細(xì)胞溶解。[0231]實(shí)施例5[0232]DF200mAb/KIR2DLl以及DF200mAb/KIR2DL3相互作用的Biacore分析[0233]重組體蛋白的產(chǎn)生和純化[0234]在大腸埃希氏菌(大腸桿菌)中產(chǎn)生KIR2DL1及KIR2DL3重組體蛋白。分別由pCDM8克隆47.11載體(Biassonietal,1993)及RSVS(gpt)183克隆6載體(Wagtmanetal,1995)并通過(guò)PCR對(duì)編碼KIR2DL1和KIR2DL3的整個(gè)細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，其中使用以下引物:[0235]有義:5，-GGAATTCCAGGAGGAATTTAAAATGCATGAGGGAGTCCACAG-3，[0236]反義:5’-CGGGATCCCAGGTGTCTGGGGTTACC-3’[0237]它們被克隆進(jìn)入pMLl表達(dá)載體，與對(duì)生物素化信號(hào)進(jìn)行編碼的一個(gè)序列符合讀框(Saulquinetal,2003)。[0238]在BL21(DE3)細(xì)菌株(Invitrogen)中進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)。經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)菌在37°C下并在補(bǔ)充以氨芐西林(ΙΟΟμg/ml)的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)到0D_=0.6，并用ImMIPTG誘導(dǎo)表達(dá)。[0239]在變性條件(8M脲)下從包含體(包涵體)中回收蛋白質(zhì)。在20mM的Tris、pH為7.8、NaCl為150mM的緩沖液(含有L精氨酸(400mM，Sigma)以及β-巰基乙醇(ImM))中并在室溫下，通過(guò)在6步透析中降低脲濃度(分別為4、3、2、1、0.5以及OM脲)，對(duì)重組體蛋白進(jìn)行再折疊。在0.5和OM脲透析步驟期間加入還原和氧化谷胱甘肽(分別為5mM和0.5mM,Sigma)。最后，相對(duì)于IOmM的Tris、pH為7.5、NaCl為150mM的緩沖液徹底透析蛋白質(zhì)。濃縮可溶的、再折疊蛋白質(zhì)，然后用Superdex200大小排阻柱(Pharmacia;AKTAsystem)進(jìn)行純化。[0240]用Biacore儀器(Biacore)進(jìn)行表面等離子共振測(cè)量。在所有的Biacore實(shí)驗(yàn)中，補(bǔ)充以0.05%表面活性劑P20的HBS緩沖液用作流動(dòng)緩沖液。[0241]蛋白質(zhì)固定[0242]將如上所產(chǎn)生的重組體KIR2DL1及KIR2DL3蛋白共價(jià)固定到在傳感器芯片CM5(Biacore)上的葡聚糖層中的羧基基團(tuán)。將傳感器芯片表面用EDC/NHS(N_乙基-N’-(3_二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基丁二酰亞胺，Biacore)激活。將在偶聯(lián)緩沖液(IOmM乙酸鹽，pH為4.5)中的蛋白質(zhì)注入。利用lOOmM、pH為8的乙醇胺(Biacore)進(jìn)行剩余激活基團(tuán)的失活作用。[0243]親和力測(cè)量[0244]為了進(jìn)行動(dòng)態(tài)測(cè)量，將不同濃度的可溶性抗體(IX10—7至4X10—10M)施加到經(jīng)固定的樣品上。以20μ1/π?η的連續(xù)流速進(jìn)行測(cè)量。對(duì)于每一循環(huán)，傳感器芯片的表面是通過(guò)注入5μI的10mM、pH為11的NaOH進(jìn)行再生的。將BIAlogue動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià)(BIAlogueKineticsEvaluation)程序(BIAevaluation3.1，Biacore)用于數(shù)據(jù)分析。可溶性被分析物(40μ1，以各種濃度)以在HBS緩沖液中20μ1/min的流速被注射到分別含有500或540反射單位(RU)、以及1000或700RU的KIR2DL1和KIR2DL3的葡聚糖層上。數(shù)據(jù)代表6個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。結(jié)果示于以下的表1中。[0245]表1.結(jié)合于經(jīng)固定的KIR2DL1和KIR2DL3的DF200mAb的BIAcore分析[0246]【權(quán)利要求】1.一種特異性結(jié)合至KIR2DL1、KIR2DL2和/或KIR2DL3的抗體，所述抗體包括:由氨基酸序列GFSFTPYGVH組成的重鏈⑶R1，由氨基酸序列VIWSGGNTDYNAAFIS組成的重鏈CDR2，由氨基酸序列NPRPGNYPYGMDY組成的重鏈CDR3，由氨基酸序列KASENVVTYVS組成的輕鏈⑶R1，由氨基酸序列GASNRYT組成的輕鏈⑶R2，以及由氨基酸序列GQGYSYPYT組成的輕鏈⑶R3。2.根據(jù)權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體抑制在第80位具有賴氨酸殘基的HLA-C等位基因分子與人KIR2DL1受體的結(jié)合、以及在第80位具有天冬酰胺殘基的HLA-C等位基因分子與人KIR2DL2/3受體的結(jié)合。3.根據(jù)權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體與包括以下各項(xiàng)的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合至KIR2DL2和KIR2DL3:(i)具有氨基酸序列MESQTLVFISILLWLYGADGNIVMTQSPKSMSMSVGERVTLTCKASENVVTYVSWYQQKPEQSPKLLIYGASNRYTGVPDRFTGSGSATDFTLTISSVQAEDLADYHCGQGYSYPYTFGGGTKLEIKR的輕鏈可變區(qū)，以及(ii)具有氨基酸序列QVQLEQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSFTPYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNAAFISRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQVNDTAIYYCARNPRPGNYPYGMDYffGQGTSVTVSS的重鏈可變區(qū)。4.根據(jù)權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體包括:(i)具有氨基酸序列MESQTLVFISILLWLYGADGNIVMTQSPKSMSMSVGERVTLTCKASENVVTYVSWYQQKPEQSPKLLIYGASNRYTGVPDRFTGSGSATDFTLTISSVQAEDLADYHCGQGYSYPYTFGGGTKLEIKR的輕鏈可變區(qū)，以及(ii)具有氨基酸序列QVQLEQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSFTPYGVHWVRQSPGKGLEffLGVIffSGGNTDYNAAFISRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQVNDTAIYYCARNP.RPGNYPYGMDYWGQGTSVTVSS的重鏈可變區(qū)。5.根據(jù)權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體是一抗體片段，它選自Fab、Fab’、Fab’-SHjPF(ab，)2。6.根據(jù)權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體是人源化抗體。7.根據(jù)權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體是人抗體。8.根據(jù)權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體是嵌合抗體。9.一種雜交瘤,包括:a)來(lái)自非人哺乳動(dòng)物宿主的B細(xì)胞，其已用包括存在于抑制性KIR多肽上的抗原決定部位的抗原加以免疫，融合到b)永生化細(xì)胞，其中所述雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體包括:由氨基酸序列GFSFTPYGVH組成的重鏈⑶R1，由氨基酸序列VIWSGGNTDYNAAFIS組成的重鏈CDR2，由氨基酸序列NPRPGNYPYGMDY組成的重鏈CDR3，由氨基酸序列KASENVVTYVS組成的輕鏈⑶R1，由氨基酸序列GASNRYT組成的輕鏈⑶R2，以及由氨基酸序列GQGYSYPYT組成的輕鏈⑶R3。10.根據(jù)權(quán)利要求9的雜交瘤，其中所述雜交瘤產(chǎn)生的一種抗體抑制在第80位具有賴氨酸殘基的HLA-C等位基因分子與人KIR2DL1受體的結(jié)合、以及在第80位具有天冬酰胺殘基的HLA-C等位基因分子與人KIR2DL2/3受體的結(jié)合。11.根據(jù)權(quán)利要求9的雜交瘤，其中所述雜交瘤是具有登記號(hào)CNCM1-3224的雜交瘤DF200。12.根據(jù)權(quán)利要求9的雜交瘤，其中所述抗體與包括以下各項(xiàng)的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合至KIR2DL2和KIR2DL3:(i)具有氨基酸序列MESQTLVFISILLWLYGADGNIVMTQSPKSMSMSVGERVTLTCKASENVVTYVSWYQQKPEQSPKLLIYGASNRYTGVPDRFTGSGSATDFTLTISSVQAEDLADYHCGQGYSYPYTFGGGTKLEIKR的輕鏈可變區(qū)，以及(ii)具有氨基酸序列QVQLEQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSFTPYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNAAFISRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQVNDTAIYYCARNPRPGNYPYGMDYffGQGTSVTVSS的重鏈可變區(qū)。13.根據(jù)權(quán)利要求9的雜交瘤，其中所述抗體包括:(i)具有氨基酸序列MESQTLVFISILLWLYGADGNIVMTQSPKSMSMSVGERVTLTCKASENVVTYVSWYQQKPEQSPKLLIYGASNRYTGVPDRFTGSGSATDFTLTISSVQAEDLADYHCGQGYSYPYTFGGGTKLEIKR的輕鏈可變區(qū)，以及(ii)具有氨基酸序列QVQLEQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSFTPYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNAAFISRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQVNDTAIYYCARNPRPGNYPYGMDYWGQGTSVTVSS的重鏈可變區(qū)。14.一種產(chǎn)生特異性結(jié)合至KIR2DL1、KIR2DL2和/或KIR2DL3的抗體的方法，所述方法包括以下步驟:a)用包括抑制性KIR多肽的免疫原對(duì)非人哺乳動(dòng)物進(jìn)行免疫；b)由所述經(jīng)免疫的動(dòng)物制備抗體，其中所述抗體與所述KIR多肽相結(jié)合；c)選擇(b)的抗體與至少兩種不同的人抑制性KIR受體基因產(chǎn)物進(jìn)行交叉反應(yīng)，以及d)選擇(c)的抗體，所述抗體對(duì)表達(dá)所述至少兩種不同的人抑制性KIR受體基因產(chǎn)物的NK細(xì)胞種群能夠中和KIR介導(dǎo)的NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性的抑制作用，其中所述步驟(c)和(d)的次序可隨意顛倒，以及其中所述抗體包括:由氨基酸序列GFSFTPYGVH組成的重鏈⑶R1，由氨基酸序列VIWSGGNTDYNAAFIS組成的重鏈CDR2，由氨基酸序列NPRPGNYPYGMDY組成的重鏈CDR3，由氨基酸序列KASENVVTYVS組成的輕鏈⑶R1，由氨基酸序列GASNRYT組成的輕鏈⑶R2，以及由氨基酸序列GQGYSYPYT組成的輕鏈CDR3。15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中在步驟(b)中制備的抗體是單克隆抗體。16.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中用于免疫作用的所述抑制性KIR多肽是KIR2DL多肽，而在步驟(c)中選擇的所述抗體至少與KIR2DL1和KIR2DL2/3進(jìn)行交叉反應(yīng)。17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中在步驟(c)中選擇的所述抗體抑制在第80位具有賴氨酸殘基的HLA-C等位基因分子與人KIR2DL1受體的結(jié)合、以及在第80位具有天冬酰胺殘基的HLA-C等位基因分子與人KIR2DL2/3受體的結(jié)合。18.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中在步驟(d)中選擇的所述抗體引起NK細(xì)胞毒性增強(qiáng)等于或聞?dòng)?0%。19.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述抗體與包括以下各項(xiàng)的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合至KIR2DL2和KIR2DL3:(i)具有氨基酸序列MESQTLVFISILLWLYGADGNIVMTQSPKSMSMSVGERVTLTCKASENVVTYVSWYQQKPEQSPKLLIYGASNRYTGVPDRFTGSGSATDFTLTISSVQAEDLADYHCGQGYSYPYTFGGGTKLEIKR的輕鏈可變區(qū)，以及(ii)具有氨基酸序列QVQLEQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSFTPYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNAAFISRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQVNDTAIYYCARNPRPGNYPYGMDYffGQGTSVTVSS的重鏈可變區(qū)。20.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述抗體包括:(i)具有氨基酸序列MESQTLVFISILLWLYGADGNIVMTQSPKSMSMSVGERVTLCKASENVVTYVSWYQQKPEQSPKLLIYGASNRYTGVPDRFTGSGSATDFTLTISSVQAEDLADYHCGQGYSYPYTFGGGTKLEIKR的輕鏈可變區(qū)，以及(ii)具有氨基酸序列QVQLEQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSFTPYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNAAFISRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQVNDTAIYYCARNPRPGNYPYGMDYWGQGTSVTVSS的重鏈可變區(qū)。21.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，包括另外的制備選自所述選擇的單克隆抗體的Fab、Fab’、Fab’_SH、和F(ab’)2片段中的抗體片段的步驟。22.—種產(chǎn)生特異性結(jié)合至KIR2DL1、KIR2DL2和/或KIR2DL3的抗體的方法，所述方法包括以下步驟:a)從文庫(kù)或表達(dá)譜中選擇單克隆抗體或抗體片段，所述單克隆抗體或抗體片段與至少兩種不同的人抑制性KIR2DL受體基因產(chǎn)物進(jìn)行交叉反應(yīng)，以及b)選擇(a)的抗體，所述抗體對(duì)表達(dá)所述至少兩種不同的人抑制性KIR2DL受體基因產(chǎn)物的NK細(xì)胞種群能夠中和KIR介導(dǎo)的NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性的抑制作用，其中所述抗體包括:由氨基酸序列GFSFTPYGVH組成的重鏈⑶R1，由氨基酸序列VIWSGGNTDYNAAFIS組成的重鏈CDR2，由氨基酸序列NPRPGNYPYGMDY組成的重鏈CDR3，由氨基酸序列KASENVVTYVS組成的輕鏈⑶R1，由氨基酸序列GASNRYT組成的輕鏈⑶R2，以及由氨基酸序列GQGYSYPYT組成的輕鏈⑶R3。23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中在步驟(b)中選擇的所述抗體抑制在第80位具有賴氨酸殘基的HLA-C等位基因分子與人KIR2DL1受體的結(jié)合、以及在第80位具有天冬酰胺殘基的HLA-C等位基因分子與人KIR2DL2/3受體的結(jié)合。24.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中在步驟(b)中選擇的所述抗體引起NK細(xì)胞毒性增強(qiáng)等于或聞?dòng)?0%。25.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述抗體與包括以下各項(xiàng)的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合至KIR2DL2和KIR2DL3:(i)具有氨基酸序列MESQTLVFISILLWLYGADGNIVMTQSPKSMSMSVGERVTLTCKASENVVTYVSWYQQKPEQSPKLLIYGASNRYTGVPDRFTGSGSATDFTLTISSVQAEDLADYHCGQGYSYPYTFGGGTKLEIKR的輕鏈可變區(qū)，以及(ii)具有氨基酸序列QVQLEQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSFTPYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNAAFISRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQVNDTAIYYCARNPRPGNYPYGMDYffGQGTSVTVSS的重鏈可變區(qū)。26.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述抗體包括:(i)具有氨基酸序列MESQTLVFISILLWLYGADGNIVMTQSPKSMSMSVGERVTLTCKASENVVTYVSWYQQKPEQSPKLLIYGASNRYTGVPDRFTGSGSATDFTLTISSVQAEDLADYHCGQGYSYPYTFGGGTKLEIKR的輕鏈可變區(qū)，以及(ii)具有氨基酸序列QVQLEQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSFTPYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNAAFISRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQVNDTAIYYCARNPRPGNYPYGMDYWGQGTSVTVSS的重鏈可變區(qū)。27.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，包括另外的制備選自所述選擇的單克隆抗體的Fab、Fab’、Fab’_SH、和F(ab’)2中的抗體片段的步驟。28.—種產(chǎn)生特異性結(jié)合至KIR2DL1、KIR2DL2和/或KIR2DL3的抗體的方法，所述方法包括以下步驟:a)在引起所述單克隆抗體表達(dá)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求9至13中任一項(xiàng)所述的雜交瘤；以及b)從所述雜交瘤中分離所述單克隆抗體，其中所述抗體包括:由氨基酸序列GFSFTPYGVH組成的重鏈⑶R1，由氨基酸序列VIWSGGNTDYNAAFIS組成的重鏈CDR2，由氨基酸序列NPRPGNYPYGMDY組成的重鏈CDR3，由氨基酸序列KASENVVTYVS組成的輕鏈⑶R1，由氨基酸序列GASNRYT組成的輕鏈⑶R2，以及由氨基酸序列GQGYSYPYT組成的輕鏈⑶R3。29.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中所述抗體與包括以下各項(xiàng)的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合至KIR2DL2和KIR2DL3:(i).具有氨基酸序列MESQTLVFISILLWLYGADGNIVMTQSPKSMSMSVGERVTLTCKASENVVTYVSWYQQKPEQSPKLLIYGASNRYTGVPDRFTGSGSATDFTLTISSVQAEDLADYHCGQGYSYPYTFGGGTKLEIKR的輕鏈可變區(qū)，以及(ii)具有氨基酸序列QVQLEQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSFTPYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNAAFISRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQVNDTAIYYCARNPRPGNYPYGMDYffGQGTSVTVSS的重鏈可變區(qū)。30.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中所述抗體包括:(i)具有氨基酸序列MESQTLVFISILLWLYGADGNIVMTQSPKSMSMSVGERVTLTCKASENVVTYVSWYQQKPEQSPKLLIYGASNRYTGVPDRFTGSGSATDFTLTISSVQAEDLADYHCGQGYSYPYTFGGGTKLEIKR的輕鏈可變區(qū)，以及(ii)具有氨基酸序列QVQLEQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSFTPYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNAAFISRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQVNDTAIYYCARNPRPGNYPYGMDYWGQGTSVTVSS的重鏈可變區(qū)。31.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，包括另外的制備選自所述選擇的單克隆抗體的Fab、Fab’、Fab’_SH、和F(ab’)2中的抗體片段的步驟。32.一種產(chǎn)生特異性結(jié)合至KIR2DL1、KIR2DL2和/或KIR2DL3的抗體的方法，所述方法包括以下步驟:a)從權(quán)利要求9至13中任一項(xiàng)所述的雜交瘤中分離出對(duì)所述單克隆抗體進(jìn)行編碼的DNA；b)任選對(duì)所述DNA進(jìn)行的修飾以便為選自人源化抗體、嵌合抗體、單鏈抗體或抗體的免疫反應(yīng)片段的經(jīng)修飾或衍生的抗體進(jìn)行編碼；c)將所述DNA或經(jīng)修飾的DNA插入表達(dá)載體,其中，當(dāng)所述表達(dá)載體存在于在適宜條件下生長(zhǎng)的宿主細(xì)胞中時(shí)，所述抗體或抗體片段能夠被表達(dá)；d)用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞并不用另外產(chǎn)生免疫球蛋白；e)在引起所述抗體或抗體片段表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞；以及f)分離由所述轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞產(chǎn)生的抗體或抗體片段，其中所述抗體包括:由氨基酸序列GFSFTPYGVH組成的重鏈⑶R1，由氨基酸序列VIWSGGNTDYNAAFIS組成的重鏈CDR2，由氨基酸序列NPRPGNYPYGMDY組成的重鏈CDR3，由氨基酸序列KASENVVTYVS組成的輕鏈⑶R1，由氨基酸序列GASNRYT組成的輕鏈⑶R2，以及由氨基酸序列GQGYSYPYT組成的輕鏈⑶R3。33.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中所述抗體與包括以下各項(xiàng)的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合至KIR2DL2和KIR2DL3:(i)具有氨基酸序列MESQTLVFISILLWLYGADGNIVMTQSPKSMSMSVGERVTLTCKASENVVTYVSWYQQKPEQSPKLLIYGASNRYTGVPDRFTGSGSATDFTLTISSVQAEDLADYHCGQGYSYPYTFGGGTKLEIKR的輕鏈可變區(qū)，以及(ii)具有氨基酸序列QVQLEQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSFTPYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNAAFISRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQVNDTAIYYCARNPRPGNYPYGMDYffGQGTSVTVSS的重鏈可變區(qū)。34.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中所述抗體包括:(i)具有氨基酸序列MESQTLVFISILLWLYGADGNIVMTQSPKSMSMSVGERVTLTCKASENVVTYVSWYQQKPEQSPKLLIYGASNRYTGVPDRFTGSGSATDFTLTISSVQAEDLADYHCGQGYSYPYTFGGGTKLEIKR的輕鏈可變區(qū)，以及(ii)具有氨基酸序列QVQLEQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSFTPYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNAAFISRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQVNDTAIYYCARNPRPGNYPYGMDYWGQGTSVTVSS的重鏈可變區(qū)。35.一種藥物組合物，包括特異性結(jié)合至KIR2DL1、KIR2DL2和/或KIR2DL3的抗體，所述抗體的存在量有效地對(duì)患者的或包括NK細(xì)胞的生物樣品的NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性產(chǎn)生可檢測(cè)的增強(qiáng)；以及一種藥用載體或賦形劑，其中所述抗體包括:由氨基酸序列GFSFTPYGVH組成的重鏈⑶R1，由氨基酸序列VIWSGGNTDYNAAFIS組成的重鏈CDR2，由氨基酸序列NPRPGNYPYGMDY組成的重鏈CDR3，由氨基酸序列KASENVVTYVS組成的輕鏈⑶R1，由氨基酸序列GASNRYT組成的輕鏈⑶R2，以及由氨基酸序列GQGYSYPYT組成的輕鏈⑶R3。36.根據(jù)權(quán)利要求35的組合物，其中所述抗體與包括以下各項(xiàng)的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合至KIR2DL2和KIR2DL3:(i)具有氨基酸序列MESQTLVFISILLWLYGADGNIVMTQSPKSMSMSVGERVTLTCKASENVVTYVSWYQQKPEQSPKLLIYGASNRYTGVPDRFTGSGSATDFTLTISSVQAEDLADYHCGQGYSYPYTFGGGTKLEIKR的輕鏈可變區(qū)，以及(ii)具有氨基酸序列QVQLEQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSFTPYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNAAFISRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQVNDTAIYYCARNPRPGNYPYGMDYffGQGTSVTVSS的重鏈可變區(qū)。37.根據(jù)權(quán)利要求35的組合物，其中所述抗體包括:(i)具有氨基酸序列MESQTLVFISILLffLYGADGNIVMTQSPKSMSMSVGERVTLTCKASENVVTYVSWYQQKPEQSPKLLIYGASNRYTGVPDRFTGSGSATDFTLTISSVQAEDLADYHCGQGYSYPYTFGGGTKLEIKR的輕鏈可變區(qū)，以及(ii)具有氨基酸序列QVQLEQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSFTPYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNAAFISRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQVNDTAIYYCARNPRPGNYPYGMDYWGQGTSVTVSS的重鏈可變區(qū)。38.根據(jù)權(quán)利要求35的組合物，其中所述抗體是權(quán)利要求1至8或權(quán)利要求32所述的抗體。39.根據(jù)權(quán)利要求35的組合物，進(jìn)一步包括一種治療藥劑，它選自免疫調(diào)節(jié)劑、激素藥物、化療藥物、抗血管形成劑、凋亡劑、抗感染藥、靶向劑或附加化合物，所述附加化合物選自吩噻嗪、抗組胺、丁酰苯、皮質(zhì)類固醇、苯并二氮雜草類、大麻素、唑來(lái)膦酸、帕米膦酸、紅細(xì)胞生成素、G-CSF，非格司亭、來(lái)格司亭、達(dá)貝泊汀(darb印oietin)。40.根據(jù)權(quán)利要求39的組合物，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑選自白介素-1α、白介素_1β、白介素-2、白介素_3、白介素-4、白介素-5、白介素_6、白介素-7、白介素_8、白介素-9、白介素-10、白介素-11、白介素-12、白介素-13、白介素-15、白介素-21、TGF-β、GM-CSF,M-CSF,G-CSF,TNF-a、TNF-β、LAF,TCGF,BCGF,TRF、BAF、BDG、ΜΡ、LIF、OSM、TMF、PDGF,α-干擾素、干擾素、或Y-干擾素。41.根據(jù)權(quán)利要求39的組合物，其中所述化療藥物選自烷化劑、抗代謝藥、細(xì)胞毒抗生素、阿霉素、更生霉素、絲裂霉素、洋紅霉素、道諾霉素、多柔比星、他莫昔芬、紫杉酚、泰索帝、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春瑞賓、依托泊苷(VP-16)、5-氟尿嘧啶(5FU)、阿糖胞苷、環(huán)磷酰胺、噻替派、甲氨蝶呤、喜樹堿、放線菌素-D、絲裂霉素C、順鉬(CDDP)、氨基蝶呤、康布瑞塔卡汀、其它長(zhǎng)春花生物堿、以及其衍生物或前藥。42.根據(jù)權(quán)利要求39的組合物，其中所述激素藥物選自亮丙瑞林、戈舍瑞林、曲普瑞林、布舍瑞林、他莫昔芬、托瑞米芬、氟他胺、尼魯?shù)仄?、環(huán)丙孕酮、比卡魯胺、阿那曲唑、依西美坦、來(lái)曲唑、法倔唑、甲羥孕酮、氯地孕酮、甲地孕酮。43.根據(jù)權(quán)利要求39的組合物，其中所述凋亡劑是一個(gè)反義核苷酸序列、RNAi,siRNA或小分子化合物，它抑制選自bcr-abl、bcl-2、Bcl-xl、Mcl-l、Bak、Al、*A20的基因表達(dá)。44.根據(jù)權(quán)利要求39的組合物，其中所述抗血管形成劑選自中和抗體、反義RNA、siRNA,RNA1、RNA適體或核酶，其對(duì)準(zhǔn)編碼VEGF的基因、編碼VEGF受體的基因、VEGF、或VEGF受體；或?qū)EGF具有拮.抗性能的VEGF的變異體。45.根據(jù)權(quán)利要求35所述的組合物在制備用于在有需要患者體內(nèi)增強(qiáng)NK細(xì)胞活性的藥物中的應(yīng)用。46.根據(jù)權(quán)利要求45的應(yīng)用，其中所述患者患有癌癥、另外一種增生性病癥、傳染性疾病或免疫性疾病。47.根據(jù)權(quán)利要求46的應(yīng)用，其中所述患者患有鱗狀細(xì)胞癌，白血病,急性淋巴細(xì)胞白血病，急性成淋巴細(xì)胞白血病，B細(xì)胞淋巴瘤，T細(xì)胞淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，多毛細(xì)胞淋巴瘤，伯基特淋巴瘤，急性或慢性髓細(xì)胞源性白血病，前髓細(xì)胞白血病，纖維肉瘤，橫紋肌肉瘤；黑色素瘤，精原細(xì)胞瘤，畸胎癌，成神經(jīng)細(xì)胞瘤，膠質(zhì)瘤，星形細(xì)胞瘤，成神經(jīng)細(xì)胞瘤，膠質(zhì)瘤，神經(jīng)鞘瘤；骨肉瘤，著色性干皮病，角化棘皮瘤，甲狀腺濾泡性癌，膀胱癌，乳房癌，結(jié)腸癌，腎癌，肝癌，肺癌，卵巢癌，前列腺癌，胰癌，胃癌，頸癌，甲狀腺癌或皮膚癌。48.根據(jù)權(quán)利要求47的應(yīng)用，其中所述患者患有急性或慢性髓細(xì)胞源性白血病。49.根據(jù)權(quán)利要求46的應(yīng)用，其中所述患者患有非霍奇金淋巴瘤。50.根據(jù)權(quán)利要求46的應(yīng)用，其中所述患者患有乳房癌。51.根據(jù)權(quán)利要求46的應(yīng)用，其中所述患者患有卵巢癌。52.根據(jù)權(quán)利要求46的應(yīng)用，其中所述患者患有淋巴樣譜系的造血腫瘤。53.根據(jù)權(quán)利要求52的應(yīng)用，其中所述腫瘤選自包括小細(xì)胞和腦樣細(xì)胞型的T前淋巴細(xì)胞白血病(T-PLL);T細(xì)胞型的大顆粒淋巴細(xì)胞白血病(LGL);塞澤里綜合癥(SS);成人T細(xì)胞白血病淋巴瘤(ATLL)；a/dT-NHL肝脾淋巴瘤；多形或成免疫細(xì)胞亞型的周圍/后胸腺T細(xì)胞淋巴瘤；血管成免疫細(xì)胞T細(xì)胞淋巴瘤；血管源性(鼻)T細(xì)胞淋巴瘤；間變性(Kil+)大細(xì)胞淋巴瘤；腸T細(xì)胞淋巴瘤；T成淋巴細(xì)胞白血病；或淋巴瘤/白血病(T-Lbly/T-ALD054.根據(jù)權(quán)利要求46的應(yīng)用，其中所述患者患有選自增生、纖維化、血管發(fā)生、銀屑病、動(dòng)脈粥樣硬化、以及狹窄或血管成形術(shù)以后的再狹窄中的增生性病癥。55.根據(jù)權(quán)利要求46的應(yīng)用，其中所述患者患有由選自甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、流行性感冒、水痘、腺病毒、單純皰疹病毒I型(HSV-1)、單純皰疹病毒II型(HSV-2)、牛瘟、鼻病毒、艾柯病毒、輪狀病毒、呼吸道合胞病毒、乳頭狀瘤病毒、巨細(xì)胞病毒、棘病毒、蟲媒病毒、柯薩奇病毒、流行性腮腺炎病毒、麻疹病毒、風(fēng)疹病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒或人免疫缺陷病毒I型或II型(HIV-l、HIV-2)的病毒引起的傳染性疾病。56.根據(jù)權(quán)利要求46的應(yīng)用，其中所述患者患有由細(xì)菌、原生動(dòng)物或寄生物引起的傳染性疾病，所述細(xì)菌、原生動(dòng)物或寄生物選自葡萄球菌屬，釀膿葡萄球菌，炭疽桿菌，乳酸桿菌屬，利斯特桿菌屬，白喉棒狀桿菌，陰道加德納氏菌；諾卡氏菌屬；鏈霉菌屬；普通高溫放線菌；密螺旋體屬；螺旋體屬；軍團(tuán)菌屬；淋病奈瑟菌；腦膜炎奈瑟菌；腦膜膿毒性黃桿菌；芳香黃桿菌；布魯氏菌屬；百日咳博德特氏菌；支氣管敗血博德特氏菌；大腸埃希氏菌；克雷白桿菌屬；腸桿菌屬；粘質(zhì)沙雷氏菌；液化沙雷氏菌；愛德華菌屬；奇異變形桿菌；普通變形桿菌；鏈桿菌屬；立氏立克次體(R.rickettsii);鶴踏熱衣原體；沙眼衣原體；結(jié)核分枝桿菌，胞內(nèi)分枝桿菌，麻風(fēng)分枝桿菌(M.leprae),鳥分枝桿菌，牛結(jié)核菌，非洲分枝桿菌，堪薩斯分枝桿菌，胞內(nèi)分枝桿菌；鼠麻風(fēng)分枝桿菌；諾卡氏菌屬，利什曼原蟲，kokzidioa,錐蟲，衣原體或立克次體。57.根據(jù)權(quán)利要求46的應(yīng)用，包括將所述藥物與適宜的另外的治療藥劑聯(lián)合使用，其中所述另外的治療藥劑選自免疫調(diào)節(jié)劑、激素藥物、化療藥物、抗血管形成劑、凋亡劑、結(jié)合于并抑制抑制性KIR受體的第二抗體、抗感染藥、靶向劑或附加化合物，其中所述另外的治療藥劑作為連同所述抗體的單劑型或作為分開的劑型給予所述患者。58.根據(jù)權(quán)利要求57的應(yīng)用，其中所述患者患有淋巴樣譜系的造血腫瘤、急性或慢性髓細(xì)胞源性白血病、或非霍奇金淋巴瘤。59.根據(jù)權(quán)利要求57的應(yīng)用，其中所述患者患有乳房癌或卵巢癌。60.根據(jù)權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體共軛或共價(jià)結(jié)合于毒素、可檢測(cè)部分、或固相支撐體。61.一種在生物樣品中檢測(cè)存在NK細(xì)胞的方法，其中所述NK細(xì)胞在它們的細(xì)胞表面上帶有抑制性KIR，所述方法包括以下步驟:a)用權(quán)利要求60所述的抗體接觸所述生物樣品或活生物，其中所述抗體共軛或共價(jià)結(jié)合于可檢測(cè)部分；以及b)在所述生物樣品或活生物中檢測(cè)所述抗體的存在。62.一種從樣品中對(duì)細(xì)胞表面上帶有抑制性KIR的NK細(xì)胞進(jìn)行純化的方法，所述方法包括以下步驟:a)在允許細(xì)胞表面上帶有抑制性KIR的所述NK細(xì)胞與所述抗體結(jié)合的條件下，用權(quán)利要求60所述的抗體接觸所述樣品，其中所述抗體共軛或共價(jià)結(jié)合在一固相支撐體上；以及b)從共軛或共價(jià)結(jié)合在該固相支撐體上的所述抗體洗脫所述結(jié)合的NK細(xì)胞。63.—種組合物，包括根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，其中所述抗體被結(jié)合到一脂質(zhì)體之中。64.根據(jù)權(quán)利要求63的組合物，其中所述脂質(zhì)體中另外結(jié)合了另一種物質(zhì)，它選自:用于在基因療法中遞送基因的核酸分子；用于遞送反義RNA、RNAi或SiRNA的核酸分子，以此抑制NK細(xì)胞中基因；或用于靶向殺傷NK細(xì)胞的毒素或藥物。65.根據(jù)權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體結(jié)合至少兩種不同的人抑制性KIR受體基因產(chǎn)物，并且對(duì)表達(dá)所述至少兩種不同的人抑制性KIR受體基因產(chǎn)物的NK細(xì)胞種群能夠中和KIR介導(dǎo)的NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性的抑制作用，并且其中所述抗體結(jié)合至KIR2DL1、KIR2DL2和KIR2DL3。66.根據(jù)權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體不是NKVSFl。67.根據(jù)權(quán)利要求9的雜交瘤，其中所述抗體結(jié)合至少兩種不同的人抑制性KIR受體基因產(chǎn)物，并且對(duì)表達(dá)所述至少兩種不同的人抑制性KIR受體基因產(chǎn)物的NK細(xì)胞種群能夠中和KIR介導(dǎo)的NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性的抑制作用，并且其中所述抗體結(jié)合至KIR2DL1、KIR2DL2和KIR2DL3。68.根據(jù)權(quán)利要求9的雜交瘤，其中所述抗體不是NKVSFl。69.根據(jù)權(quán)利要求14、22、28、32和35中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗體結(jié)合至少兩種不同的人抑制性KIR受體基因產(chǎn).物，并且對(duì)表達(dá)所述至少兩種不同的人抑制性KIR受體基因產(chǎn)物的NK細(xì)胞種群能夠中和KIR介導(dǎo)的NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性的抑制作用，并且其中所述抗體結(jié)合至KIR2DL1、KIR2DL2和KIR2DL3。70.根據(jù)權(quán)利要求14、22、28、32和35中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗體不是NKVSFl。【文檔編號(hào)】G01N33/569GK103467602SQ201310392765【公開日】2013年12月25日申請(qǐng)日期:2004年7月1日優(yōu)先權(quán)日:2003年7月2日【發(fā)明者】阿萊斯山德羅·莫雷塔,馬里耶拉·德拉基耶薩申請(qǐng)人:依奈特制藥公司,熱那亞大學(xué)