25羥-維生素d3定量免疫層析檢測試劑卡及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種25羥維生素D3檢測試劑卡及其制備方法，涉及維生素免疫化學(xué)試驗物質(zhì)的制備。本發(fā)明是在檢測試劑卡內(nèi)檢測試紙條的樣品墊和吸樣墊之間依次設(shè)置有含有膠體金標(biāo)記的25-羥基維生素D3抗體的膠體金墊，分別包被有25-羥基維生素D3-偶聯(lián)蛋白的T線和抗鼠IgG的C線的NC膜；試劑卡頂面形成對應(yīng)標(biāo)示T線和標(biāo)示C線位置的觀察窗，對應(yīng)樣品墊位置形成有稀釋液孔和加樣孔。使用時結(jié)合帶有25-羥基維生素D3內(nèi)置標(biāo)準(zhǔn)曲線的免疫層析結(jié)果判讀記錄儀，對檢測結(jié)果的進(jìn)行定量判定，適合血清、血漿、全血樣本，檢測簡便、快速，適合現(xiàn)場檢測，經(jīng)濟(jì)實用。
【專利說明】25羥-維生素D3定量免疫層析檢測試劑卡及其制備方法【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及維生素免疫化學(xué)試驗物質(zhì)的制備，具體是一種25羥維生素D3定量免疫層析檢測試劑卡及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]維生素D是環(huán)戊烷多氫菲類化合物，可由維生素D原經(jīng)紫外線27(T300nm激活形成。動物皮下7-脫氫膽固醇，酵母細(xì)胞中的麥角固醇都是維生素D原，經(jīng)紫外線激活分別轉(zhuǎn)化為維生素D3及維生素D2。維生素D的最大吸收峰為265nm，從食物中得來的維生素D，與脂肪一起吸收，吸收部位主要在空腸與回腸。膽汁幫助其吸收。脂肪吸收受干擾時，如慢性胰腺炎、脂肪痢及膽道阻塞都會影響吸收。吸收的維生素D與乳糜微粒相結(jié)合，由淋巴系統(tǒng)運輸。當(dāng)維生素D運到肝臟中，在微粒體中經(jīng)單氧酶系統(tǒng)作用，將其25位羥基化形成25(OH)維生素D3，肝外的其他組織也可吸取維生素D及25 (OH) D3，因此組織中維生素D及25 (OH) D3及其總量比維生素D血漿中多，如果靶組織需要，可將其釋放出來，他們在脂肪組織中最多，釋放速度最慢，當(dāng)體重減輕，脂肪減少時，他們也可釋放出來。25-羥基維生素D3在腎線粒體單氧酶作用下(酶系統(tǒng)包括細(xì)胞色素p450、鐵硫蛋白及黃素蛋白)，經(jīng)羧基化，轉(zhuǎn)變?yōu)?，25 (0H)-D3，這是維生素D的生物作用形式，現(xiàn)將其作為激素看待，其作用方式與其他固醇類激素相似。
[0003]維生素D缺乏會導(dǎo)致少兒佝僂病和成年人的軟骨病。癥狀包括骨頭和關(guān)節(jié)疼痛，肌肉萎縮，失眠，緊張以及痢疾腹瀉。維生素D主要用于組成和維持骨骼的強(qiáng)壯。它被用來防治兒童的佝僂病和成人的軟骨癥，關(guān)節(jié)痛等等?；加泄琴|(zhì)疏松癥的人通過添加合適的維生素D和鎂可以有效的提高鈣離子的吸收度。除此以外，維生素D還被用于降低結(jié)腸癌、乳腺癌和前列腺癌的機(jī)率，對免疫系統(tǒng)也有增強(qiáng)作用。
[0004]測定血液中25-羥基維生素D3能反應(yīng)機(jī)體的維生素D狀況，以為利于后續(xù)的干預(yù)治療。由于維生素D是小分子物.質(zhì)，采用免疫學(xué)方法檢測最佳的方法為競爭抑制法。目前，市場上已有采用化學(xué)發(fā)光等方法檢測25-羥基維生素D3的試劑卡出現(xiàn)，然而，運用膠體金免疫層析技術(shù)定量檢測25-羥基維生素D3的試劑尚為空白。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明是為了解決應(yīng)用免疫層析膠體金法檢測人血液中25-羥基維生素D3的技術(shù)問題，而提供一種25-羥基維生素D3定量免疫層析檢測試劑卡及其制備方法。
實現(xiàn)本發(fā)明的原理如下:利用膠體金標(biāo)記抗體，在檢測試紙條的NC膜上包被配對抗原。檢測時當(dāng)樣品中含相應(yīng)的抗原時，膠體金標(biāo)記的抗體和樣品中相應(yīng)抗原相結(jié)合形成復(fù)合物，然后在NC膜上層析，再遇到包被抗原時，不會和包被的抗原結(jié)合或僅部分結(jié)合，不形成肉眼可見的或僅形成強(qiáng)度減弱的T線，在一定的條件下，T線的強(qiáng)弱和樣品中的濃度呈負(fù)相關(guān)。采用專用的免疫層析結(jié)果判讀記錄儀可以實現(xiàn)定量檢測。
[0006]本發(fā)明是按照以下技術(shù)方案實現(xiàn)的。[0007]—種25-羥基維生素D3定量免疫層析檢測試劑卡，包括依次形成有稀釋液孔、力口樣孔和觀察窗的盒蓋，盒體內(nèi)底部形成的檢測試紙條架一端形成有端護(hù)欄，另一端形成有側(cè)護(hù)欄，盒蓋底面形成的插突起與盒體的插孔柱插接結(jié)合；以及沿檢測試紙條架長度方向平鋪的檢測試紙條，檢測試紙條的塑料基板兩端分別設(shè)置的樣品墊和吸樣墊，而樣品墊和吸樣墊之間依次設(shè)置有膠體金標(biāo)記25-羥基維生素D3抗體的膠體金墊，分別包被有25-羥基維生素D3-偶聯(lián)蛋白的T線和抗鼠IgG的C線的NC膜。
[0008]一種25-羥基維生素D3定量免疫層析檢測試劑卡的制備方法，包括依次形成有稀釋液孔、加樣孔和觀察窗的盒蓋，盒體內(nèi)底部形成的檢測試紙條架一端形成有端護(hù)欄，另一端形成有側(cè)護(hù)欄，盒蓋底面形成的插突起與盒體的插孔柱插接結(jié)合；以及沿檢測試紙條架長度方向平鋪的檢測試紙條，檢測試紙條的塑料基板兩端分別設(shè)置有樣品墊和吸樣墊，而樣品墊和吸樣墊之間依次設(shè)置有含有膠體金標(biāo)記的25-羥基維生素D3抗體的膠體金墊，分別包被有25-羥基維生素D3-偶聯(lián)蛋白的T線和抗鼠IgG的C線的NC膜；
所述樣品墊和吸樣墊之間依次設(shè)置有含有膠體金標(biāo)記的25-羥基維生素D3抗體的膠體金墊，分別包被有25-羥基維生素D3-偶聯(lián)蛋白的T線和抗鼠IgG的C線的NC膜，其中:
a.含有膠體金標(biāo)記的25-羥基維生素D3抗體的膠體金墊的制備過程為:金顆粒直徑為30?50nm的膠體金溶液10ml，于燒杯內(nèi)用0.2M K2CO3調(diào)至pH7.5?8.5，加入25?75 Ug 25-羥基維生素D3抗體，室溫攪拌30min，加入終濃度為0.5%牛血清白蛋白，5% PEG20000封閉20min，12000g離心20分鐘，棄上清，用膠體金溶液復(fù)溶至80ml，按Iml溶液鋪20cm2的比例均勻地鋪在玻璃纖維膜或無紡布上，再置干燥間干燥3?5小時，制成膠體金墊；
b.所述NC膜抗體的包被過程為:以0.0lM pH 7.4磷酸鹽緩沖液將25-羥基維生素D3-偶聯(lián)蛋白配制成0.8?1.6mg/ml的溶液，在NC膜上用噴膜儀以I?1.5 μ Ι/cm的量包被T線；另將抗鼠IgG配制成I?3mg/ml的溶液，用噴膜儀以上述相同參數(shù)包被C線，劃線后將NC膜干燥3?5小時，制成包.被25-羥基維生素D3-偶聯(lián)蛋白的T線和包被抗鼠IgG的C線的NC膜；
c.在相對濕度小于30%的條件下，取塑料基板12，將已包被的NC膜粘貼在基板的中部，在NC膜的T線一側(cè)粘貼膠體金墊，在膠體金墊另一側(cè)粘貼樣品墊；在NC膜的C線一側(cè)粘貼吸樣墊；鄰接接口相互疊壓I?2mm,粘貼好的大板切成3?5mm寬的檢測試紙條備用。
[0009]這樣設(shè)計的本發(fā)明，使用時結(jié)合帶有25-羥基維生素D3內(nèi)置標(biāo)準(zhǔn)曲線的免疫層析結(jié)果判讀記錄儀，實現(xiàn)對25-羥基維生素D3濃度的快速定量檢測，檢測范圍寬，適合血清、血漿、全血樣本，并適合臨床上單人份檢測。具有操作簡便、反應(yīng)快速、敏感性高、特異性強(qiáng)、適合現(xiàn)場檢測和經(jīng)濟(jì)實用等優(yōu)點。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1是本發(fā)明盒蓋頂面立體結(jié)構(gòu)示意圖；
圖2是本發(fā)明盒蓋底面立體結(jié)構(gòu)示意圖；
圖3是本發(fā)明盒體的立體結(jié)構(gòu)示意圖；
圖4是本發(fā)明檢測試紙條的立體結(jié)構(gòu)示意圖。
[0011]圖中:1.稀釋液孔2.加樣孔 3.觀察窗4.盒蓋
5.盒體6.檢測試紙條架
7.端護(hù)欄8.側(cè)護(hù)欄
9.插突起10.插孔柱
11.檢測試紙條 12.基板
13.樣本墊14.吸樣墊
15.膠體金墊16.T線
17.C 線18.NC 膜 19.十字架。
【具體實施方式】
[0012]下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說明。
[0013]一種25-羥基維生素D3定量免疫層析檢測試劑卡，包括依次形成有稀釋液孔1、加樣孔2和觀察窗3的長方形盒蓋4，長方形盒體5內(nèi)底部形成的檢測試紙條架6 —端形成有“[”形端護(hù)欄7，另一端形成有相向的板狀側(cè)護(hù)欄8，盒蓋4底面形成的插突起9與盒體5的插孔柱10，插接結(jié)合；以及沿檢測試紙條架6長度方向平鋪的檢測試紙條11，檢測試紙條11的塑料基板12兩端分別設(shè)置的樣品墊13和吸樣墊14，而在樣品墊13和吸樣墊14之間依次設(shè)置有含有膠體金標(biāo)記法的25-羥基維生素D3抗體的膠體金墊15，分別包被有25-羥基維生素D3-偶聯(lián)蛋白的T線16和抗鼠IgG的C線17的NC膜18。
[0014]從而形成對應(yīng)標(biāo)示T線和標(biāo)示C線位置的觀察窗，對應(yīng)樣品墊位置形成有稀釋液孔和加樣孔。
[0015]一種25-羥基維生素D3定量免疫層析檢測試劑卡的制備方法，包括依次形成有稀釋液孔1、加樣孔2和觀察窗3的長方形盒蓋4，長方形盒體5內(nèi)底部形成的檢測試紙條架6一端形成有“[”形端護(hù)欄7，另一端形成有相向的板狀側(cè)護(hù)欄8，盒蓋4底面形成的插突起9與盒體5的插孔柱10，插接結(jié)合；以及沿檢測試紙條架6長度方向平鋪的檢測試紙條11，檢測試紙條11的塑料基板12兩端分別設(shè)置的樣品墊13和吸樣墊14，而在樣品墊13和吸樣墊14之間依次設(shè)置有含有膠體金標(biāo)記的25-羥基維生素D3抗體的膠體金墊15，分別包被有25-羥基維生素D3-偶聯(lián)蛋白的T線16和抗鼠IgG的C線17的NC膜18。
[0016]所述樣品墊13和吸樣墊14之間依次設(shè)置有膠體金標(biāo)記25-羥基維生素D3抗體的膠體金墊15，分別包被有25-羥基維生素D3-偶聯(lián)蛋白的T線16和抗鼠IgG的C線17的NC膜18，其中:
a.膠體金標(biāo)記25-羥基維生素D3抗體的膠體金墊15的制備過程為:金顆粒直徑為30?50nm的膠體金溶液10ml，于燒杯內(nèi)用0.2M K2CO3調(diào)至pH7.5?8.5，加入25?50μ g25-羥基維生素D3抗體，室溫攪拌30min，加入終濃度為0.5%牛血清白蛋白，5% PEG20000封閉20min，12000g離心20分鐘，棄上清，用膠體金溶液復(fù)溶至80ml，按Iml溶液鋪20cm2的比例均勻地鋪在玻璃纖維膜或無紡布上，再置干燥間干燥3?5小時，制成膠體金墊15 ；
b.所述NC膜18抗體的包被過程為:以0.0lM pH 7.4磷酸鹽緩沖液(PBS)將25-羥基維生素D3-偶聯(lián)蛋白配制成0.8?1.6mg/ml的溶液，在NC膜18上用噴膜儀以I?1.5 μ I/cm的量包被T線16 ;另將抗鼠IgG配制成I?3mg/ml的溶液，用噴膜儀以上述相同參數(shù)包被C線17，劃線后將NC膜18干燥3?5小時，制成包被25-羥基維生素D3-偶聯(lián)蛋白的T線16和包被抗鼠IgG的C線17的NC膜18 ；
c.在相對濕度小于30%的條件下，取塑料基板12，將已包被的NC膜18粘貼在塑料基板12的中部，在NC膜18的T線16 —側(cè)粘貼膠體金墊15，在膠體金墊15另一側(cè)粘貼樣品墊13 ;在NC膜18的C線一側(cè)粘貼吸樣墊14 ;鄰接接口相互疊壓I?2mm，粘貼好的大板切成3?5mm寬的檢測試紙條11備用。
[0017]1.主要材料
1.1 25-羥基維生素D3抗體、25-羥基維生素D3-偶聯(lián)蛋白，標(biāo)準(zhǔn)品:芬蘭MEDIX有限公司產(chǎn)品；
羊抗鼠IgG抗體:用小鼠IgG免疫山羊自制；氯金酸:Sigma公司產(chǎn)品；
硝酸纖維素(NC)膜，Sartorius公司產(chǎn)品。
[0018]牛血清白蛋白(BSA)，聚乙二醇PEG20000。其它試劑均為市售常用分析純試劑。
[0019]1.2臨床樣本由天津朗賽生物科技有限公司在相關(guān)醫(yī)院獲得，共150份，其中血清、血漿和全血樣本各50份，25-羥基維生素D3含量分布區(qū)間為4?100 μ g/L之間的定值樣本。
[0020]1.3免疫層析結(jié)果結(jié)判讀記錄儀:型號:NS5001，天津中新科炬生物制藥有限公司
女口
廣叩ο
[0021]2.方法
2.1 25-羥基維生素D3抗體膠體金標(biāo)記，氯金酸一檸檬酸三鈉還原法制備金顆粒直徑為30?50nm的膠體金溶液，取三份膠體金溶液，分別用0.2M K2CO3將溶液調(diào)到pH7.0、pH7.5和pH8.0。然后將溶液置于磁力攪拌器上緩慢攪拌，按每IOml溶液加入25 μ g，或50 μ g，或75 μ g將標(biāo)記用25-羥基維生素D3抗體緩慢滴加到膠體金溶液中，繼續(xù)攪拌30min，再加入到終濃度為0.5%的BSA和5% PEG 20000進(jìn)行封閉20min，標(biāo)記結(jié)束后以12000g離心，棄上清，沉淀按80%原體積復(fù)溶至3種不同配方的膠體金工作液中任意一種，配方 I:100mM TRIS.Cl, ρΗ7.6，含 1%BSA、5% 蔗糖，1% Triton XlOO ;或配方 2:20mM TRIS.Cl，ρΗ7.0，含 0.5%BSA、5% 蔗糖，0.5% Triton XlOO ;或配方 3:20mM TRIS.Cl，ρΗ6.5，含
0.2%BSA、5%蔗糖，0.2% Triton XlOO0然后將標(biāo)記膠體金溶液按Iml溶液鋪20cm2的比例加樣于無紡布上，在溫度20?25°C，相對濕度在< 30%的干燥間干燥3?5小時，制成膠體金墊15。
[0022]2.2 NC膜18的長度2?2.5cm,包被時用0.0lM pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)將用于包被的25-輕基維生素D3-偶聯(lián)蛋白稀釋成0.8mg/ml或lmg/ml、或1.5mg/ml,羊抗鼠IgG分別稀釋成lmg/ml、2mg/ml，然后用噴膜儀在NC膜上按1.4 μ Ι/cm進(jìn)行分別劃線包被，包被完成后將NC膜18在溫度20?25°C、相對濕度在< 30%的干燥間干燥3?5小時。
[0023]2.3試劑卡組裝在相對濕度小于30%的條件下，將已包被的NC膜18粘貼在塑料基板12的中部，在NC膜18的T線16 —側(cè)粘貼膠體金墊15，在膠體金墊15另一側(cè)粘貼樣品墊13 ;在NC膜18的C線17 —側(cè)粘貼吸樣墊14 ;各粘貼部分接口相互疊壓I?2mm，粘貼好的大板切成3?5mm寬的檢測試紙條11。將檢測試紙條11平放在盒體5內(nèi)的檢測試紙條架6上，一端由端護(hù)欄7限位，另一端有側(cè)護(hù)欄8限位。然后蓋上盒蓋4，盒蓋4底面的插突起9與盒體5內(nèi)的插孔柱10插接結(jié)合，壓緊，內(nèi)設(shè)檢測試紙條11的盒體5與盒蓋4結(jié)為一體，完成裝配。
[0024]2.4檢測試紙條工藝參數(shù)調(diào)試將不同濃度標(biāo)記、包被的組合進(jìn)行配對，制備小樣，利用25-羥基維生素D3標(biāo)準(zhǔn)品對上述組合進(jìn)行測試，尋找最佳組合。本發(fā)明中的樣品墊13、膠體金墊15、NC膜18和吸樣墊14從塑料基板12 —端依次排列至另一端。
[0025]檢測試紙條11長度為7?9cm，樣品墊2長度2.5?3.5cm ;膠體金墊15長度為
0.6?Icm ;NC膜18為孔徑8?12微米的多孔樣結(jié)構(gòu)膜，長度2?2.5cm，吸樣墊14為吸水濾紙，長度為2?2.5cm ;寬度均為3?5mm,樣品墊13為玻璃纖維膜或無紡布。
[0026]25-羥基維生素D3抗體為專一識別25-羥基維生素D3的抗體，與人體其它正常蛋白沒有交叉反應(yīng)。偶聯(lián)蛋白為BSA，0VA，KLH等大分子蛋白，NC膜18為孔徑8?12微米的多孔樣結(jié)構(gòu)膜。
[0027]2.5儀器曲線參數(shù)設(shè)置確定好檢測試紙條工藝參數(shù)后，分別用0、10、20、40、75、100ng/ml的25-羥基維生素D3標(biāo)準(zhǔn)品對檢測試劑卡進(jìn)行測試，不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品顯示出不同強(qiáng)度色帶，將相應(yīng)強(qiáng)度的色帶數(shù)字化后，計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線，輸入免疫層析結(jié)果判讀記錄儀中，完成儀器曲線參數(shù)設(shè)置，用于對檢測結(jié)果的定量判定，檢測范圍為10?100ng/mL。
[0028]2.6檢測方法
O儀器設(shè)置，預(yù)將25-羥基維生素D3內(nèi)置標(biāo)準(zhǔn)曲線導(dǎo)入到免疫層析結(jié)果判讀記錄儀內(nèi)，設(shè)置好相關(guān)參數(shù)；
2)將本試驗制備的試劑及樣本平衡至室溫，取出檢測卡，平放；
3)精確吸取20μ I血清或血漿樣本，樣本為全血時吸取30 μ I樣本，加入到檢測試劑卡的加樣孔2 ；
4)再吸取100μ I稀釋液加入到檢測試劑卡的稀釋液孔I中，計時，15?20分鐘內(nèi)用
免疫層析結(jié)果判讀記錄儀定量判定結(jié)果。
[0029]2.7臨床樣本檢測試劑制備完成后,按檢測方法對所有臨床樣本進(jìn)行檢測,并分析檢測結(jié)果。
[0030]3 結(jié)果
3.1檢測試紙條參數(shù)確定根據(jù)小樣的檢測結(jié)果，確定了檢測試劑卡的最佳標(biāo)記PH值為7.5 ；25-羥基維生素D3抗體最佳標(biāo)記量為25 μ g/10ml膠體金溶液；最佳的膠體金工作液為配方 2:20mM TRIS.Cl, ρΗ7.0，含 0.5%BSA、5% 蔗糖，0.5% Triton XlOO ;最佳包被25-羥基維生素D3-偶聯(lián)蛋白濃度為lmg/mL。但以上參數(shù)在制備不同批次產(chǎn)品時可能需要適當(dāng)調(diào)整。
[0031]3.2臨床樣本檢測對150份臨床定值樣本檢測，20份低于10ng/ml的樣本檢測結(jié)果均報告低于10ng/ml，130份在線性范圍內(nèi)的樣品檢測值和樣本原值的差異CV小于20%,大于25%的離群值只有5份，比例為4% ;可能是因為方法學(xué)不同造成的。R2X).95。檢測結(jié)果表明制備的檢測試劑卡性能良好，適合用于臨床檢測，特別是滿足了客戶對快速現(xiàn)場檢測的需要。
【權(quán)利要求】
1.一種25-羥基維生素D3定量免疫層析檢測試劑卡，包括依次形成有稀釋液孔(I)、加樣孔(2)和觀察窗(3)的盒蓋(4)，盒體(5)內(nèi)底部形成的檢測試紙條架(6) —端形成有端護(hù)欄(7)，另一端形成有側(cè)護(hù)欄(8)，盒蓋(4)底面形成的插突起(9)與盒體(5)的插孔柱(10)插接結(jié)合；以及沿檢測試紙條架(6)長度方向平鋪的檢測試紙條(11)，檢測試紙條(11)的塑料基板(12)兩端分別設(shè)置的樣品墊(13)和吸樣墊(14)，其特征在于:樣品墊(13)和吸樣墊(14)之間依次設(shè)置有:含有膠體金標(biāo)記的25-羥基維生素D3抗體的膠體金墊(15)，分別包被有25-羥基維生素D3偶聯(lián)蛋白的T線(16)和抗鼠IgG的C線(17)的NC膜(18)。
2.權(quán)利要求1所述25-羥基維生素D3定量免疫層析檢測試劑卡的制備方法，包括依次形成有稀釋液孔(I)、加樣孔(2)和觀察窗(3)的盒蓋(4)，盒體(5)內(nèi)底部形成的檢測試紙條架(6)—端形成有端護(hù)欄(7)，另一端形成有側(cè)護(hù)欄(8)，盒蓋(4)底面形成的插突起(9)與盒體(5 )的插孔柱(10 )插接結(jié)合；以及沿檢測試紙條架(6 )長度方向平鋪的檢測試紙條(11)，檢測試紙條(11)的塑料基板(12)兩端分別設(shè)置有樣品墊(13)和吸樣墊(14)，其特征在于:樣品墊(13)和吸樣墊(14)之間依次設(shè)置有:含有膠體金標(biāo)記的25-羥基維生素D3抗體的膠體金墊(15)，分別包被有25-羥基維生素D3偶聯(lián)蛋白的T線(16)和抗鼠IgG的C 線(17)的 NC 膜(18)； 所述樣品墊(13)和吸樣墊(14)之間依次設(shè)置有含有膠體金標(biāo)記25-羥基維生素D3抗體的膠體金墊(15)，分別包被有25-羥基維生素D3偶聯(lián)蛋白的T線(16)和抗鼠IgG的C線(17)的NC膜(18)，其中: a.含有膠體金標(biāo)記的25-羥基維生素D3抗體的膠體金墊(15)的制備過程為:金顆粒直徑為30?50nm的膠體金溶液10ml，于燒杯內(nèi)用0.2M K2CO3調(diào)至pH7.5?8.5，加入25?75 Ug 25-羥基維生素D3抗體，室溫攪拌30min，加入終濃度為0.5%牛血清白蛋白，5% PEG20000封閉20min，12000g離心20分鐘，棄上清，用膠體金溶液復(fù)溶至80ml，按Iml溶液鋪20cm2的比例均勻地鋪在玻璃纖維膜或無紡布上，置干燥間干燥3?5小時，制成膠體金墊(15)； b.所述NC膜(18)抗體的包被過程為:以0.0lM pH 7.4磷酸鹽緩沖液將25-羥基維生素D3-偶聯(lián)蛋白配制成0.8?1.6mg/ml的溶液，在NC膜(18)上用噴膜儀以I?1.5 μ I/cm的量包被T線(16);另將抗鼠IgG配制成I?3mg/ml的溶液，用噴膜儀以上述相同參數(shù)包被C線(17)，劃線后將NC膜(18)干燥3?5小時，制成包被25-羥基維生素D3-偶聯(lián)蛋白的T線(16)和包被抗鼠IgG的C線(17)的NC膜(18); c.在相對濕度小于30%的條件下，取塑料基板12，將已包被的NC膜(18)粘貼在塑料基板(12 )的中部，在NC膜(18 )的T線(16 ) —側(cè)粘貼膠體金墊(15 )，在膠體金墊(15 )另一側(cè)粘貼樣品墊(13);在％膜(18)的C線(17) —側(cè)粘貼吸樣墊(14);鄰接接口相互疊壓I?2mm,粘貼好的大板切成3?5mm寬的檢測試紙條(11)備用。
【文檔編號】G01N33/532GK103439519SQ201310394860
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年9月3日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月3日
【發(fā)明者】葉濤 申請人:天津朗賽生物科技有限公司