免疫彩色二氧化硅微球的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種免疫彩色二氧化硅微球，可以作為免疫膠體金的替代物應用于免疫層析法中，克服目前同一粒徑免疫膠體金只能顯示一種顏色只適用于檢測一個指標的問題；同時免疫彩色二氧化硅微球也解決了現(xiàn)有免疫彩色聚苯乙烯微球染料易泄露、合成困難、尺寸難以控制、水溶性和生物相容性差等缺陷。本發(fā)明的免疫彩色二氧化硅微球，使用彩色二氧化硅微球作為彩色標記物，硅烷偶聯(lián)劑通過化學鍵將氨基或其他活性基團修飾到彩色二氧化硅球表面上，使二氧化硅微球表面具有活性基團，再通過化學鍵將抗原或者抗體連接到微球表面制備得到免疫彩色二氧化硅微球。上述的本發(fā)明免疫彩色氧化硅微球具有很好的生物活性且粒徑均勻、顏色豐富。
【專利說明】免疫彩色二氧化硅微球

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種免疫二氧化硅微球。

【背景技術(shù)】
[0002]免疫彩色微球是一類在化學分析和生物分析領(lǐng)域具有廣泛應用前景的高科技納米材H。所謂的彩色微球就是指那些粒徑在1nm到10 μ m之間，且本身具有鮮艷顏色的納米粒子，當其被修飾上抗原或者抗體以后就是免疫彩色微球。免疫彩色微球具有鮮艷顏色，和無色的微球相比，可以增加檢測的靈敏度，同時多種顏色微球可以實現(xiàn)對一個樣品中不同待測物的同時檢測。目前，唯一兩種的免疫彩色微球是免疫膠體金4和免疫聚苯乙烯乳膠微球5。膠體金是一種金屬原子聚集體，它的顏色通常為紅色，另外也可以通過改變其粒徑而使其顯示其他顏色6。膠體金修飾抗體或抗原以后就形成免疫膠體金。彩色聚苯乙烯微球，是將有機染料包裹在聚苯乙烯微球當中，而顯示出不同的顏色3。當將抗體或者抗原修飾到彩色聚苯乙烯微球后就會得到免疫彩色聚苯乙烯微球7。
[0003]免疫膠體金和免疫彩色聚苯乙烯微球都未能被廣泛的應用化學分析和生物分析領(lǐng)域。原因就是由于這兩種納米材料本身的原因造成的。膠體金的缺點是:膠體金的顏色不易控制，原因是膠體金的顏色是由粒徑?jīng)Q定，粒徑受反應條件和反應時間的影響，膠體金的生成速度很快，經(jīng)常很難控制其粒徑從而得到所需顏色的膠體金。另外不用顏色膠體金的粒徑不同，粒徑不同會影響膠體金的物理化學性質(zhì)，這樣不同顏色的膠體金就不適合在一個試劑中同時進行檢測。彩色聚苯乙烯微球的缺點是:彩色聚苯乙烯微球很容易發(fā)生顏料泄露。染料往往是通過溶脹的方法被包裹到聚苯乙烯微球當中，染料與聚苯乙烯微球之間并沒有形成牢固的化學鍵而是通過物理吸附的方式被包裹，染料很容易從微球當中泄露，影響其應用。雖然有文獻報道將染料與聚乙烯單體同時聚合，將染料作為單體之一構(gòu)成聚合物，但是大部分染料都會影響聚合反應的進行，只有極少數(shù)實驗室自行設(shè)計的染料可以用于合成彩色微球，無法利用商品化的染料限制了這種方法的應用。
[0004]


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]鑒于免疫彩色微球的廣闊應用前景，和目前已有免疫彩色微球的缺點，本發(fā)明的目的在于針對以上問題，發(fā)明一種免疫彩色二氧化硅微球，這種免疫彩色二氧化硅微球可以替代免疫層析法中的免疫膠體金和間接凝集試驗中的免疫聚苯乙烯彩色微球。本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是:利用抗原或抗體將彩色二氧化硅修飾，得到具有生物活性的免疫彩色二氧化硅微球。本發(fā)明針對彩色二氧化硅表面的活性基團，及其與抗原或抗體的連接問題，通過深入研究，發(fā)現(xiàn)硅烷偶聯(lián)劑可以使得二氧化硅微球表面帶有活性基團，再在微球體系中依次加入N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)U-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺(EDC)和生物活性物質(zhì)(抗原或者抗體)得到具有生物活性的免疫彩色二氧化硅微球。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案:本發(fā)明涉及一種免疫彩色二氧化硅微球，在生物檢測盒生物分析領(lǐng)域(如免疫層析法和間接凝集試驗)有廣闊的應用前景。對于免疫彩色二氧化硅微球的制備選用分布修飾的方案:選用已經(jīng)制備好的粒徑均勻的彩色二氧化硅微球，首先使用硅烷偶聯(lián)劑使其表面帶上活性基團(如氨基等)，使其表面帶有可以和的化學基團如氨基等，然后讓彩色二氧化硅微球與丁二酸酐反應，使得微球表面的氨基轉(zhuǎn)變成羧基，再采用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)交聯(lián)劑將抗原或抗體連接到彩色二氧化硅微球表面進行修飾。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0007]圖1實例一中雞白痢免疫彩色二氧化硅微球的合成步驟示意圖。
[0008]圖2實例二中阪崎腸桿菌免疫彩色二氧化硅微球的合成步驟示意圖。
[0009]【具體實施方式】:以下實例可以有助于了解本發(fā)明，但本
【發(fā)明內(nèi)容】
包括但不局限于下列實施例內(nèi)容
實施例1
彩色二氧化硅微球的活化:將合成好的彩色二氧化硅微球10mg用超純水清洗三次，分散到20 mL水中超聲10 min使微球均勻分散，分別加入1.4 mL冰乙酸和0.2 mL的3-(2-氨基乙基氨基)丙基-三甲氧基硅烷攪拌均勻后持續(xù)震蕩反應lh。將反應后的微球用水清洗3次，分散到10 mL 丁二酸酐和DMF的混合溶液中在通氮氣條件下持續(xù)振蕩反應5 h，離心、清洗后的微球在4 1:條件下可以保存?zhèn)溆谩?br> [0010]免疫彩色二氧化硅微球的制備:配制pH 6.8濃度為0.1 mo I L-1的嗎啉乙磺酸緩沖液(MES)，在5 mL MES緩沖液中分別加入500 mg的N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和500 mg的1-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)-碳化二亞胺(EDC)，用于微球表面羧基的活化。離心得到的活化微球分散到PH 7.3濃度0.1 mo I L-1 PBS中。取10 mL分散好的活化微球與10KL雞白痢抗體，孵育4 h，用PBS清洗、離心后得到免疫彩色二氧化硅微球，分散到5 mL PBS中，4 °C條件下保存?zhèn)溆谩?br> [0011]實施例2
二氧化硅顆粒的氨基硅烷化及抗體標記取10mg彩色二氧化硅微球懸混于1mL甲醇中加入0.30mL 3-(2-氨基乙基氨基)丙基-三甲氧基硅烷超聲分散15min后再于室溫下攪拌反應6h離心分離然后依次采用甲醇和PBS溶液(pH7.0)進行超聲洗滌再離心分離即完成彩色二氧化硅微球的氨基硅烷化。取1mL氨基硅烷化的彩色二氧化硅微球懸池液先超聲分散15min再加入5.0mL2.5%戍二醒于室溫下攪拌反應3h再離心分離即完成顆粒的醛基化將醛基化的彩色二氧化硅微球懸混于4.0mLPBS溶液超聲分散15min后加入LOmL阪崎腸桿菌抗體原液于37下溫育Ih離心分離即制得阪崎腸桿菌抗體-彩色二氧化硅微球然后將顆粒懸混于4.0mLPBS溶液中加入ImL濃度為10mg/mL的BSA于室溫下攪拌反應1.5h以封閉阪崎腸桿菌抗體-彩色二氧化娃微球表面非特異性結(jié)合醛基位點離心分離最后以PBS溶液超聲洗滌并懸混于3.0mLPBS溶液直接用于分析或于4下保存一般可穩(wěn)定2個月(合成步驟見圖2)
本發(fā)明優(yōu)點:
免疫彩色二氧化硅微球作為免疫膠體金替代品具備以下優(yōu)勢:相同粒徑的免疫彩色二氧化硅微球可以具備不同的顏色，免疫膠體金同一種粒徑只能顯示一種顏色。免疫膠體最常被用于免疫層析領(lǐng)域，以免疫層析領(lǐng)域為例，免疫層析中所用標記粒子要求粒徑不能超過50nm，免疫彩色二氧化硅粒徑可以小于50nm，且具有很好的單分散性。對于相同粒徑的免疫彩色二氧化硅微球可以不同顏色微球標記不同抗體，從而實現(xiàn)免疫層析法，一次檢測多項指標，這是免疫膠體金所無法實現(xiàn)的。彩色二氧化硅微球表面含有大量的羥基，很容易進行羧基化和氨基化，然后通過化學鍵與各種抗體聯(lián)接，因此不同種類免疫彩色微球很容易制得；免疫彩色二氧化硅微球需要具有很好的親水性；免疫彩色二氧化硅微球和免疫膠體金比較，更加經(jīng)濟，易于制備。
[0012]免疫彩色二氧化硅微球與免疫聚苯乙烯彩色微球相比具以下優(yōu)勢:免疫彩色二氧化硅微球染色更穩(wěn)定，免疫聚苯乙烯微球染色多采用包埋法，在遇到有機溶劑時，會因溶脹而造成染料泄露，染色不夠牢固，彩色二氧化硅微球中，有機染料通過化學鍵連接到微球上，徹底克服染料泄露的問題；免疫彩色二氧化硅微球具有更好的親水性和生物相容性；免疫彩色二氧化硅微球更易制備，二氧化硅微球表面的羥基可以通過與硅烷偶聯(lián)劑等反應實現(xiàn)氨基和羧基化，從而通過化學鍵與各種抗體聯(lián)接；二氧化硅密度也比聚苯乙烯大，因此，免疫彩色二氧化硅微球比免疫聚苯乙烯微球更易通過離心方式進行分離和清洗。
[0013]基于以上的論述，免疫彩色二氧化硅微球在免疫學檢測領(lǐng)域有廣闊的應用前景。
[0014]參考文獻:
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【權(quán)利要求】
1.免疫彩色二氧化硅微球，其特征是:彩色二氧化硅微球帶上抗原或者抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫彩色二氧化硅微球，其特征是:抗體或抗原通過化學鍵連接到彩色二氧化硅微球上。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種免疫彩色二氧化硅微球，其特征是微球粒徑為10納米-10微米。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗體，其包括:IgG、IgM、IgA、IgD、IgE0
【文檔編號】G01N33/53GK104422760SQ201310397734
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年9月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月5日
【發(fā)明者】竇文超, 趙廣英, 楊磊 申請人:竇文超