一種基于藻類葉綠素?zé)晒獾乃w綜合毒性快速檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種基于藻類葉綠素?zé)晒獾乃w綜合毒性快速檢測(cè)方法。該方法選擇毒性敏感的單細(xì)胞斜生柵藻作為受試生物，對(duì)待測(cè)水樣實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組進(jìn)行24h適應(yīng)性培養(yǎng)，測(cè)量?jī)山M樣品藻類的快相葉綠素?zé)晒猓治霁@得主導(dǎo)光合作用能量傳遞過(guò)程的熒光參數(shù)，計(jì)算出實(shí)驗(yàn)組的待測(cè)水體對(duì)藻類光合作用的抑制率，根據(jù)物質(zhì)毒性強(qiáng)度與光合作用抑制率間的劑量-效應(yīng)關(guān)系，計(jì)算得到待測(cè)水體的綜合毒性強(qiáng)度。該方法具有毒性響應(yīng)靈敏、測(cè)試簡(jiǎn)單快速等特點(diǎn)，是生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)快速評(píng)價(jià)和突發(fā)性污染事故應(yīng)急監(jiān)測(cè)的新手段。
【專利說(shuō)明】 一種基于藻類葉綠素?zé)晒獾乃w綜合毒性快速檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種基于藻類葉綠素?zé)晒獾乃w綜合毒性快速檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的迅速發(fā)展，工農(nóng)業(yè)廢水和生活污水日益增多，嚴(yán)重超出了自然界自身的凈化能力，給水生生態(tài)系統(tǒng)和人類生存環(huán)境構(gòu)成了很大的沖擊。由于污染物化學(xué)組成、結(jié)構(gòu)和來(lái)源的復(fù)雜性，及各種化學(xué)物質(zhì)之間的拮抗、抑制和協(xié)同作用，使得傳統(tǒng)的理化分析無(wú)法直接、全面地反映出多種污染物質(zhì)對(duì)生態(tài)環(huán)境的綜合影響。生物毒性檢測(cè)方法能夠綜合多種污染物質(zhì)的相互作用，判定污染物質(zhì)濃度和生物效應(yīng)之間的直接關(guān)系，直觀地反映污染水體對(duì)生物種群的綜合毒性，彌補(bǔ)理化方法的不足，因而在水體綜合毒性評(píng)價(jià)方面極具優(yōu)勢(shì)。
[0003]水體綜合毒性的生物檢測(cè)方法目前主要有:魚類毒性實(shí)驗(yàn)、蚤類毒性實(shí)驗(yàn)、藻類毒性實(shí)驗(yàn)、微生物毒性實(shí)驗(yàn)等。其中，藻類毒性實(shí)驗(yàn)采用個(gè)體小、繁殖快的藻類細(xì)胞作為受試生物，具有毒物敏感、可直接觀察細(xì)胞水平上的中毒癥狀等特點(diǎn)，在水體綜合毒性分析與檢測(cè)中具有廣泛的應(yīng)用前景。目前，藻類毒性實(shí)驗(yàn)主要通過(guò)分析有毒物質(zhì)對(duì)藻類對(duì)呼吸作用、酶的活性、蛋白含量和細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用來(lái)檢測(cè)水體的綜合毒性強(qiáng)度。其中，基于藻類細(xì)胞生長(zhǎng)速率的藻類生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)已經(jīng)成為化學(xué)品毒性檢測(cè)的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)方法，該方法檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，但實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)，需要重復(fù)實(shí)驗(yàn)，操作比較繁瑣?；谠孱惣?xì)胞呼吸作用、酶的活性、蛋白含量的毒性實(shí)驗(yàn)也存在實(shí)驗(yàn)工作量大，實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)等問(wèn)題。
[0004]綜上所述，藻類是一種理想的水體綜合毒性的受試生物，然而，多數(shù)藻類毒性實(shí)驗(yàn)存在實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)，需要重復(fù)實(shí)驗(yàn)，操作比較繁瑣等缺陷。鑒于此，本文發(fā)明了一種藻類快相葉綠素?zé)晒獾乃w綜合毒性快速檢測(cè)方法，不僅對(duì)水體綜合毒性具有較快的反應(yīng)速度，而且能夠?qū)崿F(xiàn)毒性強(qiáng)度的定量檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種基于藻類葉綠素?zé)晒獾乃w綜合毒性快速檢測(cè)方法。該方法利用單細(xì)胞藻類光合系統(tǒng)對(duì)毒性響應(yīng)的敏感性，以不易受干擾的快相葉綠素?zé)晒庾鳛楣夂献饔锰结?，分析有毒物質(zhì)對(duì)藻類細(xì)胞光合作用的抑制程度，定量檢測(cè)水體綜合毒性強(qiáng)度。該方法具有毒性響應(yīng)靈敏、測(cè)試快速、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，能夠?qū)崿F(xiàn)水體綜合毒性強(qiáng)度快速定量檢測(cè)，適用于水生生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)的快速評(píng)價(jià)與突發(fā)性水污染事故的應(yīng)急監(jiān)測(cè)。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
[0007]一種基于藻類葉綠素?zé)晒獾乃w綜合毒性快速檢測(cè)方法，包括以下步驟:
[0008](I)受試藻類培養(yǎng)
[0009]以斜生柵藻作為受試生物，并配制SE培養(yǎng)基，高溫高壓滅菌，將藻種轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基中，放入光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行的擴(kuò)大、馴化培養(yǎng)和藻種轉(zhuǎn)接，使藻種達(dá)到純化和同步生長(zhǎng)，培養(yǎng)條件設(shè)置如下:光照2000-30001ux、光暗比14h: 10h、pH值8± 1、溫度25±2°C，每日搖動(dòng)I次，在藻類培養(yǎng)過(guò)程中，定期利用顯微細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)量藻類細(xì)胞生物量，繪制藻類生長(zhǎng)曲線，最終得到處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞濃度在IO4CelVmL量級(jí)的受試藻液；
[0010]實(shí)驗(yàn)在250mL的錐形瓶中進(jìn)行，將受試藻液分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組IOOmL,在實(shí)驗(yàn)組藻液中按體積比1:1加入待測(cè)水樣，在對(duì)照組藻液中按體積比1:1加入空白水樣，即蒸餾水)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組設(shè)定3個(gè)平行樣，培養(yǎng)過(guò)程中，每天搖動(dòng)錐形瓶I次，通過(guò)改變培養(yǎng)瓶在光照培養(yǎng)箱中的位置，盡量保持實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的培養(yǎng)環(huán)境一致；
[0011](2)多熒光參數(shù)的毒性測(cè)試反應(yīng)終點(diǎn)建立
[0012]①快相葉綠素?zé)晒鉁y(cè)量
[0013]快相葉綠素?zé)晒獾臏y(cè)量采用英國(guó)Chelsea公司高速重復(fù)脈沖式熒光儀FASTflow，測(cè)量過(guò)程中，高速脈沖光激發(fā)光合系統(tǒng)II的反應(yīng)中心產(chǎn)生大量電子，阻塞電子傳遞鏈，關(guān)閉光化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生快相葉綠素?zé)晒猓挥捎诠夂线^(guò)程電子傳遞過(guò)程中電子受體Qa和PQ的氧化還原周期不同，可以通過(guò)調(diào)節(jié)FASTflow激發(fā)光時(shí)序控制傳遞鏈電子阻塞位置，實(shí)現(xiàn)單周轉(zhuǎn)和多周轉(zhuǎn)兩種模式激發(fā)；
[0014]②快相葉綠素?zé)晒夥治?br> [0015]單周轉(zhuǎn)激發(fā)模式ST:使用高強(qiáng)度和高頻率激發(fā)脈沖光在Qa單個(gè)光化學(xué)周轉(zhuǎn)120-160 u s內(nèi)將其全部還原，在Qa處形成電子堆積，打斷光合作用的電子傳遞鏈，產(chǎn)生ST快相葉綠素?zé)晒猓?1-3)式可擬合和推算出PSII的有效吸收截面Opsn、電荷分離效率Oq和最大光量子效率A C^sat等熒光參數(shù)；
【權(quán)利要求】
1.一種基于藻類葉綠素?zé)晒獾乃w綜合毒性快速檢測(cè)方法，其特征在于包括以下步驟: (1)受試藻類培養(yǎng) 以斜生柵藻作為受試生物，并配制SE培養(yǎng)基，高溫高壓滅菌，將藻種轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基中，放入光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行的擴(kuò)大、馴化培養(yǎng)和藻種轉(zhuǎn)接，使藻種達(dá)到純化和同步生長(zhǎng)，培養(yǎng)條件設(shè)置如下:光照2000-30001ux、光暗比14h: 10h、pH值8± 1、溫度25±2°C，每日搖動(dòng)I次，在藻類培養(yǎng)過(guò)程中，定期利用顯微細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)量藻類細(xì)胞生物量，繪制藻類生長(zhǎng)曲線，最終得到處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞濃度在IO4CelVmL量級(jí)的受試藻液； 實(shí)驗(yàn)在250mL的錐形瓶中進(jìn)行，將受試藻液分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組IOOmL,在實(shí)驗(yàn)組藻液中按體積比1:1加入待測(cè)水樣，在對(duì)照組藻液中按體積比1:1加入空白水樣，即蒸餾水)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組設(shè)定3個(gè)平行樣，培養(yǎng)過(guò)程中，每天搖動(dòng)錐形瓶I次，通過(guò)改變培養(yǎng)瓶在光照培養(yǎng)箱中的位置，盡量保持實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的培養(yǎng)環(huán)境一致； (2)多熒光參數(shù)的毒性測(cè)試反應(yīng)終點(diǎn)建立 ①快相葉綠素?zé)晒鉁y(cè)量 快相葉綠素?zé)晒獾臏y(cè)量采用英國(guó)Chelsea公司高速重復(fù)脈沖式熒光儀FASTflow，測(cè)量過(guò)程中，高速脈沖光激發(fā)光合系統(tǒng)II的反應(yīng)中心產(chǎn)生大量電子，阻塞電子傳遞鏈，關(guān)閉光化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生快相葉綠素?zé)晒猓挥捎诠夂线^(guò)程電子傳遞過(guò)程中電子受體Qa和PQ的氧化還原周期不同，可以通過(guò)調(diào)節(jié)FASTflow激發(fā)光時(shí)序控制傳遞鏈電子阻塞位置，實(shí)現(xiàn)單周轉(zhuǎn)和多周轉(zhuǎn)兩種模式激發(fā)； ②快相葉綠素?zé)晒夥治?單周轉(zhuǎn)激發(fā)模式ST:使用高強(qiáng)度和高頻率激發(fā)脈沖光在Qa單個(gè)光化學(xué)周轉(zhuǎn)120-160 u s內(nèi)將其全部還原，在Qa處形成電子堆積，打斷光合作用的電子傳遞鏈，產(chǎn)生ST快相葉綠素?zé)晒?，利?1-3)式可擬合和推算出PSII的有效吸收截面Opsil、電荷分離效率Oq和最大光量子效率A C^sat等熒光參數(shù)；
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK103728284SQ201310413222
【公開(kāi)日】2014年4月16日 申請(qǐng)日期:2013年9月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月11日
【發(fā)明者】殷高方, 肖雪, 張玉鈞, 趙南京, 段靜波, 胡麗, 方麗, 石朝毅, 甘婷婷, 余曉婭, 董欣欣, 劉建國(guó), 劉文清 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院安徽光學(xué)精密機(jī)械研究所