一種基于應用代謝組學對中藥知柏地黃丸療效的試驗方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于應用代謝組學對中藥知柏地黃丸療效的試驗方法，該方法包括：將實驗動物分成對照組，糖尿病腎病模型組，糖尿病腎病給藥組三組，進行注射處理并尿液、血清和腎臟組織樣本；將三組大鼠的腎臟組織，用10％中性甲醛固定后石蠟包埋、切片，制片，常規(guī)蘇木精-伊紅染色后，在光學顯微鏡下觀察腎臟組織病理學變化；血清樣本和尿液樣本化學指標的測定和組織病理學的檢測；制備血清、尿液、腎臟的組織樣本并獲得1H?NMR譜的數(shù)據(jù)；采用統(tǒng)計學的方法，進行NMR數(shù)據(jù)處理與模式識別分析；對不同組大鼠的生理、生化重要指標進行對比分析。本發(fā)明通過代謝組學技術能獲得機體大量的內(nèi)源性代謝物的信息，篩選知柏地黃丸中有效成分引起的代謝物變化。
【專利說明】一種基于應用代謝組學對中藥知柏地黃丸療效的試驗方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于藥品研究【技術領域】，尤其涉及一種基于應用代謝組學對中藥知柏地黃丸療效的試驗方法。
【背景技術】
[0002]知柏地黃丸(Zhibai DihuangPill，ZDP)是一種常用中成藥，是由補陰經(jīng)典代表方劑六味地黃丸(熟地黃，山萸肉，山藥，澤瀉，牡丹皮和茯苓)加上知母和黃柏炮制而成，力口強了滋腎陰清相火的作用，近年來有人報道該藥可以保護實驗動物因糖尿病腎病導致的腎臟損傷，臨床研究也發(fā)現(xiàn)聯(lián)合服用化學藥物和知柏地黃丸的病人其治療效果要明顯好于單獨用化學藥物的患者，可是，由于該藥的多成分及其作用的多通路和多靶點，其作用機制仍不清楚，知柏地黃丸的作用機制，理論上應該是“多成分，多靶點”，但往往缺乏有效的試驗方法和技術手段加以證明，其活性成分復雜，和通過多途徑和多靶點對機體發(fā)揮作用的特點，這給研究中藥防治疾病的確切的分子機制帶來極大的困難。
[0003]代謝組學是研究生物體內(nèi)源性代謝物的整體及其受內(nèi)在或外在因素影響的科學，其廣泛的應用已深入到生物代謝、疾病診斷和藥物整體藥效毒性等研究領域，其“整體論”的哲學思想與中藥作用的“多成分、多靶點”特征相一致，能從整體上評價知柏地黃丸“多成分，多靶點”的藥效作用，并探討其可能的作用機制。
[0004]以往的試驗方法沿用了化學藥物(西藥)研發(fā)常用的“單組份單靶點”理論模型和思路，其中心思想包括首先發(fā)現(xiàn)活性組份，進行分離鑒定，進而對活性成份或其化學衍生物進行藥理、毒理、臨床等方面的研究，盡管這種方法的研究取得了相當?shù)某删汀５?，也存在一些缺點:(I)知柏地黃丸中有多種有效成分，具有多種藥物效應；(2)每個活性化合物組份可能有多個作用靶點，直接影響多個生物過程；(3)各個組份之間存在協(xié)同作用、相互影響，中藥配伍的思想基礎就是“協(xié)同作用”，單一的化學成分和藥理指標不能對知柏地黃丸的藥物效應清楚的認識；此外，許多單組分化學藥物，不僅可以同時對不同的器官(如肝臟和腎臟)有效應。
[0005]現(xiàn)有技術存在的不能對知柏地黃丸中多種有效成分進行測定和研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明實施例的目的在于提供一種基于應用代謝組學對中藥知柏地黃丸療效的試驗方法，旨在解決現(xiàn)有技術存在的不能對知柏地黃丸中多種有效成分進行測定和研究的問題。
[0007]本發(fā)明實施例是這樣實現(xiàn)的，一和基于應用代謝組學對中藥知柏地黃丸療效的試驗方法，該基于應用代謝組學對中藥知柏地黃丸療效的試驗方法包括以下步驟:
[0008]步驟一，將實驗動物分成對照組，糖尿病腎病模型組，糖尿病腎病給藥組三組，進行注射處理并尿液、血清和腎臟組織樣本；
[0009]步驟二，將三組大鼠的腎臟組織，周10%中性甲醛固定后石蠟包埋、切片，制片，常規(guī)蘇木精-伊紅染色后，在光學顯微鏡下觀察腎臟組織病理學變化；
[0010]步驟三，血清樣本和尿液樣本化學指標的測定和組織病理學的檢測；
[0011]步驟四，制備血清、尿液、腎臟的組織樣本并獲得1H NMR譜的數(shù)據(jù)；
[0012]步驟五，采用統(tǒng)計學的方法，進行NMR數(shù)據(jù)處理與模式識別分析；
[0013]步驟六，對不同組大鼠的生理、生化重要指標進行對比分析；
[0014]步驟七，對不同組大鼠進行代謝組學分析、血清樣本中的代謝物分析、腎臟樣本中的代謝物分析。
[0015]進一步，在步驟一中，動物處理及樣品收集的具體方法為:實驗動物分為三組:對照組，糖尿病腎病模型組，糖尿病腎病給藥組，除對照組外，所有動物腹腔注射STZ(70mg /kg)造成糖尿病模型，一個月后尿中蛋白的升高視為早期糖尿病腎病已形成，將這些糖尿病腎病大鼠隨機分為2組:糖尿病腎病組和糖尿病腎病知柏地黃丸組，每組9只，糖尿病腎病知柏地黃丸組每天灌胃給予知柏地黃丸(4g / kg)，而糖尿病腎病組和對照組灌胃給予同樣體積的溶劑，在STZ造模兩個月后，所有的動物依次取尿液、血清和腎臟組織樣本。
[0016]進一步，在步驟二中，腎組織的組織學觀察具體方法為:將三組大鼠的腎臟組織，用10%中性甲醛固定后石蠟包埋、切片，制片，常規(guī)蘇木精-伊紅染色后，在光學顯微鏡下觀察腎臟組織病理學變化，半定量腎小管間質(zhì)的病變，在200倍光學顯微鏡鏡下，每張切片隨機選擇10個不連續(xù)視野，避開腎小球和大血管，腎間質(zhì)病變由三個參數(shù)判定:腎小管擴張，間質(zhì)炎癥細胞浸潤和間質(zhì)纖維化程度。
[0017]進一步，在步驟三中，血清樣本的臨床化學指標包括:甘油三酯、膽固醇和血糖值，尿液樣本測定的是尿蛋白，組織病理學檢測方法:隨機選取25片組織切片，利用HE染色檢測組織細胞的病理變化。
[0018]進一步，在步驟四中，血清組織樣本的制備具體方法為:將300 μ L解凍的血清與300 μ L磷酸緩沖液混合(0.2mol/LNa2HP04 / NaH2P04,pH7.4)，混合后的血清樣本12000g離心lOmin，去除沉淀，隨即將500 μ L上清液和含50 μ L重水轉(zhuǎn)到5mmNMR管中，所有的NMR譜均在Varian Unity Inova核磁共振譜儀采集,配有三共振探頭和Z軸脈沖梯度場,質(zhì)子的共振頻率為599.69MHz處，實驗溫度為25°C，針對血清樣本，為減少大分子蛋白對譜寬的影響并保留小分子信號，利用一維CPMG脈沖序列采集樣本的IH NMR譜。
[0019]進一步，在步驟四中，尿液組織樣本的制備具體方法為:將500 μ L解凍的尿液與50 μ L磷酸緩沖液混合(1.5mol / LK2HP04/NaH2P04，pH7.4)，混合時間150ms，混合后的血清樣本12000g離心IOmin,去除沉淀,然后將500 μ L上清液和含2,2’，3, 3’_deuterotrimethylsilylproprionic acid(TSP, 1.5mmol / L)的 50 μ L 重水轉(zhuǎn)到 5mm NMR管中，TSP 用于化學位移定標，所有尿液樣本的NMR譜均在Varian Unity Inova600NMR譜儀采集，配有三共振探頭和Z軸脈沖梯度場，質(zhì)子的共振頻率為599.69MHz，在25°C條件下利用一維NOESY脈沖序列采集尿液樣本的IH NMR譜,所周的實驗參數(shù):混合時間(mixing time) 150ms,譜寬10000Hz，弛豫延遲2s，采樣時間1.64s，數(shù)據(jù)采集點數(shù)16K，累加64次，F(xiàn)ID充零至64K后,加0.5Hz窗函數(shù)進行Fourier變換。
[0020]進一步，在步驟四中，腎臟組織的樣本提取具體方法為:取凍存的部分肝組織樣本稱重后，在液氮條件下加冰冷的高氯酸溶液(12%，3mL / g組織)，用研缽碾至粉末狀；離心去除沉淀后，用10% KOH調(diào)節(jié)pH值至中性；再次離心去除氯酸鉀沉淀，將上清凍干至粉末狀_80°C保存，在采集NMR譜之前，先用600 μ L含TSP和重水的磷酸緩沖液溶解粉末，離心，取500 μ L上清轉(zhuǎn)移至5_ NMR樣品管中，在25°C條件下周Varian Unity Inova NMR譜儀采集一維氫譜，所用的脈沖序列為presat，所用的實驗參數(shù):譜寬9612Hz，弛豫延遲2s，數(shù)據(jù)采集點數(shù)94K，累加128次，加0.5 Hz窗函數(shù)進行Fourier變換。
[0021]進一步，在步驟五中，NMR數(shù)據(jù)處理與模式識別分析，對采集的1H NMR譜進行相位校正和基線調(diào)整，將1H NMR譜從δ 10.0-0.4ppm分別按0.0lppm和0.0015ppm為單位進行自動分段積分，為了消除飽和水峰時引起的譜線扭曲，將δ 5.2-4.4ppm區(qū)域設為O積分段，為補償樣本之間濃度的差異，對每一段積分值都相對于該譜的所有積分值進行歸一化，然后將以0.0lppm為區(qū)間歸一化后得到的數(shù)據(jù)導入，進行多元統(tǒng)計分析。
[0022]進一步，在步驟六中，統(tǒng)計學方法，數(shù)據(jù)以平均值土標準差表示，組間的統(tǒng)計差異采用單因素方差分析，采用post hoc Dunnett’ s two-sided檢驗進行兩兩比較，當且僅當P值小于0.05時，結果被認為是有統(tǒng)計顯著性差異的。
[0023]本發(fā)明提供的基于應用代謝組學對中藥知柏地黃丸療效的試驗方法，通過代謝組學技術能獲得機體大量的內(nèi)源性代謝物的信息，并從中篩選知柏地黃丸中多種有效成分多個靶點的藥物效應引起的代謝物變化，進而從整體上評價知柏地黃丸的藥效作用，為評價知柏地黃丸的藥效作用提供新技術。本發(fā)明研究生物體內(nèi)源性代謝物的整體及其受內(nèi)在或外在因素影響，能從整體上評價知柏地黃丸“多成分，多靶點”的藥效作用，并探討其可能的作用機制。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1是本發(fā)明實施例提供的基于應用代謝組學對中藥知柏地黃丸療效的試驗方法流程圖；
[0025]圖2是本發(fā)明實 施例提供的對照組(A)，DN組⑶和DN+ZDP組(C，D)大鼠腎臟組織HE染色的示意圖；
[0026]圖3是本發(fā)明實施例提供的對照組(-)，DN組(▲)以及DN+ZDP組(Λ )大鼠血清㈧和腎臟組織(B)NMR譜圖PCA分析得分圖；
[0027]圖4是本發(fā)明實施例提供的對照組，DN組和DN+ZDP組大鼠血清代謝物NMR積分值的比較示意圖；
[0028]圖5是本發(fā)明實施例提供的對照組，DN組和DN+ZDP組大鼠腎臟中代謝物NMR積分圖；
[0029]圖6是本發(fā)明實施例提供的對照組(Α)，糖尿病腎病組⑶和給藥組大鼠(C)腎臟組織中的葡萄糖和甜菜堿含量相關關系圖。
【具體實施方式】
[0030]為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0031]圖1示出了本發(fā)明提供的基于應用代謝組學對中藥知柏地黃丸療效的試驗方法流程。為了便于說明，僅僅示出了與本發(fā)明相關的部分。[0032]本發(fā)明實施例的基于應用代謝組學對中轉(zhuǎn)知柏地黃丸療效的試驗方法，該基于應用代謝組學對中藥知柏地黃丸療效的試驗方法包括以下步驟:
[0033]步驟一，將實驗動物分成對照組，糖尿病腎病模型組，糖尿病腎病給藥組三組，進行注射處理并尿液、血清和腎臟組織樣本；
[0034]步驟二，將三組大鼠的腎臟組織，用10%中性甲醛固定后石蠟包埋、切片，制片，常規(guī)蘇木精-伊紅染色后，在光學顯微鏡下觀察腎臟組織病理學變化；
[0035]步驟三，血清樣本和尿液樣本化學指標的測定和組織病理學的檢測；
[0036]步驟四，制備血清、尿液、腎臟的組織樣本并獲得1H NMR譜的數(shù)據(jù)；
[0037]步驟五，采用統(tǒng)計學的方法，進行NMR數(shù)據(jù)處理與模式識別分析；
[0038]步驟六，對不同組大鼠的生理、生化重要指標進行對比分析；
[0039]步驟七，對不同組大鼠進行代謝組學分析、血清樣本中的代謝物分析、腎臟樣本中的代謝物分析。
[0040]作為本發(fā)明實施例的一優(yōu)化方案，在步驟一中，動物處理及樣品收集的具體方法為:實驗動物分為三組:對照組，糖尿病腎病模型組，糖尿病腎病給藥組，除對照組外，所有動物腹腔注射STZ(70mg / kg)造成糖尿病模型，一個月后尿中蛋白的升高視為早期糖尿病腎病已形成，將這些糖尿病腎病大鼠隨機分為2組:糖尿病腎病組和糖尿病腎病知柏地黃丸組，每組9只，糖尿病腎病知柏地黃丸組每天灌胃給予知柏地黃丸(4g / kg)，而糖尿病腎病組和對照組灌胃給予同樣體積的溶劑，在STZ造模兩個月后，所有的動物依次取尿液、血清和腎臟組織樣本。
[0041]作為本發(fā)明實施例的一優(yōu)化方案，在步驟二中，腎組織的組織學觀察具體方法為:將三組大鼠的腎臟組織，用10%中性甲醛固定后石蠟包埋、切片，制片，常規(guī)蘇木精-伊紅染色后，在光學顯微鏡下觀察腎臟組織病理學變化，半定量腎小管間質(zhì)的病變，在200倍光學顯微鏡鏡下，每張切片隨機選擇10個不連續(xù)視野，避開腎小球和大血管，腎間質(zhì)病變由三個參數(shù)判定:腎小管擴張，間質(zhì)炎癥細胞浸潤和間質(zhì)纖維化程度。
[0042]作為本發(fā)明實施例的一優(yōu)化方案，在步驟三中，血清樣本的臨床化學指標包括:甘油三酯、膽固醇和血糖值，尿液樣本測定的是尿蛋白，組織病理學檢測方法:隨機選取25片組織切片，利用HE染色檢測組織細胞的病理變化。
[0043]作為本發(fā)明實施例的一優(yōu)化方案，在步驟四中，血清組織樣本的制備具體方法為:將300 μ L解凍的血清與300 μ L磷酸緩沖液混合(0.2mol/LNa2HP04 / NaH2P04, ρΗ7.4)，混合后的血清樣本12000g離心lOmin，去除沉淀，隨即將500 μ L上清液和含50 μ L重水轉(zhuǎn)到5mm NMR管中,所有的NMR譜均在Varian Unity Inova核磁共振譜儀采集,配有三共振探頭和Z軸脈沖梯度場，質(zhì)子的共振頻率為599.69MHz處，實驗溫度為25°C，針對血清樣本，為減少大分子蛋白對譜寬的影響并保留小分子信號，利用一維CPMG脈沖序列采集樣本的IH NMR 譜。
[0044]作為本發(fā)明實施例的一優(yōu)化方案，在步驟四中，尿液組織樣本的制備具體方法為:將500 μ L解凍的尿液與50 μ L磷酸緩沖液混合(1.5mol / L K2HP04 / NaH2004,pH7.4),混合時間150ms，混合后的血清樣本12000g離心lOmin，去除沉淀，然后將500 μ L上清液和含 22，，3, 3，-deuterotrimethylsilylproprionic acid (TSP, 1.Smmol / L)的 50 μ L 重水轉(zhuǎn)到5mm NMR管中，TSP用于化學位移定標，所有尿液樣本的NMR譜均在Varian UnityInova600NMR譜儀采集，配有三共振探頭和Z軸脈沖梯度場，質(zhì)子的共振頻率為599.69MHz，在25°C條件下利用一維NOESY脈沖序列采集尿液樣本的IH NMR譜，所用的實驗參數(shù):混合時間(mixing time) 150ms，譜寬10000Hz，弛豫延遲2s，采樣時間1.64s，數(shù)據(jù)采集點數(shù)16K，累加64次，F(xiàn)ID充零至64K后，加0.5Hz窗函數(shù)進行Fourier變換。
[0045]作為本發(fā)明實施例的一優(yōu)化方案，在步驟四中，腎臟組織的樣本提取具體方法為:取凍存的部分肝組織樣本稱重后，在液氮條件下加冰冷的高氯酸溶液(12%，3mL / g組織)，用研缽碾至粉末狀；離心去除沉淀后，用10% KOH調(diào)節(jié)pH值至中性；再次離心去除氯酸鉀沉淀，將上清凍干至粉末狀_80°C保存，在采集NMR譜之前，先用600 μ L含TSP和重水的磷酸緩沖液溶解粉末，離心，取500 μ L上清轉(zhuǎn)移至5mm NMR樣品管中，在25°C條件下用Varian Unity Inova NMR譜儀采集一維氫譜,所用的脈沖序列為presat,所用的實驗參數(shù):譜寬9612Hz，弛豫延遲2s，數(shù)據(jù)采集點數(shù)94K，累加128次，加0.5Hz窗函數(shù)進行Fourier變換。
[0046]作為本發(fā)明實施例的一優(yōu)化方案，在步驟五中，NMR數(shù)據(jù)處理與模式識別分析，對采集的1H NMR譜進行相位校正和基線調(diào)整，將1H NMR譜從δ 10.0-0.4ppm分別按
0.0lppm和0.0015ppm為單位進行自動分段積分，為了消除飽和水峰時引起的譜線扭曲，將δ 5.2-4.4ppm區(qū)域設為O積分段，為補償樣本之間濃度的差異，對每一段積分值都相對于該譜的所有積分值進行歸一化，然后將以0.0lppm為區(qū)間歸一化后得到的數(shù)據(jù)導入，進行多元統(tǒng)計分析。
[0047]作為本發(fā)明實施例的一優(yōu)化方案，在步驟六中，統(tǒng)計學方法，數(shù)據(jù)以平均值土標準差表示，組間的統(tǒng)計差異采用單因素方差分析，采用post hoc Dunnett’ s two-sided檢驗進行兩兩比較，當且僅當P值小于0.05時，結果被認為是有統(tǒng)計顯著性差異的。
[0048]下面結合附圖及具體實施例對本發(fā)明的應用原理作進一步描述。
[0049]如圖1所示，本發(fā)明實施例的基于應用代謝組學對中藥知柏地黃丸療效的試驗方法包括以下步驟:
[0050]SlOl:將實驗動物分成對照組(control)，糖尿病腎病模型組(DN)，糖尿病腎病給藥組(DN+ZDP)三組，進行注射處理并尿液、血清和腎臟組織樣本；
[0051]S102:將三組大鼠的腎臟組織，用10%中性甲醛固定后石蠟包埋、切片，制片，常規(guī)蘇木精-伊紅(HE)染色后，在光學顯微鏡下觀察腎臟組織病理學變化；
[0052]S103:血清樣本和尿液樣本化學指標的測定和組織病理學的檢測；
[0053]S104:制備血清、尿液、腎臟的組織樣本并獲得IHNMR譜的數(shù)據(jù)；
[0054]S105:進行NMR數(shù)據(jù)處理與模式識別分析，采用統(tǒng)計學的方法；
[0055]S106:對不同組大鼠的生理、生化等重要指標進行對比分析；
[0056]S107:對不同組大鼠進行代謝組學分析、血清樣本中的代謝物分析、腎臟樣本中的代謝物分析，從而完成代謝組學對中藥知柏地黃丸療效的考察。
[0057]本發(fā)明的具體步驟為:
[0058]第一步，動物處理及樣品收集，實驗動物分為三組:對照組(control)，糖尿病腎病模型組(DN)，糖尿病腎病給藥組(DN+ZDP)，除對照組外，所有動物腹腔注射STZ(70mg /kg)造成糖尿病模型，一個月后尿中蛋白的升高視為早期糖尿病腎病已形成，將這些糖尿病腎病大鼠隨機分為2組:糖尿病腎病組和糖尿病腎病知柏地黃丸組，每組9只，后者每天灌胃給予知柏地黃丸(4g / kg)，而糖尿病腎病組和對照組灌胃給予同樣體積的溶劑，在STZ造模兩個月后，所有的動物依次取尿液、血清和腎臟組織樣本；
[0059]第二步，腎組織的組織學觀察，將三組大鼠的腎臟組織，用10%中性甲醛固定后石蠟包埋、切片，制片，常規(guī)蘇木精-伊紅(HE)染色后，在光學顯微鏡下觀察腎臟組織病理學變化，半定量腎小管間質(zhì)的病變，在200倍光學顯微鏡鏡下，每張切片隨機選擇10個不連續(xù)視野，盡量避開腎小球和大血管，腎間質(zhì)病變由三個參數(shù)判定:腎小管擴張，間質(zhì)炎癥細胞浸潤和間質(zhì)纖維化程度；
[0060]第三步,血清生化檢測,血清樣本的臨床化學指標包括:甘油三酯(triglyceride,TG)、膽固醇(total cholesterol, TC)和血糖值,尿液樣本測定的是尿蛋白，這些指標的測定是在全自動生化分析儀上測定的，組織病理學檢測方法:隨機選取25片組織切片，利用HE染色檢測組織細胞的病理變化；
[0061]第四步，組織樣本的制備和1H NMR譜數(shù)據(jù)的獲得，將300 μ L解凍的血清與300 μ L磷酸緩沖液混合((X2m0l / L Na2HP04 / NaH2P04, pH7.4),目的是減少因pH改變引起的化學位移差異，混合后的血清樣本12000g離心lOmin，去除沉淀，隨即將500 μ L上清液和含50yL重水轉(zhuǎn)到5mm NMR管中，其中重水供鎖場之用，所有的NMR譜均在Varian UnityInova核磁共振譜儀采集，配有三共振探頭和Z軸脈沖梯度場，質(zhì)于的共振頻率為599.69MHz處，實驗溫度為25°C，針對血清樣本，為減少大分子蛋白對譜寬的影響并保留小分子信號，利用一維CPMG脈沖序列采集樣本的IH NMR譜，所用的實驗參數(shù):自旋-自旋弛豫間隔(spin-spin relaxation delay) 120ms,譜寬 9000Hz,弛豫延遲 4s,數(shù)據(jù)采集點數(shù) 16K,累加128次，F(xiàn)ID充零至64K后，加窗函數(shù)進行Fourier變換；
[0062]針對尿液樣本，將500 μ L解凍的尿液與50 μ L磷酸緩沖液混合(1.5mol / LK2HP04 / NaH2P04，pH7.4)，目的是減少困pH改變引起的化學位移差異，混合后的血清樣本12000g 離心 IOmin,去除沉淀，然后將 500 μ L 上清液和含 2, 2’，3, 3’-deuterotrimethyl si Iylproprionic acid (TSP, 1.5mmol / L)的 50 μ L 重水轉(zhuǎn)到 5mm NMR管中，TSP 用于化學位移定標，所有尿液樣本的NMR譜均在Varian Unity Inova600NMR譜儀采集，配有三共振探頭和Z軸脈沖梯度場，質(zhì)子的共振頻率為599.69MHz，在25°C條件下利用一維NOESY脈沖序列采集尿液樣本的m NMR譜,所用的實驗參數(shù):混合時間(mixing time) 150ms,譜寬10000Hz,弛豫延遲2s，采樣時間1.64s，數(shù)據(jù)采集點數(shù)16K，累加64次，F(xiàn)ID充零至64K后，加0.5Hz窗函數(shù)進行Fourier變換；
[0063]腎臟組織的樣本提取，取凍存的部分肝組織樣本稱重后，在液氮條件下加冰冷的高氯酸溶液(12%，3mL / g組織)，用研缽碾至粉末狀；離心去除沉淀后，用10% KOH調(diào)節(jié)PH值至中性；再次離心去除氯酸鉀沉淀，將上清凍干至粉末狀-80°C保存，在采集NMR譜之前，先用600 μ L含TSP和重水的磷酸緩沖液溶解粉末，離心，取500 μ L上清轉(zhuǎn)移至5mmNMR樣品管中，在25°C條件下用Varian Unity Inova NMR譜儀采集一維氫譜,所用的脈沖序列為presat，所周的實驗參數(shù):譜寬9612Hz，弛豫延遲2s，數(shù)據(jù)采集點數(shù)94K，累加128次，加
0.5Hz窗函數(shù)進行Fourier變換；
[0064]第五步，NMR數(shù)據(jù)處理與模式識別分析，為了探索譜圖中隱含的所有的代謝信息，對采集的1H NMR譜進行相位校正和基線調(diào)整，將1H NMR譜從δ 10.0-0.4ppm分別按
0.0lppm和0.0015ppm為單位進行自動分段積分，為了消除飽和水峰時引起的譜線扭曲，將δ 5.2-4.4ppm區(qū)域設為O積分段，為補償樣本之間濃度的差異，對每一段積分值都相對于該譜的所有積分值進行歸一化，然后將以0.0lppm為區(qū)間歸一化后得到的數(shù)據(jù)導入，進行多兀統(tǒng)計分析，偏最小二乘判別分析(partial least-squares discriminant analysis,PLS-DA)的所有的樣本點都展示在第一和第二個主成分(pCl和PC2)為x、y坐標軸的二維空間中，該圖中的每一個點都代表一個血清樣本，R2是前兩個PC所包含的總信息的百分數(shù)，表征了 PCA的區(qū)分程度，相應的PCA載荷圖上，每一點代表了 NMR譜圖上的一個積分區(qū)間，用來確認是哪一段積分值對組間分離有貢獻，
[0065]第六步，統(tǒng)計學方法，進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以平均值土標準差(mean土SD)表示，組間的統(tǒng)計差異采用單因素方差分析(ANOVA),采用post hoc Dunnett’s two-sided檢驗進行兩兩比較，當且僅當P值小于0.05時，結果被認為是有統(tǒng)計顯著性差異的。
[0066]結合分析對本發(fā)明做進一步的說明:
[0067]生化與組織病理學
[0068]表1-1臨床化學檢測指標
[0069]
【權利要求】
1.一種基于應用代謝組學對中藥知柏地黃丸療效的試驗方法，其特征在于，該基于應用代謝組學對中藥知柏地黃丸療效的試驗方法包括以下步驟: 步驟一，將實驗動物分成對照組，糖尿病腎病模型組，糖尿病腎病給藥組三組，進行注射處理并尿液、血清和腎臟組織樣本； 步驟二，將三組大鼠的腎臟組織，用10%中性甲醛固定后石蠟包埋、切片，制片，常規(guī)蘇木精-伊紅染色后，在光學顯微鏡下觀察腎臟組織病理學變化； 步驟三，血清樣本和尿液樣本化學指標的測定和組織病理學的檢測； 步驟四，制備血清、尿液、腎臟的組織樣本并獲得1H NMR譜的數(shù)據(jù)； 步驟五，采用統(tǒng)計學的方法，進行NMR數(shù)據(jù)處理與模式識別分析。
2.如權利要求1所述的基于應用代謝組學對中藥知柏地黃丸療效的試驗方法，其特征在于，在步驟一中，動物處理及樣品收集的具體方法為:實驗動物分為三組:對照組，糖尿病腎病模型組，糖尿病腎病給藥組，除對照組外，所有動物腹腔注射STZ (70mg / kg)造成糖尿病模型，一個月后尿中蛋白的升高視為早期糖尿病腎病已形成，將糖尿病腎病大鼠隨機分為2組:糖尿病腎病組和糖尿病腎病知柏地黃丸組，每組9只，糖尿病腎病知柏地黃丸組每天灌胃給予知柏地黃丸(4g / kg)，而糖尿病腎病組和對照組灌胃給予同樣體積的溶劑，在STZ造模兩個月后，所有的動物依次取尿液、血清和腎臟組織樣本。
3.如權利要求1所述的基于應用代謝組學對中藥知柏地黃丸療效的試驗方法，其特征在于，在步驟二中，腎組織的組織學觀察具體方法為:將三組大鼠的腎臟組織，用10%中性甲醛固定后石蠟包埋、切片，制片，常規(guī)蘇木精-伊紅染色后，在光學顯微鏡下觀察腎臟組織病理學變化，半定量腎小管間質(zhì)的病變，在200倍光學顯微鏡鏡下，每張切片隨機選擇10個不連續(xù)視野，避開腎小球和大血管，腎間質(zhì)病變由三個參數(shù)判定:腎小管擴張，間質(zhì)炎癥細胞浸潤和間質(zhì)纖維化程度。
4.如權利要求1所述的基于應用代謝組學對中藥知柏地黃丸療效的試驗方法，其特征在于，在步驟三中，血清樣本的臨床化學指標包括:甘油三酯、膽固醇和血糖值，尿液樣本測定的是尿蛋白，組織病理學檢測方法:隨機選取25片組織切片，利用HE染色檢測組織細胞的病理變化。
5.如權利要求1所述的基于應用代謝組學對中藥知柏地黃丸療效的試驗方法，其特征在于，在步驟四中，血清組織樣本的制備具體方法為:將300 μ L解凍的血清與300 μ L磷酸緩沖液混合(0.2mol/L Na2HP04 / NaH2P04,pH7.4)，混合后的血清樣本12000g離心lOmin，去除沉淀，隨即將500 μ L上清液和含50 μ L重水轉(zhuǎn)到5mm NMR管中，所有的NMR譜均在Varian Unity Inova核磁共振譜儀采集,配有三共振探頭和Z軸脈沖梯度場,質(zhì)子的共振頻率為599.69MHz處，實驗溫度為25°C，針對血清樣本，為減少大分子蛋白對譜寬的影響并保留小分子信號，利用一維CPMG脈沖序列采集樣本的IH NMR譜；所用的實驗參數(shù):自旋-自旋弛豫間隔(spin-spin relaxation delay) 120ms,譜寬9000Hz,弛豫延遲4s,數(shù)據(jù)采集點數(shù)16K，累加128次，F(xiàn)ID充零至64K后，加窗函數(shù)進行Fourier變換。
6.如權利要求1所述的基于應用代謝組學對中藥知柏地黃丸療效的試驗方法，其特征在于，在步驟四中，尿液組織樣本的制備具體方法為:將500 μ L解凍的尿液與50 μ L磷酸緩沖液混合(L 5mol/LK2HP04 / NaH2P04,pH7.4)，混合時間150ms，混合后的血清樣本12000g離心 IOmin,去除沉淀，然后將 500 μ L 上清液和含 2, 2，，3, 3，-deuterotrimethylsiIylproprionic acid (TS P, 1.5mmol / L)的50 μ L重水轉(zhuǎn)到5mm NMR管中，TSP用于化學位移定標，所有尿液樣本的NMR譜均在Varian Unity Inova600NMR譜儀采集，配有三共振探頭和Z軸脈沖梯度場，質(zhì)子的共振頻率為599.69MHz，在25°C條件下利用一維NOESY脈沖序列采集尿液樣本的IH NMR譜,所用的實驗參數(shù):混合時間(mixing time) 150ms,譜寬10000Hz,弛豫延遲2s，采樣時間1.64s，數(shù)據(jù)采集點數(shù)16K，累加64次，F(xiàn)ID充零至64K后，加0.5Hz窗函數(shù)進行Fourier變換。
7.如權利要求1所述的基于應用代謝組學對中藥知柏地黃丸療效的試驗方法，其特征在于，在步驟四中，腎臟組織的樣本提取具體方法為:取凍存的部分肝組織樣本稱重后，在液氮條件下加冰冷的高氯酸溶液(12%，3mL / g組織)，用研缽碾至粉末狀；離心去除沉淀后，用10% KOH調(diào)節(jié)pH值至中性；再次離心去除氯酸鉀沉淀，將上清凍干至粉末狀_80°C保存，在采集NMR譜之前，先用600 μ L含TSP和重水的磷酸緩沖液溶解粉末，離心，取500 μ L上清轉(zhuǎn)移至5mmNMR樣品管中，在25°C條件下用Varian Unity Inova NMR譜儀采集一維氫譜，所用的脈沖序列為presat，所用的實驗參數(shù):譜寬9612Hz，弛豫延遲2s，數(shù)據(jù)采集點數(shù)94K，累加128次，加0.5Hz窗函數(shù)進行Fourier變換。
8.如權利要求1所述的基于應用代謝組學對中藥知柏地黃丸療效的試驗方法，其特征在于，在步驟五中，NMR數(shù)據(jù)處理與模式識別分析，對采集的1HNMR譜進行相位校正和基線調(diào)整，將1H NMR譜從δ 10.0-0.4ppm分別按0.0lppm和0.0015ppm為單位進行自動分段積分，為了消除飽和水峰時引起的譜線扭曲，將S 5.2-4.4ppm區(qū)域設為O積分段，為補償樣本之間濃度的差異，對每一段積分值都相對于該譜的所有積分值進行歸一化，然后將以0.0lppm為區(qū)間歸一化后得到的數(shù)據(jù)導入，進行多元統(tǒng)計分析。
9.如權利要求1所述的基于應用代謝組學對中藥知柏地黃丸療效的試驗方法，其特征在于，在步驟六中，統(tǒng)計學方法，數(shù)據(jù)以平均值土標準差表示，組間的統(tǒng)計差異采用單因素方差分析，采用post hoc Dunnett’ s two-sided檢驗進行兩兩比較，當且僅當P值小于.0.05時，結果被認為是有統(tǒng)計顯著性差異的。
【文檔編號】G01N33/15GK103472199SQ201310413364
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月12日 優(yōu)先權日:2013年9月12日
【發(fā)明者】高紅昌, 趙良才 申請人:溫州醫(yī)科大學