Dna結(jié)合蛋白的檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種DNA結(jié)合蛋白的檢測方法，包括如下步驟：提供待檢測的DNA結(jié)合蛋白的樣品溶液，在Exo?III存在的條件下進(jìn)行消化反應(yīng)，反應(yīng)完全后得到消化液；將消化液加入到擴增體系中，在聚合酶、內(nèi)切酶和擴增模板存在的情況下，進(jìn)行等溫擴增反應(yīng)后得到擴增液；將納米金顆粒溶液與含有第一檢測探針和第二檢測探針的溶液混合后進(jìn)行孵育后得到納米金檢測探針溶液；將擴增液和納米金檢測探針溶液混合后對混合液進(jìn)行檢測，完成DNA結(jié)合蛋白的檢測。這種DNA結(jié)合蛋白的檢測方法，通過第一檢測探針和第二檢測探針與擴增產(chǎn)物中靶DNA的結(jié)合，使得結(jié)合了檢測探針的納米金顆粒發(fā)生聚集，導(dǎo)致混合液的顏色發(fā)生變化，現(xiàn)象直觀，靈敏度較高。
【專利說明】DNA結(jié)合蛋白的檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因檢測領(lǐng)域，特別是涉及一種DNA結(jié)合蛋白的檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]簡單靈敏的檢測人體細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子對于臨床診斷以及藥物的篩選有著重要的意義。目前的檢測方法都是基于電泳遷移，免疫化學(xué)或者是熒光檢測的方法，這些方法都是通過非擴增而直接進(jìn)行檢測，因此靈敏度較低。而且這些方法存在著放射性污染或者需要特異性抗體和熒光標(biāo)記的探針，大大增加了實驗成本和實驗的復(fù)雜性。
[0003]DNA結(jié)合蛋白在基因組復(fù)制，基因轉(zhuǎn)錄，細(xì)胞分裂和DNA修復(fù)過程中起著至關(guān)重要的作用。而大部分的DNA結(jié)合蛋白都扮演著轉(zhuǎn)錄因子的角色，調(diào)節(jié)著細(xì)胞的發(fā)育，分化和增殖，由此轉(zhuǎn)錄因子也已經(jīng)成為臨床診斷和藥物篩選中的靶點。目前為止絕大部分都是采用非擴增的直接檢測的方法來定量轉(zhuǎn)錄因子，其中包括電泳遷移法(EMSA)，DNA酶足跡法；酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，免疫印跡法(western blotting)和基于熒光能量共振轉(zhuǎn)移(FRET)的方法。其中電泳遷移法(EMSA)和DNA酶足跡法屬于傳統(tǒng)檢測方法，都是利用同位素標(biāo)記DNA探針和凝膠電泳分離來檢測DNA-蛋白復(fù)合物。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和免疫印跡法(western blotting)是通過抗原和抗體的特異性反應(yīng),然后經(jīng)酶標(biāo)抗體的底物顯色反應(yīng)來檢測DNA結(jié)合蛋白?；跓晒饽芰抗舱褶D(zhuǎn)移(FRET)的方法則是利用DNA與蛋白的相互作用，使標(biāo)記有熒光的兩段DNA探針相互靠近而發(fā)生FRET;或者是標(biāo)記有熒光的DNA探針與蛋白的相互作用后對DNA序列起到保護(hù)作用，外切酶Exo III不能進(jìn)行切割DNA探針從而發(fā)生FRET，以此來檢測DNA結(jié)合蛋白。然而，傳統(tǒng)的DNA結(jié)合蛋白的檢測方法靈敏度都偏低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]基于此，有必要提供一種靈敏度較高的DNA結(jié)合蛋白的檢測方法。
[0005]一種DNA結(jié)合蛋白的檢測方法，包括如下步驟:
[0006]提供待檢測的DNA結(jié)合蛋白的樣品溶液，在Exo III存在的條件下進(jìn)行消化反應(yīng)，反應(yīng)完全后得到消化液，其中，未被Exo III切割的DNA的反義鏈作為引物被保留在所述消化液中；
[0007]將所述消化液加入到擴增體系中，在聚合酶、內(nèi)切酶和擴增模板存在的情況下，進(jìn)行等溫擴增反應(yīng)，反應(yīng)完全后得到擴增液，其中，所述擴增模板包括η段重復(fù)序列以及η-1段依次連接所述重復(fù)序列的連接序列，所述引物與所述重復(fù)序列特異性結(jié)合，所述連接序列包括所述內(nèi)切酶的酶切位點，η為不小于2的整數(shù)，所述引物擴增后得到所述擴增模版的互補序列，所述擴增模版的互補序列被所述內(nèi)切酶切割形成η段包含所述重復(fù)序列的靶DNA ；
[0008]提供納米金顆粒溶液，并將所述納米金顆粒溶液與含有第一檢測探針和第二檢測探針的溶液混合后進(jìn)行孵育，孵育完成后得到納米金檢測探針溶液，其中，所述第一檢測探針與所述靶DNA特異性互補，所述第二檢測探針與所述靶DNA特異性互補；
[0009]將所述擴增液和所述納米金檢測探針溶液混合，反應(yīng)完全后對混合液進(jìn)行檢測，完成所述DNA結(jié)合蛋白的檢測。
[0010]在一個實施例中，所述提供待檢測的DNA結(jié)合蛋白的樣品溶液的操作為:
[0011]將HeLa細(xì)胞在含有10%胎牛血清的DMEM中培養(yǎng)，置于加濕處理的含有5% 二氧化碳的37°C培養(yǎng)箱中，加入20納克每毫升TNF- α進(jìn)行刺激，30分鐘后用細(xì)胞核提取物試劑盒裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞提取物即為所述待檢測的DNA結(jié)合蛋白的樣品溶液。
[0012]在一個實施例中，所述DNA結(jié)合蛋白為NF- K B ρ50蛋白。
[0013]在一個實施例中，所述聚合酶為KF聚合酶，所述內(nèi)切酶為Nb.BbvCI內(nèi)切酶。
[0014]在一個實施例中，η=2。
[0015]在一個實施例中，所述納米金顆粒溶液通過檸檬酸鈉還原氯金酸法制備得到。
[0016]在一個實施例中，對所述混合液進(jìn)行檢測的操作可以為:肉眼直接觀察，混合液中的納米金檢測探針發(fā)生聚集，顏色由紅色變?yōu)樽仙?br> [0017]在一個實施例中，對所述混合液進(jìn)行檢測的操作可以為:采用分光光度計檢測混合液，光譜采集范圍為410nm?800nm,檢測最大吸收峰。
[0018]在一個實施例中，所述作為引物的DNA的反義鏈的序列為SEQ ID N0.1所示的序列。
[0019]在一個實施例中，所述擴增模板的序列為SEQ ID N0.2所示的序列；
[0020]所述第一檢測探針的序列為SEQ ID N0.3所示的序列；
[0021]所述第二檢測探針的序列為SEQ ID N0.4所示的序列。
[0022]這種DNA結(jié)合蛋白的檢測方法，通過特異性互補的檢測探針與擴增產(chǎn)物中的靶DNA結(jié)合，使得結(jié)合了第一檢測探針和第二檢測探針的納米金顆粒發(fā)生聚集，導(dǎo)致混合液的顏色發(fā)生變化。與傳統(tǒng)的DNA結(jié)合蛋白的檢測方法相比，這種DNA結(jié)合蛋白的檢測方法由于結(jié)合了擴增方法與納米金比色法，靈敏度較高，實驗現(xiàn)象簡單直觀。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1為一實施方式的DNA結(jié)合蛋白的檢測方法的流程圖。
[0024]圖2為DNA結(jié)合蛋白的檢測方法的機理圖。
[0025]圖3為納米金顆粒(AuNP)的透射電鏡圖。
[0026]圖4為為非變性凝膠電泳分析等溫指數(shù)擴增反應(yīng)產(chǎn)物；泳道I表示存在8納摩爾每升的NF- K B p50特異性探針和8納摩爾每升的NF- κ B ρ50 ;泳道2表示存在8納摩爾每升的NF- κ B ρ50特異性探針，不存在8納摩爾每升的NF- κ B ρ50 ;泳道3表示合成的長度為24個堿基的寡核苷酸；泳道4表示DNA marker (分子質(zhì)量參照)。
[0027]圖5為NF-κ B p50蛋白與非特異性探針的結(jié)合后納米金吸收光譜的變化；曲線a表示存在2納摩爾NF- κΒ p50蛋白和2納摩爾特異性探針；曲線b表示存在2納摩爾NF-kB p50蛋白和2納摩爾非特異性探針；曲線c表示存在2納摩爾特異性探針，不存在蛋白。
[0028]圖6為A700/A525的吸收峰比值隨NF-κ B ρ50蛋白濃度變化的曲線。
[0029]圖7為圖6所示的曲線取對數(shù)后得到的Α700/Α525的吸收峰比值與NF-κ B ρ50蛋白濃度的指數(shù)線性圖，線性關(guān)系從5皮摩爾到2000皮摩爾。
[0030]圖8為凝膠遷移實驗(EMSA)驗證HeLa細(xì)胞核提取物中NF- κ B p50蛋白的活性；泳道1，存在10微克未經(jīng)TNF- α誘導(dǎo)的細(xì)胞核提取物和4皮摩爾的NF- κ B探針；泳道2，存在10微克經(jīng)TNF- α誘導(dǎo)的細(xì)胞核提取物，不存在NF- κ B探針；泳道3，存在10微克經(jīng)TNF- α誘導(dǎo)的細(xì)胞核提取物和4皮摩爾的NF- κ B探針。
[0031]圖9為存在2納摩爾每升的NF-κ B探針和細(xì)胞核提取物時，納米金的吸收光譜圖；(a)TNF_a誘導(dǎo)過的細(xì)胞核提取物(25納克每微升)；(b)TNF_a未誘導(dǎo)過的細(xì)胞核提取物(25納克每微升)；(C)不存在細(xì)胞核提取物。
【具體實施方式】
[0032]下面結(jié)合附圖及實施例對DNA結(jié)合蛋白的檢測方法做進(jìn)一步的解釋說明。
[0033]如圖1所示的一實施方式的DNA結(jié)合蛋白的檢測方法，包括如下步驟:
[0034]S10、提供待檢測的DNA結(jié)合蛋白的樣品溶液，在Exo III存在的條件下進(jìn)行消化反應(yīng)，反應(yīng)完全后得到消化液。
[0035]提供待檢測的DNA結(jié)合蛋白的樣品溶液的操作為:
[0036]將HeLa細(xì)胞在含有10%胎牛血清的DMEM中培養(yǎng)，置于加濕處理的含有5% 二氧化碳的37°C培養(yǎng)箱中，加入20納克每毫升TNF- α進(jìn)行刺激，30分鐘后用細(xì)胞核提取物試劑盒裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞提取物即為待檢測的DNA結(jié)合蛋白的樣品溶液。
[0037]結(jié)合圖2，蛋白與DNA的結(jié)合位點在正義鏈的5’端，蛋白與DNA序列結(jié)合以后，ExoIII對雙鏈DNA分別從3’端到5’端進(jìn)行酶切。由于蛋白的結(jié)合對DNA序列進(jìn)行了保護(hù)作用，Exo III不能通過反義 鏈的3’端進(jìn)行切割，因此反義鏈被保留下來從而作為下面的等溫擴增的引物。
[0038]也就是說，未被Exo III切割的DNA的反義鏈作為引物被保留在消化液中。
[0039]本實施方式中，DNA結(jié)合蛋白為NF-κ B ρ50蛋白，作為引物的DNA的反義鏈的序列為SEQ ID N0.1所示的序列。
[0040]SEQ ID N0.1 所示的序列中為:5' -TGT GGA ATT GCT CTC CCT ATA GTGAGT CGTAGTTCC MG GAA AGT CCC ATC Τ-3'，加粗的部分為蛋白結(jié)合位點，Exo III肯定不能切割，斜體后面ATC T幾個堿基不確定會不會切掉，因為存在酶的一個空間位阻問題，但是無論這幾個堿基切割與否，都不影響下面的擴增反應(yīng)。
[0041 ] S20、將消化液加入到擴增體系中，在聚合酶、內(nèi)切酶和擴增模板存在的情況下，進(jìn)行等溫擴增反應(yīng)，反應(yīng)完全后得到擴增液。
[0042]擴增模板包括η段重復(fù)序列以及η-1段依次連接重復(fù)序列的連接序列，引物與重復(fù)序列特異性結(jié)合，連接序列包括內(nèi)切酶的酶切位點，η為不小于2的整數(shù)，引物擴增后得到擴增模板的互補序列，擴增模板的互補序列被內(nèi)切酶切割形成η段包含所述重復(fù)序列的靶 DNA。
[0043]在一個特殊的方式中，η=2，聚合酶為KF聚合酶，內(nèi)切酶為Nb.BbvCI內(nèi)切酶。
[0044]本實施方式中，擴增模板的序列為SEQ ID N0.2所示的序列，并且擴增模板的3 ^末端還帶有一個起到修飾作用的磷酸基團(tuán)。
[0045]S30、提供納米金顆粒溶液，并將納米金顆粒溶液與含有第一檢測探針和第二檢測探針的溶液混合后進(jìn)行孵育，孵育完成后得到納米金檢測探針溶液。
[0046]納米金顆粒溶液通過檸檬酸鈉還原氯金酸法制備得到，具體如下:
[0047]將3.7mL質(zhì)量濃度為1%的HAuCl4水溶液加入到90mL水中加熱至沸，然后迅速加入9mL質(zhì)量濃度為1%的檸檬酸鈉水溶液，并持續(xù)沸騰15分鐘，溶液顏色迅速由淺黃色至無色、黑色，最后得到酒紅色膠體溶液。
[0048]孵育完成后，第一檢測探針與納米金顆粒結(jié)合，第一檢測探針以納米金顆粒為核心，形成球狀結(jié)構(gòu)；同時，第二檢測探針與納米金顆粒結(jié)合，第二檢測探針以納米金顆粒為核心，形成球狀結(jié)構(gòu)。
[0049]結(jié)合圖2，第一檢測探針(probel)與靶DNA特異性互補，第二檢測探針(probe2)與靶DNA特異性互補，從而第一檢測探針和第二檢測探針可以與靶DNA進(jìn)行特異性結(jié)合。
[0050]本實施方式中，第一檢測探針的序列為SEQ ID N0.3所示的序列，第二檢測探針的序列為SEQ ID N0.4所示的序列。
[0051]其中，第一檢測探針的5'末端連接有起到修飾作用的巰基(-SH)，第二檢測探針的3'末端連接有起到修飾作用的巰基(-SH)。
[0052]S40、將擴增液和納米金檢測探針溶液混合，反應(yīng)完全后對混合液進(jìn)行檢測，完成DNA結(jié)合蛋白的檢測。
[0053]結(jié)合圖2，第一檢測探針(probel)與靶DNA特異性互補，第二檢測探針(probe2)與靶DNA特異性互補，從而第一檢測探針和第二檢測探針可以與靶DNA進(jìn)行特異性結(jié)合，靶DNA起到搭橋作用，最終使得分別結(jié)合了第一檢測探針和第二檢測探針的納米金顆粒發(fā)生聚集，從而導(dǎo)致混合液的顏色由紅色變?yōu)樽仙?，通過分光光度計可以檢測發(fā)現(xiàn)，混合液在紫光吸收區(qū)域達(dá)到最大吸收峰值。
[0054]對混合液進(jìn)行檢測的操作可以為:肉眼直接觀察，混合液中的納米金檢測探針發(fā)生聚集，顏色由紅色變?yōu)樽仙?br> [0055]或者，對混合液進(jìn)行檢測的操作可以為:采用分光光度計檢測混合液，光譜采集范圍為410nm?800nm,檢測最大吸收峰。
[0056]這種DNA結(jié)合蛋白的檢測方法，通過特異性互補的檢測探針與擴增產(chǎn)物中的靶DNA結(jié)合，使得結(jié)合了第一檢測探針和第二檢測探針的納米金顆粒發(fā)生聚集，導(dǎo)致混合液的顏色發(fā)生變化。與傳統(tǒng)的DNA結(jié)合蛋白的檢測方法相比，這種DNA結(jié)合蛋白的檢測方法由于結(jié)合了擴增方法與納米金比色法，靈敏度較高，實驗現(xiàn)象簡單直觀。
[0057]以下為具體實施例。
[0058]實施例1
[0059]納米金顆粒溶液的制備:利用檸檬酸鈉還原氯金酸法制備納米金顆粒溶液。將
3.7mL質(zhì)量濃度為1%的HAuCl4水溶液加入到90mL水中加熱至沸，然后迅速加入9mL質(zhì)量濃度為1%的檸檬酸鈉水溶液，并持續(xù)沸騰15分鐘，溶液顏色迅速由淺黃色至無色、黑色，最后得到酒紅色膠體溶液。
[0060]納米金檢測探針的制備:用兩種不同的巰基修飾的寡核苷酸來修飾納米金顆粒。
5.2納摩爾的探針I(yè) (序列為SEQ ID N0.3所示的序列)和5.2納摩爾的探針2 (序列為SEQID N0.4所示的序列)一起加在2.5毫升的納米金溶液中，在室溫靜置16小時后，逐滴加入
0.1摩爾每升的磷酸鹽緩沖液(PH7.0)調(diào)節(jié)至終濃度為10毫摩爾每升，同時加入NaCl調(diào)節(jié)至濃度為0.1摩爾每升，室溫靜置40小時。然后在4°C，12000轉(zhuǎn)每分鐘離心25分鐘，棄掉上清，用I毫升含有0.1摩爾每升NaCl的10毫摩爾每升的磷酸鹽緩沖液(PH7.0)洗三遍。最后納米金檢測探針I(yè)和納米金檢測探針2儲存在0.3摩爾每升NaCl，10毫摩爾每升磷酸鹽緩沖液(PH7.0)中，并放在4°C保存。
[0061]待檢測的DNA結(jié)合蛋白的樣品的制備:HeLa細(xì)胞(人宮頸癌細(xì)胞系)在含有10%胎牛血清的DMEM (—種培養(yǎng)液)中培養(yǎng)，置于加濕處理的含有5% 二氧化碳的37°C培養(yǎng)箱中。HeLa細(xì)胞分為兩組，一組加入20納克每毫升TNF- α進(jìn)行刺激，一組不加入TNF- α，30分鐘后用細(xì)胞核提取物試劑盒裂解細(xì)胞(廠家ActiveMotif，貨號:40010)，收集細(xì)胞提取物并且用Bradford法定量蛋白濃度，細(xì)胞提取物最終凍存于負(fù)80°C冰箱中備用。
[0062]DNA結(jié)合蛋白的消化:不同濃度的純化的重組NF-κ B p50蛋白與2納摩爾每升的雙鏈DNA探針在7微升蛋白結(jié)合液中室溫下反應(yīng)30分鐘。蛋白結(jié)合液中含有10毫摩爾每升PH值為7.5的Tris-HCl緩沖液，100毫摩爾每升氯化鉀，2毫摩爾每升氯化鎂，0.1毫摩爾每升乙二胺四乙酸，0.1毫克每毫升的酵母tRNA，10%甘油，0.25毫摩爾每升二硫蘇糖醇。細(xì)胞提取物與2納摩爾每升的雙鏈DNA探針在7微升蛋白結(jié)合液中室溫下反應(yīng)30分鐘。蛋白結(jié)合液中含有10毫摩爾每升pH值為7.5的Tris-HCl緩沖液，100毫摩爾每升氯化鉀，2毫摩爾每升氯化鎂，0.1毫摩爾每升乙二胺四乙酸，10%甘油，0.25毫摩爾每升二硫蘇糖醇，2毫摩爾每升pH值為7.0的磷酸鈉，20納克每微升HaeII1-CUt E.coli DNA, 25納克每微升的酵母tRNA。蛋白與DNA孵育后與消化液混合至總體積為10微升，其中含有20個單位DNA外切酶III, 10毫摩爾每升Bis Tris Propane-HCl, 10毫摩爾每升氯化鎂，I毫摩爾每升二硫蘇糖醇，37V反應(yīng)5分鐘，700C 20分鐘滅活，結(jié)束消化反應(yīng)。由DNA外切酶III切割得到的作為引物的DNA的反義鏈的序列為SEQ ID N0.1所示的序列。
[0063]靶DNA的擴增:擴增體系總共20微升體系，分為兩部分，A液和B液。A液包括2微升的消化產(chǎn)物，0.05微摩爾每升模板(序列為SEQ ID N0.2所示的序列)，250微摩爾每升的脫氧核苷三磷酸混合液，IXNEB緩沖液2( 10毫摩爾每升三氨基甲烷鹽酸，50毫摩爾每升的氯化鈉，10毫摩爾每升的氯化鎂，I毫摩爾每升二硫蘇糖醇，pH值為7.9)。B液包括0.25單位每微升Nb.BbvCI內(nèi)切酶，0.05單位每微升的KF聚合酶。A液95°C，3分鐘，在40°C孵育5分鐘。然后A液和B液立刻混合，在40°C反應(yīng)40分鐘。
[0064]納米金比色反應(yīng):10微升擴增產(chǎn)物與15微升納米金檢測探針I(yè)溶液和15微升納米金檢測探針2溶液一起孵育。然后用含有0.3摩爾每升的氯化鈉和10毫摩爾每升pH7.0的磷酸鹽緩沖液稀釋至150微升，最后用紫外分光光度計檢測混合液。光譜采集范圍在410-800納米，最終發(fā)現(xiàn)混合溶液的最大吸收峰在525納米處。
[0065]結(jié)合圖2，對反應(yīng)機理進(jìn)行簡單描述:
[0066]雙鏈DNA探針包括兩條反向的互補配對的寡核苷酸序列，蛋白與DNA的結(jié)合位點在正義鏈的5’端。DNA外切酶III具有從3’端到5’端持續(xù)切割DNA雙鏈的能力。當(dāng)DNA與蛋白結(jié)合時，DNA外切酶III不能通過結(jié)合位點而繼續(xù)切割，因此反義寡核苷酸鏈得以保存下來作為擴增反應(yīng)的引物。擴增反應(yīng)的模板包括兩部分序列相同的X，中間被序列A分開。X序列與保留下來的反義鏈的3’端互補配對，序列A是Nb.BbvCI對雙鏈DNA序列的識別位點。當(dāng)擴增反應(yīng)的模板，DNA聚合酶，內(nèi)切酶和脫氧核苷三磷酸都存在時，保留下來的反義寡核苷酸鏈作為引物起始擴增反應(yīng)，通過切割酶的作用產(chǎn)生新的引物序列。這些新的引物可以與其他的DNA模板結(jié)合，開始新的一輪聚合，切割，鏈取代反應(yīng)，最終產(chǎn)生更多的單鏈DNA。這些單鏈DNA作為連接體，可以與納米金探針結(jié)合(探針I(yè)和探針2都是檢測探針，它們都與擴增產(chǎn)物中DNA結(jié)合，形成三位置雜交的形式，擴增產(chǎn)物中靶DNA與兩個探針的結(jié)合，靶DNA起到搭橋作用，才使得探針I(yè)和2修飾的納米金顆?？繑n發(fā)生聚集)引起納米金的聚合，顏色由紅色變?yōu)樽仙?。這種顏色變化可以由肉眼直接觀察到，并且可以通過紫外吸收光譜的測定進(jìn)行定量從而實現(xiàn)對蛋白的檢測。當(dāng)沒有蛋白與DNA序列結(jié)合時，雙鏈DNA序列被DNA外切酶III切割，不能進(jìn)行等溫擴增，沒有連接序列產(chǎn)生，因此不能使納米金聚合，沒有顏色發(fā)生變化。
[0067]實施例2
[0068]1.納米金和DNA修飾的納米金的特征
[0069]為了得到均勻大小的納米金顆粒，通過掃描透射電鏡觀察合成的納米金顆粒的粒徑大約都為14納米，幾乎都呈圓形，具有良好的分散性，結(jié)果如圖3所示。
[0070]2.基于擴增的納米金比色檢測NF-κ B p50可行性實驗
[0071]為了確定基于擴增的納米金比色是否可以檢測DNA結(jié)合蛋白，我們選擇NF-κ BP50轉(zhuǎn)錄因子作為模型進(jìn)行檢測。NF-κΒ p50與DNA結(jié)合，經(jīng)過DNA外切酶III切割和40°C等溫擴增后，首先通過14%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳實驗驗證是否有24nt的寡核苷酸序列產(chǎn)生。結(jié)果如圖4中顯示，NF-κ B p50存在時(電泳跑道I)可以產(chǎn)生24nt的寡核苷酸序列，NF- κ B p50不存在時(電泳跑道2)沒有目的條帶產(chǎn)生。
[0072]3.DNA結(jié)合蛋白特異性檢測
[0073]為了證明該檢測方法的特異性，我們進(jìn)行了對照實驗。結(jié)果如圖5，為NF-κΒ p50蛋白與非特異性探針的結(jié)合后納米金吸收光譜的變化。曲線a表示存在2納摩爾NF-κ BP50蛋白和2納摩爾特異性探針；曲線b表示存在2納摩爾NF- κ B p50蛋白和2納摩爾非特異性探針；曲線c表示存在2納摩爾特異性探針，不存在蛋白。由圖5可以看出，曲線a相對于曲線b明顯其光吸收值向紫外方向發(fā)生了偏移。
[0074]4.DNA結(jié)合蛋白靈敏度檢測
[0075]為了證明本技術(shù)方案檢測DNA結(jié)合蛋白的靈敏度，我們對不同濃度的NF-κ B p50蛋白進(jìn)行了檢測分析。隨著蛋白濃度的增加，納米金顏色由紅色變?yōu)樽仙Ｍ瑫r，隨著蛋白濃度的增加，525納米處的吸收峰值逐漸降低，而700納米處的吸收峰值逐漸增加。700納米和525納米處的吸收峰值的比值(A700/A525)用來分析納米金顆粒的聚集程度，比值越高納米金聚集程度越高呈現(xiàn)紫色，比值越低，納米金呈分散狀態(tài)，顏色為紅色。圖6和圖7顯示隨著蛋白濃度的增加，A700/A525比值也增加，且濃度與A700/A525比值呈對數(shù)關(guān)系，即濃度的對數(shù)值與A700/A525呈線性關(guān)系，且線性關(guān)系覆蓋3個數(shù)量級，由5皮摩爾每升到2納摩爾每升。線性關(guān)系方程為A=-0.0316+0.27311oglOC，其中A表示A700/A525比值，C表示蛋白濃度(皮摩爾每升)。用此方程分析空白值加上3倍偏差值得到檢測限為3.8皮摩爾每升。這種方法的檢測靈敏度比直接用納米金檢測和用能量共振轉(zhuǎn)移檢測高出4個數(shù)量級。
[0076]5.實際樣品的檢測
[0077]為了證明此方法的可行性，我們進(jìn)行了實際樣品的檢測。用TNF-α誘導(dǎo)人宮頸癌細(xì)胞系HeLa，使其產(chǎn)生大量NF-κ B p50。利用凝膠遷移實驗(EMSA)證明細(xì)胞核提取物中的NF- κ B p50是否具有活性，結(jié)果如圖8所示。TNF- α誘導(dǎo)的細(xì)胞核提取物組(電泳跑道3)有一條明顯的NF-κ B Ρ50與雙鏈DNA結(jié)合的條帶，相反沒有經(jīng)過TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞核提取物組(電泳跑道1)，NF-kB ρ50與雙鏈DNA結(jié)合的條帶非常弱。
[0078]圖9顯示的結(jié)果與EMSA實驗一致，TNF- α誘導(dǎo)的細(xì)胞核提取物組，納米金有明顯的顏色變化，且最大吸收峰發(fā)生偏移(曲線a)，未經(jīng)過TNF- α誘導(dǎo)的細(xì)胞核提取物組，納米金沒有明顯的顏色變化，且最大吸收峰發(fā)生很小的偏移(曲線b)與沒有細(xì)胞提取物的對照組(曲線c)結(jié)果基本一致。
[0079]以上所述實施例僅表達(dá)了本發(fā)明的一種或幾種實施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。
【權(quán)利要求】
1.一種DNA結(jié)合蛋白的檢測方法，包括如下步驟: 提供待檢測的DNA結(jié)合蛋白的樣品溶液，在Exo III存在的條件下進(jìn)行消化反應(yīng)，反應(yīng)完全后得到消化液，其中，未被Exo III切割的DNA的反義鏈作為引物被保留在所述消化液中； 將所述消化液加入到擴增體系中，在聚合酶、內(nèi)切酶和擴增模板存在的情況下，進(jìn)行等溫擴增反應(yīng)，反應(yīng)完全后得到擴增液，其中，所述擴增模板包括η段重復(fù)序列以及η-1段依次連接所述重復(fù)序列的連接序列，所述引物與所述重復(fù)序列特異性結(jié)合，所述連接序列包括所述內(nèi)切酶的酶切位點，η為不小于2的整數(shù)，所述引物擴增后得到所述擴增模版的互補序列，所述擴增模版的互補序列被所述內(nèi)切酶切割形成η段包含所述重復(fù)序列的靶DNA ； 提供納米金顆粒溶液，并將所述納米金顆粒溶液與含有第一檢測探針和第二檢測探針的溶液混合后進(jìn)行孵育，孵育完成后得到納米金檢測探針溶液，其中，所述第一檢測探針與所述靶DNA特異性互補，所述第二檢測探針與所述靶DNA特異性互補； 將所述擴增液和所述納米金檢測探針溶液混合，反應(yīng)完全后對混合液進(jìn)行檢測，完成所述DNA結(jié)合蛋白的檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA結(jié)合蛋白的檢測方法，其特征在于，所述提供待檢測的DNA結(jié)合蛋白的樣品溶液的操作為: 將HeLa細(xì)胞在含有10%胎牛血清的DMEM中培養(yǎng)，置于加濕處理的含有5% 二氧化碳的37°C培養(yǎng)箱中，加入20納克每毫升TNF- α進(jìn)行刺激，30分鐘后用細(xì)胞核提取物試劑盒裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞提取物即為所述待檢測的DNA結(jié)合蛋白的樣品溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA結(jié)合蛋白的檢測方法，其特征在于，所述DNA結(jié)合蛋白為NF-κ B ρ50 蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA結(jié)合蛋白的檢測方法，其特征在于，所述聚合酶為KF聚合酶，所述內(nèi)切酶為Nb.BbvCI內(nèi)切酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA結(jié)合蛋白的檢測方法，其特征在于，η=2。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA結(jié)合蛋白的檢測方法，其特征在于，所述納米金顆粒溶液通過檸檬酸鈉還原氯金酸法制備得到。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA結(jié)合蛋白的檢測方法，其特征在于，對所述混合液進(jìn)行檢測的操作可以為:肉眼直接觀察，混合液中的納米金檢測探針發(fā)生聚集，顏色由紅色變?yōu)樽仙?br> 8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA結(jié)合蛋白的檢測方法，其特征在于，對所述混合液進(jìn)行檢測的操作可以為:采用分光光度計檢測混合液，光譜采集范圍為410nm?800nm，檢測最大吸收峰。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA結(jié)合蛋白的檢測方法，其特征在于，所述作為引物的DNA的反義鏈的序列為SEQ ID N0.1所示的序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA結(jié)合蛋白的檢測方法，其特征在于，所述擴增模板的序列為SEQ ID N0.2所示的序列； 所述第一檢測探針的序列為SEQ ID N0.3所示的序列； 所述第二檢測探針的序列為SEQ ID N0.4所示的序列。
【文檔編號】G01N33/68GK103472236SQ201310413728
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月11日
【發(fā)明者】張春陽, 張艷 申請人:深圳先進(jìn)技術(shù)研究院