一種超聲輔助測定血漿中細菌內(nèi)毒素含量的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種超聲輔助測定血漿中細菌內(nèi)毒素含量的方法，包括血漿制備，及無熱原水稀釋，然后加熱處理，其特征在于在不同水浴加熱溫度及時間下，通過超聲分散后采用顯色基質(zhì)法來檢測血漿中的細菌內(nèi)毒素含量。該檢測方法具有靈敏度高、檢測結(jié)果可靠和檢測效率高的優(yōu)點。
【專利說明】一種超聲輔助測定血漿中細菌內(nèi)毒素含量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及細菌內(nèi)毒素檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及了一種通過超聲輔助測定血漿中細菌內(nèi)毒素含量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]內(nèi)毒素(endotoxin),又稱脂多糖(lipopolysaccharide, LPS),是革蘭氏陰性菌生長時釋放和死亡時由細胞壁裂解產(chǎn)生的一類脂多糖類物質(zhì)，是革蘭陰性細菌外膜的重要組成部分，它和磷脂雙層、脂蛋白等共同構(gòu)成革蘭陰性細菌的細胞外膜。LPS是一個由多糖和類脂A(lipid A)構(gòu)成的生物大分子，整個分子可分成三個明確的區(qū)域:0_特異性多糖鏈(0-specific polysaccharide chain),核心多糖(core polysaccharide)和 Lipid A0 細菌內(nèi)毒素系在理化特性上屬于兼具親水性與疏水性的兩性分子，攜帶正電與負電荷。內(nèi)毒素是一類具有高度活性的分子，對機體具有廣泛的生物學作用。內(nèi)毒素對機體可引發(fā)一系列的毒害作用，是熱原反應(yīng)的主要誘因，極微量(納克級)內(nèi)毒素進入人體就會引起高熱，血管擴張，甚至昏厥或死亡。內(nèi)毒素血癥是由于革蘭氏陰性菌外細胞壁上的內(nèi)毒素釋放到血液中引起的，可出現(xiàn)于多種疾病過程中，如:大面積燒傷、重癥肝炎、肝硬化等疾病。內(nèi)毒素血癥是臨床最常見的致死疾病之一，其使機體免疫功能嚴重受損，并能引起休克、彌漫性血管內(nèi)凝血、多器官功能衰竭等一系列嚴重的病理變化，最終導(dǎo)致器官壞死、不可逆休克和死亡。死亡率可達40%?90%。
[0003]由于內(nèi)毒素含有負電荷、脂質(zhì)和碳水化合物，因此血漿中已知許多蛋白質(zhì)與內(nèi)毒素結(jié)合并干擾鱟試驗。具體說來，與內(nèi)毒素結(jié)合的蛋白質(zhì)在標準試驗中可引起抑制或增強，導(dǎo)致假陽性和假陰性結(jié)果并影響精度。例如，絲氨酸蛋白酶抑制劑(如大豆胰蛋白酶抑制齊U、α 2纖維蛋白溶解酶抑制劑、α 2巨球蛋白、抑肽酶、抗纖溶酶、抗凝血酶II1、抗胰蛋白酶和水蛭素)妨礙內(nèi)毒素的檢測方法。常用的血漿標本干擾物的去除方法有:氯仿法，酸化法，稀釋加熱法，乙醚加熱法和硫酸銨法。
[0004]目前檢測內(nèi)毒素的主要試劑是鱟試劑，基于鱟試劑的檢測方法包括:凝膠法、顯色法和濁度法。內(nèi)毒素與鱟試劑接觸后，能引發(fā)一系列的級聯(lián)反應(yīng)，最終激活鱟試劑中的凝固酶原，從而導(dǎo)致鱟試劑的凝固。凝膠法用于定性測試，顯色法和濁度法可以用于內(nèi)毒素的定量測定。顯色基質(zhì)法的敏感度與精確度均比其它方法優(yōu)越，客觀上已達到定量檢測，并且僅需少量鱟試劑，是目前內(nèi)毒素檢測的最佳方法。
[0005]內(nèi)毒素單體的分子量在10000道爾頓左右。有文獻報道，內(nèi)毒素分子很少能夠解聚到單體，而傾向于以二聚體的形式穩(wěn)定存在，因此內(nèi)毒素單體的分子量為10000到20000道爾頓左右。以內(nèi)毒素單體或二聚體為基本單位，在二價金屬陽離子(如Ca2+，Mg2+)等作用下，會形成膠束(分子量可以從30萬到100萬道爾頓左右)或者膠囊(分子量大于100萬道爾頓)。LPS在溶液中用漩渦振蕩器一般達不到完全解聚的目的，從而影響血漿中的細菌內(nèi)毒素含量檢測的靈敏度和檢測效率。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是要提供一種測定血漿中細菌內(nèi)毒素含量的方法，該方法中的血漿經(jīng)過超聲分散處理后，其內(nèi)毒素分散均勻，有利于細菌內(nèi)毒素的檢測，從而提高檢測的靈敏度和檢測效率。
[0007]本發(fā)明提供的一種測定血漿中細菌內(nèi)毒素含量的方法通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn):
[0008]一種測定血漿中細菌內(nèi)毒素含量的方法，包括以下過程:血漿制備、稀釋，取樣進行熱處理、冷卻后分散處理，再與鱟試劑混合，通過顯色基質(zhì)法測定血漿中的內(nèi)毒素，其特征在于該檢測方法中的分散處理為超聲處理。
[0009]上述血漿制備過程中得到的血漿可以為富血小板的血漿(PRP)或貧血小板的血漿(PPP)。稀釋過程中使用的稀釋劑為無熱原水；稀釋倍數(shù)為10倍。熱處理過程中溫度為25?100°C;熱處理時間為5?15min。超聲處理過程的超聲頻率為20?40kHz，超聲時間為 5 ?15min。
[0010]上述測定血漿中細菌內(nèi)毒素含量的方法包括的具體步驟為:取含肝素鈉抗凝劑的血液樣本，在0°c?10°C下，以100倍重力加速度(g)離心IOmin后，吸出上層液得富血小板的血漿(PRP)，用無熱原水制成10倍稀釋液，25?100°C加熱處理5?15min，再經(jīng)冰浴冷卻后，冰浴超聲處理5?15min，超聲頻率為20?40kHz，即得檢測樣本I，最后取0.1ml檢測樣本與鱟試劑混合通過顯色基質(zhì)法測定血漿中的內(nèi)毒素含量。
[0011]進一步地，上述方法還可以選用貧血小板的血漿替代，具體步驟為:取含肝素鈉抗凝劑的血液樣本，在0°c?10°C下，以1000倍重力加速度(g)離心IOmin后，吸出上層液得貧血小板的血漿(PPP)，用無熱原水制成10倍稀釋液，25?100°C加熱處理5?15min，再經(jīng)冰浴冷卻后，冰浴超聲處理5?15min，超聲頻率為20?40kHz，即得檢測樣本II，最后取0.1ml檢測樣本與鱟試劑混合通過顯色基質(zhì)法測定血漿中的內(nèi)毒素含量。
[0012]所述血漿中細菌內(nèi)毒素的檢測方法，其采用的是終點顯色基質(zhì)光度測定法。
[0013]上述的超聲輔助法也可以用于除血漿之外的其他體液細菌內(nèi)毒素的檢測，如腦脊液、尿液、腹水、乳汁或病灶組織滲出液的細菌內(nèi)毒素的檢測。
[0014]本發(fā)明提供的技術(shù)方案，其原理是:在適宜的條件下(溫度，pH值及無干擾物質(zhì))，鱟試劑中的C因子被體液樣本中的微量細菌內(nèi)毒素激活，引起一系列酶促反應(yīng)，激活凝固酶原形成凝固酶，凝固酶分解人工合成的顯色基質(zhì)，使其分解為多肽和黃色的對硝基苯胺(ρΝΑ，λ = 405nm)。在一定時間內(nèi)，pNA的生成量與細菌內(nèi)毒素濃度成正相關(guān)，據(jù)此，可以定量供試品的內(nèi)毒素濃度。同時，對硝基苯胺(pNA)可用偶氮化試劑染成玫瑰紅色(λ =545nm)，避免了供試品本身的顏色對405nm處吸收峰的干擾。
[0015]本發(fā)明提供的技術(shù)方案具有如下有益效果:
[0016]1.本發(fā)明提供的稀釋加熱法，能消除血漿中的干擾成分，如蛋白酶類，菌體抗體類，抗凝血酶III，脂蛋白，尿激酶等對鱟試劑反應(yīng)的干擾，避免內(nèi)毒素處理劑的不足與麻煩，從而實現(xiàn)對血漿細菌內(nèi)毒素的定性和定量檢測。
[0017]2.本發(fā)明提供的超聲輔助，使血漿中的細菌內(nèi)毒素這種疏水物質(zhì)能很好地溶解和分散在反應(yīng)體系中，提供檢測結(jié)果的可靠性。
[0018]3.本發(fā)明提供的檢測方法，以血漿樣本為例，進行十倍稀釋，有利于消除干擾。[0019]4.本發(fā)明提供的檢測方法，一方面采用特定的血漿樣本進行制備方法，有利于消除干擾，同時通過超聲輔助，可以使內(nèi)毒素均勻分散，有利于提高檢測的準確性；另一方面，在檢測過程中，采用外加已知濃度的內(nèi)毒素標準溶液進行回收率檢測試驗，可進一步驗證檢測的準確性，從而確保人體液細菌內(nèi)毒素檢測的可靠性，實現(xiàn)對人體液細菌內(nèi)毒素的定性、定量檢測。
[0020]5.本發(fā)明提供的血漿細菌內(nèi)毒素檢測方法，其回收率檢測試驗測得的回收率達70% -120%，比國家標準要求的50% -200%更加準確，而且采用的本法的超聲輔助血漿細菌內(nèi)毒素檢測，可以簡便、快速的進行血漿細菌內(nèi)毒素的檢測，提高檢測效率。
[0021]6.采用本發(fā)明提供的超聲輔助進行血漿細菌內(nèi)毒素檢測，通過光度法測定，可實現(xiàn)對細菌內(nèi)毒素的鑒別率達100%，同時具有檢測靈敏度高的特點，達0.01EU/mL。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]附圖1所示為血漿內(nèi)毒素含量檢測標準曲線圖。
【具體實施方式】
[0023]本發(fā)明是通過下面的具體實施例進行描述，通過具體實施例可以更好的理解本發(fā)明，但是本發(fā)明的范圍不受這些實施例的限制。
[0024]實施例1
[0025]細菌內(nèi)毒素含量標準曲線制作:
[0026]步驟1、配制細菌內(nèi)毒素標準溶液
[0027]標準曲線所采用的內(nèi)毒素濃度梯度可以為0.01，0.025，0.05，0.075，0.lEU/mL或0.1,0.25,0.5,0.75,1.0EU/mL。其稀釋方法如下(以 0.1，0.25，0.5，0.75，1.0EU/mL 梯度為例):取細菌內(nèi)毒素工作品I支，按細菌內(nèi)毒素工作品使用說明書稀釋為10EU/mL的內(nèi)毒素溶液，再稀釋為1.0EU/mL的內(nèi)毒素溶液，以1.0EU/mL的內(nèi)毒素溶液為母液按下表稀釋成0.10,0.25,0.5,0.75,1.0EU/mL 的濃度梯度，見表 I。
[0028]表1、細菌內(nèi)毒素標準溶液配制表
[0029]
【權(quán)利要求】
1.一種測定血漿中細菌內(nèi)毒素含量的方法，包括以下過程:血漿制備、稀釋，取樣進行熱處理、冷卻后分散處理，再與鱟試劑混合，通過顯色基質(zhì)法測定血漿中的內(nèi)毒素，其特征在于所述分散處理為超聲處理。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定血漿中細菌內(nèi)毒素含量的方法，其特征在于所述血漿制備過程中得到的血漿為富血小板的血漿或貧血小板的血漿。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定血漿中細菌內(nèi)毒素含量的方法，其特征在于所述稀釋過程中使用的稀釋劑為無熱原水；稀釋倍數(shù)為10倍。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定血漿中細菌內(nèi)毒素含量的方法，其特征在于所述熱處理過程中溫度為25?100 V ;熱處理時間為5?15 min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定血漿中細菌內(nèi)毒素含量的方法，其特征在于所述超聲處理過程的超聲頻率為20?40 kHz，超聲時間為5?15 min。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定血漿中細菌內(nèi)毒素含量的方法，其特征在于包括以下步驟:取含肝素鈉抗凝劑的血液樣本，在(TC?10°C下，以100倍重力加速度離心10 min后，吸出上層液得富血小板的血漿(PRP)，用無熱原水制成10倍稀釋液，25?100°C加熱處理5?15min，再經(jīng)冰浴冷卻后，冰浴超聲處理5?15 min，超聲頻率為2(T40 kHz，即得檢測樣本I，最后取0.1ml檢測樣本與鱟試劑混合通過顯色基質(zhì)法測定血漿中的內(nèi)毒素含量。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定血漿中細菌內(nèi)毒素含量的方法，其特征在于包括以下步驟:取含肝素鈉抗凝劑的血液樣本，在0°C?10°C下，以1000倍重力加速度離心10 min后，吸出上層液得貧血小板的血漿(PPP)，用無熱原水制成10倍稀釋液，25?100°C加熱處理5?15 min，再經(jīng)冰浴冷卻后，冰浴超聲處理5?15 min，超聲頻率為2(T40 kHz，即得檢測樣本II，最后取0.1ml檢測樣本與鱟試劑混合通過顯色基質(zhì)法測定血漿中的內(nèi)毒素含量。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定血漿中細菌內(nèi)毒素含量的方法，其特征在于所述顯色基質(zhì)法采用的是終點顯色基質(zhì)光度測定法。
9.權(quán)利要求1-8中任一項的測定血漿中細菌內(nèi)毒素含量的方法，所述方法也可以用于腦脊液、尿液、腹水、乳汁或病灶組織滲出液的細菌內(nèi)毒素的檢測。
【文檔編號】G01N21/31GK103454235SQ201310420368
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年9月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月13日
【發(fā)明者】陳校園, 李永桂, 鄧永杰, 何楚華 申請人:廣州康盛生物科技有限公司