一種篩選血管內皮生長因子1激酶抑制劑高通量篩選方法
【專利摘要】本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種篩選血管內皮生長因子1激酶抑制劑高通量篩選方法，包括以下步驟：(1)血管內皮生長因子1激酶抑制劑篩選模型的建立與優(yōu)化：進行激酶濃度、溫孵時間、底物濃度、ATP濃度實驗；(2)陽性藥驗證模型可靠性：選用合適濃度的激酶，ATP Km，底物Km，激酶和底物每孔分別加入2μl，再按濃度梯度每孔加入4μl陽性藥，加入2ul ATP反應，按優(yōu)化時間室溫孵育；每孔加入10μl終止液終止反應，室溫孵育1小時后檢測，分析得陽性藥IC50；(3)高通量篩選模型驗證：按照上述步驟操作，使用Biomek NXP自動化加樣儀器和Multidrop自動分液器進行加樣，計算Z因子。本發(fā)明的優(yōu)點主要有：1)簡便快捷；2)靈敏度高；3)結果穩(wěn)定可靠，重現(xiàn)性好，可用于高通量篩選。
【專利說明】一種篩選血管內皮生長因子1激酶抑制劑高通量篩選方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥理學領域，利用均相時間分辨熒光檢測技術，構建了血管內皮生長 因子受體酪氨酸激酶（VEGFR)抑制劑的高通量篩選模型，用于待測樣品對VEGFR激酶抑制 活性的高通量檢測。

【背景技術】
[0002] VEGFR家族主要包括VEGFR-1 (Flt-1)、VEGFR-2 (Flk-1 /KDR)、VEGFR-3 (Flt-4)三 個成員，屬于受體型酪氨酸激酶（receptortyrosinekinases，RTKs)，由3部分組成，包括 胞外的7個免疫球蛋白樣結構域、跨膜區(qū)和胞內的酪氨酸激酶活性區(qū)。VEGFR-1是VEGF-A、 VEGF-B和PIGF的高親和性受體，存在于血管內皮細胞、造血干細胞、巨噬細胞和單核細胞 表面，與這些細胞的遷移有關。受體或相應配體的過量表達，會通過多條路徑、多種機制激 活細胞內信號轉導，信號蛋白進入細胞核激活轉錄因子，導致細胞增殖失調、凋亡抑制、血 管生成、細胞侵襲和轉移等，進而導致腫瘤和其他相關疾病的發(fā)生。VEGFR酪氨酸激酶抑制 劑作用于VEGFR信號轉導過程的最上游，能阻斷多條通路，具有治療范圍廣、療效高和不易 耐藥等優(yōu)點。因此，研究VEGFR激酶抑制劑具有重大意義。
[0003] 時間分辨突光技術（time-resolvedfluorescence,TRF)是基于鑭系元素如銪 (Eu)、釤（Sm)、鏑（Dy)等具有較長熒光壽命的特點發(fā)展而來的。當銪螯合物供體與受體之 間距離小于l〇nm，且供體發(fā)射光譜與受體激發(fā)光譜有重疊時，則發(fā)生熒光共振能量轉移，均 相時間分辨突光（homogeneoustime-resolvedfluorescence，HTRF)技術是法國Cisbio 公司利用這一原理進行深入開發(fā)的產品。大多數熒光物質的熒光壽命非常短（一般為幾毫 秒），為了避免短暫的熒光干擾，Cisbio公司利用較長熒光壽命的鑭系螯合物作為熒光能 量供體，受體經過別藻藍蛋白（allophycocyanin)或突光素修飾，供體在能量轉移時就可 以使受體也具有較長的熒光壽命。因此，能量轉移時受體發(fā)射光消失時間與供體發(fā)射光消 失時間成正比，而與供受體間的距離成反比，這種方法延長了熒光檢測時間，降低了短暫熒 光引起的背景干擾。
[0004] 目前，已有多種VEGFR1激酶抑制劑的篩選方法，多利用ELISA法來篩選VEGFR1激 酶抑制劑，但是此方法費時費力，難以做到高通量篩選。因此，建立方便快捷準確的檢測方 法，特別是體外的功能性檢測在藥物篩選中越來越受到重視。


【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于建立一種基于均相時間分辨熒光的VEGFR1激酶抑制劑高通量 篩選模型，具有信噪比高，使用安全，樣品消耗量小的特點。
[0006] 本發(fā)明的技術方案：采用均相時間分辨熒光方法建立體外VEGFR1激酶抑制劑高 通量篩選模型，初篩，復篩發(fā)現(xiàn)一類具有抑制VEGFR1激酶活性的候選化合物。具體步驟如 下：
[0007] 本發(fā)明利用均相時間分辨熒光的方法建立了一種VEGFR1激酶抑制劑高通量篩選 模型。
[0008] 步驟一 ：VEGFR1激酶抑制劑篩選模型的建立與優(yōu)化。
[0009] 步驟二：陽性藥驗證模型可靠性。
[0010] 步驟三：高通量篩選模型驗證。

【專利附圖】

【附圖說明】：
[0011] 圖1 :VEGFR1激酶濃度梯度優(yōu)化實驗結果。（n=3,is；
[0012] 圖2 :VEGFR1激酶溫孵時間優(yōu)化實驗結果。（n=3,hs;
[0013] 圖3 :VEGFR1激酶底物濃度優(yōu)化實驗結果。（n=3,
[0014] 圖4 :VEGFR1激酶ATP濃度優(yōu)化實驗結果。（n=3,
[0015] 圖5 :陽性藥十字孢堿對VEGFR1激酶的抑制曲線圖。（n=3,
[0016] 圖6 :VEGFR1激酶抑制劑高通量篩選模型信號檢測窗口。
[0017] 圖7:高通量篩選Z'值分布。

【具體實施方式】
[0018] 以下結合【專利附圖】

【附圖說明】本發(fā)明的【具體實施方式】：
[0019] 1.VEGFR1激酶抑制劑篩選方法建立
[0020] (1)實驗材料
[0021]VEGFR1 激酶檢測試劑盒（Cisbio,法國）、VEGFR1 激酶（Invitrogen，美國）、 ATP(生興，中國）、十字孢堿（碧云天，中國）、384低體積白板（Corning,美國）、槍頭 (Axygen，美國）。
[0022] (2)實驗步驟
[0023] 1)進行VEGFR1激酶濃度梯度、溫孵時間、底物濃度、ATP濃度實驗，見圖1-4。
[0024] 2)待測化合物精確稱量，加入DMS0溶劑成母液，然后使用檢測緩沖液配制待測化 合物溶液至所需濃度，初篩濃度約為lXl(T3m〇l/L。
[0025] 3)在反應容器中每孔加入VEGFR1激酶溶液2ill，底物溶液2ill，緩沖液或待篩化 合物4iil，ATP2ill。室溫反應1小時。
[0026] 4)每孔加入Estradiol_XL665 5U1，Anti-Estradiol-cryptate5U1，室溫孵育 1小時。
[0027] 5)利用美國貝克曼庫爾特（BeckmanCoulter)公司檢測平臺HTRF模塊分別檢測 665nm和610nm處的突光強度。
[0028] 6)繪制陽性藥十字孢堿量效曲線并測定其IC5Q值，見圖5。
[0029] 7)采集檢測信號并繪圖，通過信號窗和Z'值確定高通量篩選模型的可靠性，見圖 6,7。
[0030] 2?數據處理
[0031] (1)根據公式計算各孔665nm和610nm處突光強度的比值（Ratio665 / 610);
[0032] (2)根據公式計算各孔的相對抑制率
[0033]

【權利要求】
1. 一種血管內皮生長因子1激酶抑制劑高通量篩選模型，其特征在于，包括步驟： (1) 激酶抑制劑篩選模型的建立與優(yōu)化； (2) 陽性藥驗證模型可靠性； (3) 高通量篩選模型驗證。
2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的激酶為血管內皮生長因子1激酶。
3. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟⑴中進行血管內皮生長因子1激酶濃 度梯度、溫孵時間、底物濃度、ATP濃度實驗。
4. 如權利要求3所述的方法，其特征在于，由步驟（1)可得到最佳反應所需的血管內皮 生長因子1激酶濃度為0. 2ng / iil，最佳溫孵時間為60min，最佳底物濃度為148. 8nM，最 佳ATP濃度為1. liiM。
5. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（2)選用步驟（1)所到的合適濃度的 激酶，ATP Km，底物Km ;將激酶和底物按1 :2體積混合，每孔加入4 iil，再按濃度梯度每孔 加入4 陽性藥，最后每孔加入2 ATP開始反應，按優(yōu)化時間室溫孵育；配制SA-XL665 和TK-Ab，將SA-XL665和TK Ab按體積比1 :1混合，每孔加入lOiil終止反應，室溫孵育1 小時后檢測，分析數據得陽性藥半數抑制率IC5(I為14. 18nM。
6. 權利要求1-5中所述任一方法在篩選血管內皮生長因子1激酶抑制劑的應用。
【文檔編號】G01N21/64GK104458674SQ201310421211
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2013年9月12日 優(yōu)先權日:2013年9月12日
【發(fā)明者】嚴明, 張陸勇, 胡潔, 高鵬 申請人:中國藥科大學