一種測(cè)定微藻單藻落脂肪酸成分構(gòu)成的方法
【專利摘要】本發(fā)明是一種測(cè)定微藻單藻落脂肪酸成分構(gòu)成的方法。本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)在微藻油脂成分分析過程使用的甲酯化方法需樣量大、操作步驟多和耗時(shí)長(zhǎng)的技術(shù)問題。本發(fā)明方法無需制備干燥藻粉，無需提取藻油，在飽和堿催化條件下，直接對(duì)微藻的單藻落進(jìn)行甲酯化反應(yīng)：一個(gè)大小約2-5mm的微藻單藻落，加入1ml的飽和KOH-CH3OH溶液，對(duì)單藻落樣品進(jìn)行皂化和甲酯化，在充分混合震蕩作用后，加入1ml正己烷，萃取得到的脂肪酸甲酯，即可進(jìn)行氣相色譜分析。本發(fā)明方法適用于綠藻門、金藻門、硅藻門等單細(xì)胞藻類進(jìn)行快速及在線監(jiān)測(cè)的脂肪酸成分分析。
【專利說明】一種測(cè)定微藻單藻落脂肪酸成分構(gòu)成的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于能源微藻領(lǐng)域，具體的說是一種以微藻單藻落為原料的微量快速分析 其脂肪酸成分構(gòu)成方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 目前，中國(guó)經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展令世人矚目，但是，環(huán)境污染和能源不足對(duì)中國(guó)經(jīng)濟(jì)持 續(xù)高速發(fā)展的負(fù)面影響也越來越凸顯。在能源方面。我國(guó)化石能源，特別是石油儲(chǔ)量不足， 不僅制約經(jīng)濟(jì)高速發(fā)展，甚至危害到國(guó)家能源安全。
[0003] 微藻作為重要的生物能源原料，具有生物量大、生長(zhǎng)周期短、易培養(yǎng)以及含有較高 的脂類物質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)，不僅在大氣C02的循環(huán)利用中起著重要作用，而且還是制備生物質(zhì)液體 燃料的良好材料，具有廣闊的開發(fā)和利用前景。
[0004] 脂肪酸作為能源微藻的一種重要產(chǎn)物，無論是在藻種篩選還是在微藻的培養(yǎng)過程 中，其含量的積累和變化都為進(jìn)一步的研究開發(fā)提供理論依據(jù)和技術(shù)參數(shù)。
[0005] 對(duì)于微藻脂肪酸的測(cè)定，目前還沒有標(biāo)準(zhǔn)方法，大多數(shù)的方法是用有機(jī)溶劑提取 濃縮后得到的微藻粗脂肪，再對(duì)粗脂肪進(jìn)行皂化和甲酯化，用有機(jī)溶劑提取，最后用GC來 測(cè)定脂肪酸的含量。但是現(xiàn)有方法大都操作復(fù)雜、處理時(shí)間長(zhǎng)，不適合快速檢測(cè)。因此，快 速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的測(cè)定脂肪酸成分構(gòu)成，是今后一段時(shí)間的研究熱點(diǎn)。本方法即針對(duì)這一問 題，開展微藻脂肪酸快速測(cè)定方法研究，以期為其應(yīng)用提供前期基礎(chǔ)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種快速檢測(cè)微藻中脂肪酸成分構(gòu)成 的方法，本方法與傳統(tǒng)常用的微藻脂肪酸提取制備方法比較，具有操作步驟簡(jiǎn)單、快速等優(yōu) 點(diǎn)。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：
[0008] 取一個(gè)微藻的單藻落或等量微藻樣品（約0? 01_5mg)，加入1ml的飽和K0H-CH30H 溶液，對(duì)單藻落樣品進(jìn)行皂化和甲酯化，在充分混合震蕩作用后，加入1ml正己烷，萃取得 到的脂肪酸甲酯，即可進(jìn)行氣相色譜分析。
[0009]具體步驟如下：
[0010] (1)脂肪酸的甲酯化：
[0011] 取一個(gè)微藻的單藻落或等量微藻樣品（約0. 01_5mg)，將其加入1ml的飽和 K0H-CH30H溶液，超聲清洗輔助震蕩反應(yīng)5min，再加入lml正己烷，震蕩萃取，靜置后得到己 烷層即為脂肪酸甲酯，可進(jìn)行氣相色譜分析；
[0012] (2)脂肪酸的氣相色譜檢測(cè)條件：
[0013]a、色譜柱：DB-23 毛細(xì)管柱（30mX0. 32mmX0. 25iim);
[0014]b、載氣：氮?dú)?，流速?.6ml/min，進(jìn)樣口溫度270°C，F(xiàn)ID檢測(cè)器，檢測(cè)器溫度 280。。；
[0015] c、升溫程序?yàn)椋撼鯗?30°C，5°C/min升至170°C，再以3°C/min升溫至220°C，保 持lOmin;
[0016] d、分流比為10:1，分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量liiL;
[0017] e、脂肪酸成分構(gòu)成，定性由與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間對(duì)照來確定，成分構(gòu)成由各組分 對(duì)應(yīng)峰面積歸一化計(jì)算得來。
[0018] 同時(shí)，本發(fā)明除了應(yīng)用在單藻落的脂肪酸成分分析，還可以應(yīng)用在與單藻落等量 的微藻樣品中，如可以將0. 01-5mg的藻粉使用同樣的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)，即可快速的得 到其脂肪酸成分結(jié)果。這樣便可以將此方法應(yīng)用于培養(yǎng)過程的在線監(jiān)測(cè)。
[0019] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0020] 1.樣品用量極少，可實(shí)現(xiàn)微藻培養(yǎng)過程監(jiān)控；
[0021] 2.無需制備干燥藻粉；
[0022] 3.無需提取藻種油脂，減少了操作步驟；
[0023] 4.縮短樣品甲酯化時(shí)間，最快可在0. 5小時(shí)內(nèi)完成檢測(cè)，大大的節(jié)省了時(shí)間成本。

【具體實(shí)施方式】
[0024] 下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明方法和結(jié)果進(jìn)行說明。
[0025] 使用氣相色譜對(duì)其脂肪酸甲酯成分進(jìn)行分析。
[0026] a、色譜柱：DB-23 毛細(xì)管柱（30mX0. 32mmX0. 25iim);
[0027]b、載氣：氮?dú)猓魉贋?.6ml/min，進(jìn)樣口溫度270°C，F(xiàn)ID檢測(cè)器，檢測(cè)器溫度 280。。；
[0028] c、升溫程序?yàn)椋撼鯗?30°C，5°C/min升至170°C，再以3°C/min升溫至220°C，保 持lOmin;
[0029] d、分流比為10:1，分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量liiL;
[0030] e、脂肪酸成分構(gòu)成，定性由與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間對(duì)照來確定，成分構(gòu)成由各組分 對(duì)應(yīng)峰面積歸一化計(jì)算得來。
[0031] 藻種：湛江等鞭金藻（Isochrysiszhanjiangensis)、亞心形四月藻（Tetraselmis subcordiformis)、杜氏鹽藻（Dunaliellasalina)、叉鞭金藻（Dicrateriainornata)、萊 茵衣藻（Chlamydomonasreinhardti)
[0032] 實(shí)施例1 :
[0033] 選用同一份湛江等鞭金藻的藻粉樣品，分別使用常規(guī)使用的酸催化轉(zhuǎn)酯化方法和 本方法進(jìn)行對(duì)比，驗(yàn)證本方法的可行性。
[0034] 稱取兩份約5mg金藻藻粉，一份為5. 7mg，加入5ml的體積濃度1%的硫酸-甲醇 溶液，在70°C水浴加熱，反應(yīng)lh，待反應(yīng)體系降至室溫后，向其中加入0. 75ml的去離子水和 2ml的正己烷進(jìn)行充分震蕩混勻，靜置分層后取上層己烷層使用氣相色譜對(duì)其脂肪酸甲酯 成分進(jìn)行分析；
[0035] 另一份使用本方法進(jìn)行轉(zhuǎn)酯化，向稱取好的4. 9mg藻粉中加入1ml的飽和 K0H-CH30H溶液，超聲清洗輔助震蕩反應(yīng)5min，再加入lml正己烷，震蕩萃取，靜置后得到己 烷層即為脂肪酸甲酯，收集正己烷層，使用氣相色譜對(duì)其脂肪酸甲酯成分進(jìn)行分析。
[0036] 兩種方法的測(cè)得的脂肪酸成分結(jié)果相似，證明本方法可行。具體數(shù)據(jù)見表1。
[0037] 表1.比較常規(guī)方法和本方法得到的脂肪酸成分構(gòu)成的分析結(jié)果
[0038]
[0039]

【權(quán)利要求】
1. 一種測(cè)定微藻單藻落脂肪酸成分構(gòu)成的方法，其特征在于：取一個(gè)微藻的單藻落或 等量微藻樣品，加入飽和的koh-ch3oh溶液，充分混合震蕩，進(jìn)行皂化和甲酯化反應(yīng)，加入正 己烷萃取脂肪酸甲酯，對(duì)該組分進(jìn)行氣相色譜分析。
2. 按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于： 具體步驟如下： (1) 脂肪酸的甲酯化： 取質(zhì)量為〇. 〇l_5mg的一個(gè)微藻的單藻落或微藻樣品，將其加入0. 5-2ml的飽和 KOH-CH3OH溶液，超聲清洗輔助震蕩反應(yīng)3-20min，再加入0. 5-2ml正己烷，震蕩萃取，靜置 后得到正己烷層即為脂肪酸甲酯，脂肪酸甲酯進(jìn)行氣相色譜分析； (2) 脂肪酸甲酯的氣相色譜檢測(cè)條件(碳數(shù)從8到24的飽和及不飽和脂肪酸甲酯均可 檢測(cè)）： a、 色譜柱：DB-23 毛細(xì)管柱（30mX0. 32mmX0. 25iim); b、 載氣：氮?dú)?，流速?. 6ml/min，進(jìn)樣口溫度270°C，F(xiàn)ID檢測(cè)器，檢測(cè)器溫度280°C ; c、 升溫程序?yàn)椋撼鯗?30°C，5°C /min升至170°C，再以3°C /min升溫至220°C，保持 lOmin ； d、 分流比為10:1，分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1 y L ; e、 由氣相色譜數(shù)據(jù)獲知脂肪酸甲酯的成分構(gòu)成，進(jìn)一步即獲知微藻單藻落或微藻樣品 脂肪酸成分構(gòu)成。
3. 按照權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于： 步驟（2) e中由氣相色譜數(shù)據(jù)獲知脂肪酸甲酯的成分構(gòu)成，其脂肪酸甲酯的成分構(gòu)成 的定性結(jié)論由氣相色譜數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間對(duì)照來確定，成分的相對(duì)定量結(jié)論構(gòu)成由 各組分對(duì)應(yīng)峰面積歸一化計(jì)算得來。
4. 按照權(quán)利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述微藻為紅藻、硅藻、綠藻或金 藻。
【文檔編號(hào)】G01N30/06GK104458982SQ201310422373
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2013年9月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月16日
【發(fā)明者】薛松, 劉亞男, 曹旭鵬, 艾江寧 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所