檢測(cè)prrsv的多重?zé)晒舛縭t-pcr方法及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了檢測(cè)PRRSV多重?zé)晒舛縍T-PCR方法及其應(yīng)用。檢測(cè)PRRSV熒光定量RT-PCR引物和探針，引物包括AM-PRRSV引物對(duì)和TJM-PRRSV引物對(duì)，探針包括AM-V-PRRSV-P探針、AM-C-PRRSV-P探針、TJM-PRRSV-P探針；檢測(cè)PRRSV多重?zé)晒舛縍T-PCR方法，利用引物和探針進(jìn)行熒光定量RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后收集熒光信號(hào)，出現(xiàn)擴(kuò)增曲線者為陽(yáng)性，其特征在于，所述RT-PCR擴(kuò)增體系包括上述引物和探針。本發(fā)明可同時(shí)檢測(cè)并區(qū)分PRRSV美洲型經(jīng)典毒株、HP-PRRSV及高致病性PRRS活疫苗TJM-F92株，具有特異性強(qiáng)、敏感性高、自動(dòng)化程度高優(yōu)點(diǎn)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】檢測(cè)PRRSV的多重?zé)晒舛縍T-PCR方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于動(dòng)物病毒分子生物檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)的多重?zé)晒舛縍T-PCR方法，及其應(yīng)用于同時(shí)對(duì)PRRSV美洲型經(jīng)典毒株、美洲型變異毒株以及高致病性PRRS活疫苗TJM-F92株進(jìn)行快速檢測(cè)。
【背景技術(shù)】
[0002]豬繁殖與呼吸綜合征(porcinereproductive and respiratory syndrome,PRRS),又稱(chēng)“豬藍(lán)耳病”,是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive andrespiratory syndrome virus, PRRSV)引起豬的一種高度接觸性傳染病，臨床上主要表現(xiàn)為妊娠母豬流產(chǎn)、早產(chǎn)、產(chǎn)死胎、木乃伊胎等繁殖障礙以及各種年齡豬特別是仔豬的嚴(yán)重呼吸道疾病。PRRS最早于1987年在美國(guó)發(fā)生，1991年荷蘭首次分離到PRRSV，美國(guó)亦于1992年分離到該病毒。此后，該病相繼在各主要養(yǎng)豬國(guó)家發(fā)生，現(xiàn)已呈世界性流行，給世界各國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。根據(jù)病毒基因組的差異，PRRSV可分為歐洲型和美洲型毒株，兩種基因型毒株之間基因組差異很大，核苷酸序列同源性?xún)H為60 %左右。1996年郭寶清等首次在國(guó)內(nèi)分離到PRRSV，證實(shí)該病在我國(guó)存在。2006年國(guó)內(nèi)爆發(fā)高致病性豬藍(lán)耳病(HP-PRRS)，并證實(shí)其病原是以Nsp2蛋白481 aa和533~561 aa發(fā)生30個(gè)氨基酸不連續(xù)缺失為標(biāo)志的高致病性變異毒株(HP-PRRSV)。2010年我國(guó)開(kāi)始在臨床使用HP-PRRSV致弱的活疫苗，以便有效防控HP-PRRS。這些弱毒疫苗毒株包括由JXA1株致弱的JXA1-R株、由HuN4株致弱的HuN4-R株、由TJ株致弱的TJM-F92株等。其中，TJM - F92疫苗株是在HP-PRRS發(fā)病豬體內(nèi)分離的高致病性強(qiáng)毒TJ株通過(guò)噬斑篩選后，在Marc-145細(xì)胞上傳代至92代，獲得了致弱的疫苗毒TJM-F92株。TJM-F92株Nsp2蛋白除了與其它HP-PRRSV一樣在多變區(qū)不連續(xù)缺失30 aa以外，還出現(xiàn)了第1882~2441 aa共120個(gè)氨基酸(360個(gè)堿基)的連續(xù)缺失。2010年農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)臨床使用HP-PRRSV致弱的活疫苗以來(lái)，廣西一直采購(gòu)、使用TJM - F92株活疫苗，而未采購(gòu)、使用其他弱毒株活疫苗，以便于正確區(qū)分臨床發(fā)病豬體內(nèi)的PRRSV野毒株和疫苗株。
[0003]當(dāng)前，國(guó)內(nèi)PRRSV美洲型流行毒株既有經(jīng)典毒株，也有HP-PRRSV，加上臨床使用的弱毒疫苗株，在臨床檢測(cè)中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)在同一地區(qū)甚至同一養(yǎng)殖場(chǎng)的豬群中同時(shí)存在兩種或兩種以上的病毒株，給該病的診斷帶來(lái)極大的困難，這就使得建立PRRSV的快速鑒別檢測(cè)方法顯得尤為重要。迄今，國(guó)內(nèi)外建立了一些技術(shù)，包括雙抗體夾心ELISA、間接免疫熒光抗體試驗(yàn)(IFA)、原位雜交技術(shù)(ISH)、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、單重及多重?zé)晒舛縍T-PCR等。但是已經(jīng)建立的技術(shù)都無(wú)法同時(shí)檢測(cè)并區(qū)分PRRSV美洲型經(jīng)典毒株、變異毒株以及TJM-F92疫苗 毒株。因此，建立能同時(shí)檢測(cè)并區(qū)分PRRSV美洲型經(jīng)典毒株、變異毒株以及TJM-F92疫苗株的檢測(cè)方法不僅能彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)在這一領(lǐng)域的空白，還具有創(chuàng)新性實(shí)踐意義。
[0004]熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國(guó)Applied Biosystems公司推出，是指在PCR體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR過(guò)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)待測(cè)模板進(jìn)行定性、定量分析的方法。由于該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了 PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問(wèn)題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，目前已被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、病毒等病原體檢測(cè)、腫瘤基因檢測(cè)、免疫分析、基因表達(dá)、基因突變及其多態(tài)性的研究等多個(gè)領(lǐng)域。多重?zé)晒舛縋CR是熒光定量PCR的一種特殊形式，是在同一反應(yīng)體系中加入多對(duì)引物和多條探針，同時(shí)擴(kuò)增、檢測(cè)多個(gè)模板的熒光定量PCR技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是采用多重TaqMan熒光定量RT-PCR技術(shù)，針對(duì)PRRSV美洲型經(jīng)典毒株、變異毒株以及高致病性PRRS活疫苗TJM-F92株基因組中的保守序列，建立同時(shí)檢測(cè)PRRSV的多重TaqMan熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法，提供同時(shí)檢測(cè)并區(qū)分PRRSV美洲型經(jīng)典毒株、變異毒株以及高致病性PRRS活疫苗TJM-F92株的引物、探針及其方法。本發(fā)明特異性強(qiáng)、靈敏度高，操作安全方便，能實(shí)現(xiàn)PRRSV美洲型經(jīng)典毒株、變異毒株以及高致病性PRRS活疫苗TJM-F92株等三種毒株的同時(shí)檢測(cè)，為PRRSV美洲型野毒株、弱毒疫苗株的同時(shí)快速鑒別檢測(cè)及有效防控HP-PRRS提供了新的途徑，具有良好的應(yīng)用前景。 [0006]本發(fā)明的技術(shù)方案為:
一種檢測(cè)PRRSV的多重?zé)晒舛縍T-PCR方法，該方法利用AM-PRRSV引物對(duì)、TJM-PRRSV 引物對(duì)、AM-V-PRRSV-P 探針、AM-C-PRRSV-P 探針、TJM-PRRSV-P 探針對(duì)陽(yáng)性對(duì)照樣品、檢測(cè)樣品進(jìn)行熒光RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后收集熒光信號(hào)，其特征在于，所述的TJM-PRRSV引物對(duì)其上游引物核苷酸序列為5’ - CAACCCTGCACCTGTGTCAT _3’，下游引物核苷酸序列為5’ - TTCTCCCTTGGAGGGTGCC -3’ ；所述的TJM-PRRSV-P探針為5’ -F-AGCTCCCTGGGTTCAGTGGCC -Q-3’，其中F為報(bào)告熒光基團(tuán)，Q為淬滅熒光基團(tuán)。收集得到的檢測(cè)樣品熒光信號(hào)與陽(yáng)性對(duì)照樣品(標(biāo)準(zhǔn)品)熒光信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比對(duì)，檢測(cè)樣品熒光定量RT-PCR擴(kuò)增出現(xiàn)類(lèi)似陽(yáng)性對(duì)照樣品(標(biāo)準(zhǔn)品)的擴(kuò)增曲線者為陽(yáng)性，未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線者為陰性。
[0007]作為本發(fā)明的進(jìn)一步限定，所述的AM-PRRSV引物對(duì)的上游引物核苷酸序列為5’ - GAGTGGGTCGGCTCCAGTTC -3’，下游引物核苷酸序列為 5’ - GCCTCATATTCCGTCTGTGA-3’ ；所述的 AM-V-PRRSV-P 探針為 5’ -F- TAGAACTGTGACAACAACGCTGA -Q-3’ ；所述的AM-C-PRRSV-P 探針為 5’-F- AACTGTGTCTCGACCGGTGAC -Q-3’ ；其中 F 為報(bào)告熒光基團(tuán)，Q 為
淬滅熒光基團(tuán)。
[0008]作為本發(fā)明的進(jìn)一步限定，所述的F為FAM、TAMRA、J0E中的任一種；所述的Q為BHQ 或 MGB。
[0009]作為本發(fā)明的進(jìn)一步限定，所述RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系還包括Premix Ex Taq?試劑、R0X參比染料、模板、滅菌雙蒸水。
[0010]作為本發(fā)明的進(jìn)一步限定，當(dāng)RT-PCR擴(kuò)增體系為陽(yáng)性對(duì)照樣品反應(yīng)時(shí)，所述的模板為p-C-Nsp2質(zhì)粒、p-V-Nsp2質(zhì)粒和p_TJM_F92質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品混合液；當(dāng)RT-PCR擴(kuò)增體系為檢測(cè)樣品反應(yīng)時(shí)，所述的模板為從疑似PRRSV感染的動(dòng)物組織或血清抽提的總RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA。
[0011 ] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步限定，所述p-C-Nsp2質(zhì)粒為含有美洲型經(jīng)典毒株VR-2332株Nsp2基因的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒；所述p-V-Nsp2質(zhì)粒為含有美洲型變異毒株JXA1株Nsp2基因的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒；所述P-TJM-F92質(zhì)粒為含有高致病性PRRS活疫苗TJM-F92株Nsp2基因的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。
[0012]作為本發(fā)明的進(jìn)一步限定，所述的RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為95°C 2min —95°C10s — 54°C 30s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，同時(shí)收集熒光信號(hào)。
[0013]作為本發(fā)明的進(jìn)一步限定，所述的RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系包括:Premix ExTaqTM10~12.5ul, 25pmol/^L AM-PRRSV 上游引物 0.2~0.4ul，25pmol/^L AM-PRRSV 下游引物 0.2~0.4 ul，25pmol/^L AM-V-PRRSV-P 探針 0.15~0.25ul，25pmol/^L AM-C-PRRSV-P 探針 0.2~0.4ul，25pmol/^L TJM-PRRSV 上游引物 0.8~1.2ul，25pmol/^L TJM-PRRSV 下游引物 0.8~1.2ul，25pmol/^L TJM-PRRSV-P 探針 0.5~0.7ul, ROX 參比染料 0.4~0.5ul,模板1.0~2.0ul，雙蒸水 2.0~8.25ul。 [0014]作為本發(fā)明的進(jìn)一步限定，所述的RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系包括:Premix ExTaq?12.5ul, 25pmol/^L AM-PRRSV 上游弓丨物 0.4ul，25pmol/^L AM-PRRSV 下游弓丨物
0.4 ul，25pmol/^L AM-V-PRRSV-P 探針 0.25ul，25pmol/^L AM-C-PRRSV-P 探針 0.4ul,25pmol/^L TJM-PRRSV 上游引物 1.2ul，25pmol/^L TJM-PRRSV 下游引物 1.2ul，25pmol/^LTJM-PRRSV-P 探針 0.7ul, ROX 參比染料 0.5ul，模板 2.0ul，雙蒸水 5.45ul。
[0015]一種檢測(cè)PRRSV的多重?zé)晒舛縍T-PCR方法的應(yīng)用，檢測(cè)PRRSV的多重?zé)晒舛縍T-PCR方法用于快速檢測(cè)并區(qū)分PRRSV美洲型經(jīng)典毒株、PRRSV美洲型變異毒株、高致病性PRRS活疫苗毒株。所述高致病性PRRS活疫苗株為T(mén)JM-F92株。高致病性PRRS活疫苗株的判定依據(jù)是檢測(cè)樣品出現(xiàn)兩條擴(kuò)增曲線，一條要類(lèi)似于美洲型變異毒株標(biāo)準(zhǔn)曲線，另一條要類(lèi)似于高致病性PRRS活疫苗株標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0016]本發(fā)明的具體原理是，針對(duì)PRRSV美洲型經(jīng)典毒株Nsp2基因、變異毒株Nsp2基因以及高致病性PRRS活疫苗TJM-F92株Nsp2基因，設(shè)計(jì)了用于多重?zé)晒舛縍T-PCR檢測(cè)的擴(kuò)增引物和TaqMan探針，分別使用FAM、J0E、TAMRA等基團(tuán)作為探針的發(fā)光基團(tuán)，設(shè)計(jì)并構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒、計(jì)算出其拷貝數(shù)，建立陽(yáng)性對(duì)照樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線，優(yōu)化RT-PCR的反應(yīng)體系，以及其反應(yīng)步驟，以對(duì)應(yīng)于熒光定量PCR儀的不同波長(zhǎng)段用于同時(shí)檢測(cè)，構(gòu)建出基于引物和熒光探針的PRRSV多重?zé)晒舛縍T-PCR檢測(cè)方法。本法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高和重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，用于快速檢測(cè)并區(qū)分PRRSV美洲型經(jīng)典毒株、PRRSV美洲型變異毒株、高致病性PRRS活疫苗TJM-F92株，彌補(bǔ)了現(xiàn)有技術(shù)在這一領(lǐng)域的空白，具有實(shí)用性。試驗(yàn)方法及具體過(guò)程如下:
1.設(shè)計(jì)引物和探針。
[0017]針對(duì)PRRSV美洲型經(jīng)典毒株、變異毒株以及高致病性PRRS活疫苗TJM-F92株的Nsp2基因，設(shè)計(jì)了用于多重?zé)晒舛縍T-PCR檢測(cè)的擴(kuò)增引物和TaqMan探針，分別使用FAM、JOE、TAMRA等基團(tuán)作為探針的發(fā)光基團(tuán)F，以BHQ等基團(tuán)作為探針的淬滅基團(tuán)Q，以對(duì)應(yīng)于熒光定量PCR儀的不同波長(zhǎng)段用于同時(shí)檢測(cè)。引物和探針序列如表1所示。
[0018]表1檢測(cè)PRRSV的多重?zé)晒舛縍T-PCR所用引物和探針序列
【權(quán)利要求】
1.一種檢測(cè)PRRSV的多重?zé)晒舛縍T-PCR方法，該方法利用AM-PRRSV引物對(duì)、TJM-PRRSV 引物對(duì)、AM-V-PRRSV-P 探針、AM-C-PRRSV-P 探針、TJM-PRRSV-P 探針對(duì)陽(yáng)性對(duì)照樣品、檢測(cè)樣品進(jìn)行熒光定量RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后收集熒光信號(hào)，其特征在于，所述的TJM-PRRSV引物對(duì)其上游引物核苷酸序列為5’ - CAACCCTGCACCTGTGTCAT -3’，下游引物核苷酸序列為5’ - TTCTCCCTTGGAGGGTGCC -3’ ；所述的TJM-PRRSV-P探針為5’ -F-AGCTCCCTGGGTTCAGTGGCC -Q-3’，其中F為報(bào)告熒光基團(tuán)，Q為淬滅熒光基團(tuán)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)PRRSV的多重?zé)晒舛縍T-PCR方法，其特征在于，所述的AM-PRRSV引物對(duì)的上游引物核苷酸序列為5’- GAGTGGGTCGGCTCCAGTTC _3’，下游引物核苷酸序列為 5’- GCCTCATATTCCGTCTGTGA -3’ ；所述的 AM-V-PRRSV-P 探針為 5’ -F- TAGAACTGTGACAACAACGCTGA -Q-3’ ；所述的 AM-C-PRRSV-P 探針為 5’ -F- AACTGTGTCTCGACCGGTGAC -Q-3’ ；其中F為報(bào)告熒光基團(tuán)，Q為淬滅熒光基團(tuán)。
3.根據(jù)權(quán)利要求f2任一項(xiàng)所述的檢測(cè)PRRSV的多重?zé)晒舛縍T-PCR方法，其特征在于，所述的F為FAM、TAMRA、JOE中的任一種；所述的Q為BHQ或MGB。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述檢測(cè)PRRSV的多重?zé)晒舛縍T-PCR方法，其特征在于，所述RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系還包括Premix Ex Taq?試劑、R0X參比染料、模板、滅菌雙蒸水。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述檢測(cè)PRRSV的多重?zé)晒舛縍T-PCR方法，其特征在于，當(dāng)RT-PCR擴(kuò)增體系為陽(yáng)性對(duì)照樣品反應(yīng)時(shí)，所述的模板為p-C-Nsp2質(zhì)粒、p-V-Nsp2質(zhì)粒和P-TJM-F92質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品混合液；當(dāng)RT-PCR擴(kuò)增體系為檢測(cè)樣品反應(yīng)時(shí)，所述的模板為從疑似PRRSV感染的動(dòng)物組織或血清抽提的總RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA。
6.根據(jù)權(quán)利要求4飛任一項(xiàng)所述的檢測(cè)PRRSV的多重?zé)晒舛縍T-PCR方法，其特征在于，所述p_C-Nsp2質(zhì)粒為含有美洲型經(jīng)典毒株VR-2332株Nsp2基因的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒；所述P-V-Nsp2質(zhì)粒為含有美洲型變`異毒株JXA1株Nsp2基因的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒；所述p_TJM_F92質(zhì)粒為含有高致病性PRRS活疫苗TJM-F92株Nsp2基因的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述檢測(cè)PRRSV的多重?zé)晒舛縍T-PCR方法，其特征在于，所述的RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為95°C 2min —95°C 10s — 54°C 30s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，同時(shí)收集突光信號(hào)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述檢測(cè)PRRSV的多重?zé)晒舛縍T-PCR方法，其特征在于，所述的 RT-PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系包括:Premix Ex Taq?l(Tl2.5ul, 25pmol/^L AM-PRRSV 上游引物 0.2~0.4ul，25pmol/^L AM-PRRSV 下游引物 0.2~0.4 ul，25pmol/^L AM-V-PRRSV-P 探針 0.15~0.25ul，25pmol/^L AM-C-PRRSV-P 探針 0.2~0.4ul，25pmol/^L TJM-PRRSV 上游引物 0.8~1.2ul，25pmol/^L TJM-PRRSV 下游引物 0.8~1.2ul，25pmol/^L TJM-PRRSV-P 探針0.5~0.7ul, R0X 參比染料 0.4~0.5ul，模板 1.0~2.0ul，雙蒸水 2.0~8.25ul。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述檢測(cè)PRRSV的多重?zé)晒舛縍T-PCR方法，其特征在于，所述的 RT-PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系包括:Premix Ex Taq?12.5ul, 25pmol/^L AM-PRRSV 上游引物 0.4ul，25pmol/^L AM-PRRSV 下游引物 0.4 ul，25pmol/^L AM-V-PRRSV-P 探針 0.25ul,25pmol/^L AM-C-PRRSV-P 探針 0.4ul，25pmol/^L TJM-PRRSV 上游引物 1.2ul，25pmol/^LTJM-PRRSV 下游引物 1.2ul，25pmol/^L TJM-PRRSV-P 探針 0.7ul, ROX 參比染料 0.5ul，模板 2.0ul，雙蒸水 5.45ul。
10.一種權(quán)利要求1、任一項(xiàng)所述檢測(cè)PRRSV的多重?zé)晒舛縍T-PCR方法的應(yīng)用，其特征在于，檢測(cè)PRRSV的熒光定量RT-PCR方法用于快速檢測(cè)并區(qū)分 PRRSV美洲型經(jīng)典毒株、PRRSV美洲型變異毒株、高致病性PRRS活疫苗TJM-F92株。
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK103725793SQ201310424225
【公開(kāi)日】2014年4月16日 申請(qǐng)日期:2013年9月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月17日
【發(fā)明者】施開(kāi)創(chuàng), 莫?jiǎng)偬m, 胡杰, 鄒聯(lián)斌, 張步嫻, 屈素潔, 陸文俊, 粟艷瓊, 蘇凱, 李軍 申請(qǐng)人:廣西壯族自治區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心