一種生物敏感芯片及其制備方法和用途
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域，具體涉及一種生物敏感芯片及其制備方法和用途。本發(fā)明所要解決的問題是提供一種生物敏感芯片，包括銀納米芯片、固定在銀納米芯片上的11-巰基十一烷酸以及與11-巰基十一烷酸連接的抗體。本發(fā)明還提供了上述生物敏感芯片的制備方法，包括以下步驟：在銀納米芯片上固定11-巰基十一烷酸，活化11-巰基十一烷酸后與抗體連接。本發(fā)明還提供了上述生物敏感芯片的用途，利用此生物敏感芯片上的抗體通過抗體抗原特異性反應(yīng)來檢測(cè)目標(biāo)抗原蛋白。
【專利說明】一種生物敏感芯片及其制備方法和用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域，具體涉及一種生物敏感芯片及其制備方法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002]成功制備生物敏感芯片是實(shí)現(xiàn)生物傳感器特異檢測(cè)目標(biāo)物質(zhì)的關(guān)鍵步驟。由于生物反應(yīng)中抗體對(duì)目標(biāo)抗原有著極高的特異選擇性，抗體分子常被固定在各種各樣的傳感載體表面用于免疫檢測(cè)(Phillips TM, Queen WD, More NS, Thompson AM.Protein Acoated glass beads universal support medium for high-performance immunoaffinitychromatography.Journal of Chromatography, 1985,327:213-219)。物理吸附是一種可將抗體分子固定在載體表面的傳統(tǒng)技術(shù)，但由于抗體分子對(duì)溶液pH變化、溫度、離子強(qiáng)度和基底材料較為敏感，易從載體表面脫落，使用壽命較短。并有研究發(fā)現(xiàn)直接吸附固定在載體表面上的抗體分子的生物活性通常有所降低，可能是由于直接固定在載體表面上的抗體分子的空間構(gòu)象改變，空間位阻增大，不利于抗體抗原自由結(jié)合的緣故(Anderson GP, JacobyMA, Ligler FS, King KD.Effectiveness of protein A for antibody immobilizationfor a fiber optic biosensor.Biosensors&Bioelectronics, 1997，12(4):329-336),另一個(gè)原因可能是抗體分子的功能域在固體表面上趨向的隨意性，由于物理吸附的隨意性，一些抗體分子的功能域被掩蓋，失去同抗原分子結(jié)合的能力。而共價(jià)鍵合法則可使抗體活性分子通過共價(jià)鍵與不溶性載體結(jié)合而固定，此種方法的特點(diǎn)是結(jié)合牢固，抗體分子不易脫落，使用壽命長(zhǎng)；同時(shí)可實(shí)現(xiàn)抗體分子定向固定，有效改善抗體與抗原間的結(jié)合，從而克服物理吸附方法的缺點(diǎn)。針對(duì)不同分析物，常用的共價(jià)結(jié)合方法也有所不同，目前常見的有自組裝、鏈霉素-親和素等固定技術(shù)。如Dutra等(Dutra R F，Kubota L T.Clin.Chim.Acta, 2007, 376 (I?2): 114?120)采用鏈親和素自組裝膜的方法在納米芯片表面偶聯(lián)修飾標(biāo)記有親和素的抗肌鈣蛋白T的抗體，隨后利用修飾后的芯片連續(xù)檢測(cè)樣本溶液中該蛋白，其檢出限可達(dá)到0.01 μ g/L。心肌肌鈣蛋白T(TnT)是心肌損傷的高特異性和高靈敏度的標(biāo)志物，利用鏈霉素-親和素共價(jià)固定技術(shù)可快速高靈敏檢測(cè)人體中的該蛋白，在臨床診斷領(lǐng)域中具有可觀的應(yīng)用前景。但此種檢測(cè)方法需要對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行標(biāo)記才能實(shí)現(xiàn)特異檢測(cè)，在臨床檢測(cè)前先要進(jìn)行目標(biāo)蛋白標(biāo)記，增加了檢測(cè)費(fèi)用和步驟，因此發(fā)展快速高特異且免標(biāo)記的生物敏感芯片技術(shù)勢(shì)在必行。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明解決的第一個(gè)技術(shù)問題是提供一種生物敏感芯片。本發(fā)明的生物敏感芯片包括:銀納米芯片、固定在銀納米芯片上的11-巰基十一烷酸以及與11-巰基十一烷酸連接的抗體。
[0004]其中，上述生物敏感芯片中，所述的與11-巰基十一烷酸連接的抗體為:抗白蛋白單克隆抗體、抗SCCA單克隆抗體或抗HE4單克隆抗體。
[0005]本發(fā)明解決的第二個(gè)技術(shù)問題是提供一種上述生物敏感芯片的制備方法。該方法包括以下步驟:
[0006]a、在15~25°C下將銀納米芯片浸泡于0.1~巰基十一烷酸無水乙醇溶液中6~24h，分別用無水乙醇、超純水清洗，氮?dú)獯蹈桑?br> [0007]b、在15~25°C下將步驟a所得的芯片浸泡在7.5~150mM EDC.HCl和1.5~30mM NHS等體積混合水溶液中活化表面羧基I~10小時(shí)，用超純水清洗，氮?dú)獯蹈桑?br> [0008]C、在步驟b所得的芯片表面滴加濃度為I μ g/ml~30 μ g/ml、體積為I μ I~30 μ I的單克隆抗體，在I~10°C冰箱中冷藏6~14h，PBS清洗，氮?dú)獯蹈?。[0009]優(yōu)選的，上述生物敏感芯片制備方法，步驟a中，溫度為20°C，11-巰基十一烷酸的濃度為ImM，浸泡時(shí)間為12h。
[0010]優(yōu)選的，上述生物敏感芯片制備方法，步驟b中，溫度為20°C，EDC.HCl的濃度為75mM, NHS的濃度為15mM，表面活化羧基2h。
[0011]優(yōu)選的，上述生物敏感芯片制備方法，步驟c中，冷藏溫度為4°C，冷藏時(shí)間為10h。
[0012]優(yōu)選的，上述生物敏感芯片制備方法，步驟c中，采用pH=7.4,0.0lM的PBS (磷酸鹽緩沖溶液)抗體稀釋液來稀釋單克隆抗體和清洗芯片；滴加抗SCCA單克隆抗體濃度為5 μ g/ml、抗白蛋白單克隆抗體濃度為10μ g/ml或抗HE4單克隆抗體濃度為10 μ g/ml,體積均為10 μ 10
[0013]具體的，上述生物敏感芯片制備方法，在制備的過程中，分別對(duì)銀納米芯片以及a、b和c每步步驟所制備出的芯片進(jìn)行紫外最大吸收波長(zhǎng)檢測(cè)。
[0014]本發(fā)明解決的第三個(gè)技術(shù)問題是提供一種上述生物敏感芯片的用途。該用途為:可以用來對(duì)抗原標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)方法包括以下步驟:在上述所得生物敏感芯片表面滴加目標(biāo)蛋白，33~39°C水浴20~120min，超純水清洗，氮?dú)獯蹈?，檢測(cè)紫外最大吸收波長(zhǎng)。
[0015]優(yōu)選的，上述生物敏感芯片的用途中，水浴溫度為37°C，水浴時(shí)間為60min。
[0016]本發(fā)明通過上述各個(gè)步驟所獲得的紫外最大吸收波長(zhǎng)，進(jìn)行比較，根據(jù)紫外最大吸收波長(zhǎng)的變化程度，得出是否能夠檢測(cè)抗原標(biāo)準(zhǔn)品。
[0017]本發(fā)明所述的氮?dú)獯蹈?，意為在有氮?dú)獾臈l件下將所制備的芯片處理干，而本發(fā)明此步驟的實(shí)現(xiàn)不僅僅只限于將芯片用氮?dú)獯蹈伞?br> [0018]本發(fā)明采用氨基偶聯(lián)共價(jià)鍵合法使生物活性分子通過共價(jià)鍵與不溶性納米載體結(jié)合固定，具有以下優(yōu)點(diǎn):a、共價(jià)固定生物分子(特異的單克隆抗體)，使納米芯片可用來檢測(cè)不同的特異生物蛋白山、可通過增加表面固定生物分子的結(jié)合力而提高納米敏感芯片的靈敏度；c、同時(shí)使納米芯片表面的非特異性結(jié)合強(qiáng)度降低；d、此方法抗體生物分子結(jié)合牢固，不易脫落，可使生物敏感芯片實(shí)用壽命長(zhǎng)，可克服普通吸附法抗體分子易從載體表面脫落，使用壽命較短的缺點(diǎn)；同時(shí)可克服直接吸附法會(huì)影響降低抗體分子的生物活性的缺點(diǎn)。
[0019]本發(fā)明利用氨基偶聯(lián)共價(jià)鍵合法制備的生物敏感芯片與目前生物蛋白常用檢測(cè)方法如放射免疫分析法、酶聯(lián)免疫分析法(傳統(tǒng)生化分析方法)等相比，它可將傳感芯片的靈敏性和生物反應(yīng)的特異性結(jié)合在一起，其優(yōu)點(diǎn)有:可原位快速檢測(cè)醫(yī)學(xué)生物蛋白分子在人體組織液(血液、尿液、腦脊液等)的含量，準(zhǔn)備好的生物敏感芯片檢測(cè)目標(biāo)蛋白時(shí)間可控制在I小時(shí)內(nèi)；整個(gè)檢測(cè)過程無需任何標(biāo)記；檢測(cè)靈敏度高，可達(dá)Pg級(jí)；特異性好，分辨率高，非特異結(jié)合性??；成本相對(duì)較低；儀器微小化，便攜性好，因而擁有廣闊的應(yīng)用前景。并可用于生物實(shí)驗(yàn)室研究許多生物化學(xué)成份相互間的作用，也可用于連續(xù)監(jiān)測(cè)吸附和解吸及分子的締合和解離過程。
[0020]本發(fā)明制備的生物敏感芯片基于貴金屬納米粒子對(duì)周圍介質(zhì)環(huán)境變化敏感的基本原理，可將生物分子吸附引發(fā)的金屬納米顆粒外界介質(zhì)折射率的改變轉(zhuǎn)化為可測(cè)量的峰值吸收波長(zhǎng)的有規(guī)律的移動(dòng)以實(shí)現(xiàn)對(duì)傳感器表面樣品的檢測(cè)。它是一種靈敏、特異、簡(jiǎn)單、快速且可有望精確定量和實(shí)時(shí)檢測(cè)的替代新方法，在臨床實(shí)驗(yàn)診斷中具有重要的實(shí)用價(jià)值。它是納米技術(shù)與生物技術(shù)交叉滲透形成的新技術(shù)，是納米技術(shù)的重要組成部分，也是將來生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的一個(gè)重要發(fā)展方向。納米材料的介入為免疫分析的發(fā)展提供了無窮的想象空間，由于其量子尺寸效應(yīng)和表面效應(yīng)，可把免疫分析方法的性能提高到新的水平，使其不僅檢測(cè)的速度快、精度高、可靠性好，還可實(shí)現(xiàn)多功能化和選擇檢測(cè)。采用局域表面等離子體共振效應(yīng)傳感技術(shù)，將其用于人體內(nèi)腫瘤標(biāo)志物(CA125、CEA、AFP、SCCAg)的聯(lián)合檢測(cè)，可實(shí)現(xiàn)將生物傳感與化學(xué)生物學(xué)、電磁物理學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)相結(jié)合，研制新一代免疫傳感器，方法較傳統(tǒng)的ELISA和放射性免疫分析(RIA)簡(jiǎn)單、快速，可望作為一種臨床診斷分析的工具。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1:銀納米芯片；
[0022]圖2:銀納米芯片表面自組裝11-巰基十一烷酸單分子層；
[0023]圖3:孵育EDC.HCl和NHS，活化表面羧基；
[0024]圖4:固定單克隆抗體，成功制備生物敏感芯片；
[0025]圖5:不同濃度的抗原標(biāo)準(zhǔn)品與生物敏感芯片進(jìn)行免疫反應(yīng)；
[0026]圖6:銀納米芯片俯視 圖。
【具體實(shí)施方式】
[0027]一種生物敏感芯片，包括:銀納米芯片、固定在銀納米芯片上的11-巰基十一烷酸以及與11-巰基十一烷酸連接的抗體。
[0028]上述生物敏感芯片的制備方法及對(duì)抗原的檢測(cè)方法，通過以下步驟實(shí)現(xiàn):
[0029]a、首先檢測(cè)銀納米芯片的紫外最大吸收波長(zhǎng)；
[0030]b、在15~25°C下將銀納米芯片浸泡于0.1~巰基^ 燒酸無水乙醇溶液中6~24小時(shí)，分別用無水乙醇、超純水清洗，氮?dú)獯蹈珊髾z測(cè)紫外最大吸收波長(zhǎng)；
[0031]C、在15~25°C下將步驟b所得的芯片浸泡在7.5~150mM EDC.HCl和1.5~30mMNHS等體積混合水溶液中活化表面羧基I~10小時(shí)，用超純水清洗，氮?dú)獯蹈珊髾z測(cè)紫外最大吸收波長(zhǎng)；
[0032]d、在步驟c所得的芯片表面滴加濃度為I μ g/ml~30μ g/ml、體積為1μ I~30 μ I的單克隆抗體，在I~10°C冰箱中冷藏6~14h，pH=7.4，濃度為0.0lM的PBS清洗，氮?dú)獯蹈蓹z測(cè)紫外最大吸收波長(zhǎng)；
[0033]e、在上述步驟d所得的生物敏感芯片表面滴加目標(biāo)蛋白，33~39°C水浴20~120min,超純水清洗，氮?dú)獯蹈蓹z測(cè)紫外最大吸收波長(zhǎng)。
[0034]本發(fā)明通過上述各個(gè)步驟所獲得的紫外最大吸收波長(zhǎng)，進(jìn)行比較，根據(jù)紫外最大吸收波長(zhǎng)的變化程度，得出是否能夠檢測(cè)抗原標(biāo)準(zhǔn)品。
[0035]由于局域表面等離子體共振效應(yīng)(Localized Surface Plasmon Resonance,LSPR)是當(dāng)單個(gè)金屬納米粒子或不連續(xù)的金屬納米結(jié)構(gòu)被入射光照射時(shí)，入射光子頻率與金屬表面自由電子的集體振蕩頻率匹配發(fā)生共振產(chǎn)生的一種特殊光學(xué)現(xiàn)象。基于貴金屬納米的LSPR生物傳感器的性能主要由其折射率靈敏度(RIS)和消光光譜的半高全寬(FWHM)決定。其中RIS值代表周圍環(huán)境單個(gè)折射率的變化對(duì)應(yīng)的光譜峰值位置的移動(dòng)量，單位為nm/RIU。為了納米傳感器的傳感性能，總是盡可能希望擁有更高的折射率靈敏度及更窄的譜線寬度。
[0036]光在金屬納米結(jié)構(gòu)中的行為可用麥克斯韋方程配合適當(dāng)邊界條件進(jìn)行較精確描述。米氏(Mie)理論與甘氏(Gans)理論能精確描述單個(gè)球形和橢球形金屬納米顆粒的消光特性，但對(duì)實(shí)際制造的金屬納米粒子而言，其消光特性還與顆粒間的電場(chǎng)耦合等因素有關(guān)。考慮到時(shí)域有限差分法(FDTD)為最簡(jiǎn)單、直觀、精確的電磁學(xué)計(jì)算方法，采用其來計(jì)算與實(shí)際制造相貼近的金屬納米粒子的消光特性，推知某種金屬納米結(jié)構(gòu)折射率靈敏的大小僅僅取決于其峰值波長(zhǎng)。并推知金屬納米結(jié)構(gòu)的形狀參數(shù)L是影響其光學(xué)特性的主要因素，但對(duì)于復(fù)雜形狀，目前還無法求得精確的解析解。考慮到圓盤、正方柱體以及三角柱體結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，且為理論分析及實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用最多的三種金屬納米結(jié)構(gòu)。因此我們對(duì)不同寬高比下的上述三種形狀納米結(jié)構(gòu)的消光特性進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相同寬高比下，三角柱形納米粒子峰值波長(zhǎng)最大，提示其折射靈敏度相對(duì)較高，且三種形狀的金屬納米結(jié)構(gòu)形狀參數(shù)L與寬高比的關(guān)系擬合曲線也證實(shí)了上述發(fā)現(xiàn)。
[0037]本發(fā)明所采用的銀納米芯片的制作方法如下:
[0038](I)基板預(yù)處理是實(shí)現(xiàn)納米球自組裝的重要步驟。首先選取尺寸25mmX2mm的精拋光娃酸鹽玻璃片作基板，在玻璃片表面用真空鍍層機(jī)沉積一層5nm鉻層,把制作好的基板放入濃硫酸和雙氧水配成的洗液(H2SO4: 30%H202=3: I)中加熱至80°C浸泡60分鐘,去除雜質(zhì)。然后用超純水反復(fù)沖洗，再放入氨水、雙氧水及水配成的溶液(NH3: H2O2:H2O=I: I: 5)中超聲波處理60分鐘，取出后用超純水反復(fù)沖洗，放入二次蒸餾水中備用。
[0039](2)納米球自組裝定位模板處理好后，立即進(jìn)行納米球自組裝。根據(jù)模擬結(jié)果，選取直徑300-500nm之間，濃度為1%至3%的單分散聚苯乙烯納米球水溶膠進(jìn)行自組裝，采用膠態(tài)晶體法在處理好的基板上制作出特殊的規(guī)則結(jié)構(gòu)，并對(duì)聚苯乙烯納米球自組裝層進(jìn)行刻蝕。然后利用刻蝕后的聚苯乙烯納米球排列結(jié)構(gòu)作模板，通過真空鍍層機(jī)在其表面沉積一層幾十納米厚的金屬層，在球與球間隙處填充金屬，通過相關(guān)工藝，去除聚苯乙烯納米球自組裝層，僅留下球與球間隙處的金屬，得到陣列化的金屬納米陣列結(jié)構(gòu)。
[0040]本發(fā)明雖采用精拋光硅酸鹽玻璃片作基板來制備銀納米芯片，但是都是采用基板對(duì)紫外可見光不吸收、不反射，對(duì)所測(cè)的物質(zhì)不產(chǎn)生干擾的原理，那么，本發(fā)明也可以采用別的對(duì)紫外可見光不吸收、不反射的其他材質(zhì)，比如石英等。
[0041]貴金屬(如銀，金，銅)納米粒子具有很強(qiáng)的局域表面等離子體共振效應(yīng)，在紫外-可見光波段展現(xiàn)出很強(qiáng)的光譜吸收，且吸收光譜峰值對(duì)納米粒子周圍電介質(zhì)環(huán)境變化非常敏感。它可將分子反應(yīng)吸附引發(fā)的局域表面折射率微小變化轉(zhuǎn)換成可測(cè)量波長(zhǎng)移動(dòng)響應(yīng)，而實(shí)現(xiàn)對(duì)其表面吸附分子的有效檢測(cè)。
[0042]本發(fā)明采用此銀納米芯片，但是由于貴金屬都有局域表面等離子體共振效應(yīng)，那么，也不排除可以采用金、銅、鉬等其它金屬的可能。
[0043]由于11-巰基十一烷酸分子結(jié)構(gòu)特殊，一個(gè)末端具有活性巰基，易于和銀作用，另一端具有活性羧基，易于與氨基發(fā)生反應(yīng)，所以本發(fā)明采用11-巰基十一烷酸氨基偶聯(lián)來制備生物敏感層。11-巰基十一烷酸氨基偶聯(lián)成層法是常用的共價(jià)鍵固定法，多用于酶層和免疫分子層的制作，可通過11-巰基十一烷酸分子末端的巰基與貴金屬納米粒子形成離子鍵，從而在納米表面形成11-巰基i 燒酸的巰基自組裝單分子層(self-assembledmonolayer, SAM),并通過11_巰基^ 燒酸分子另一末端的羧基與抗體分子末端的氨基形成酰胺鍵(在EDC.HCl等催化劑作用下)，從而使抗體間接固定在金屬納米表面，具有簡(jiǎn)單、結(jié)合牢固、耐用等優(yōu)點(diǎn)。
[0044]本發(fā)明在實(shí)驗(yàn)的過程中，主要是通過實(shí)驗(yàn)中對(duì)每一步反應(yīng)時(shí)間、濃度范圍進(jìn)行固定其余變量，逐一變量進(jìn)行梯度摸索，觀察抗體固定后的△ Xmax的紅移值來確定，紅移越明顯，說明此條件變量值越優(yōu)。
[0045]本發(fā)明通過采用反復(fù)O 10次)測(cè)試抗體抗原稀釋液后的LSPR消光光譜變化，得出Λ λ max標(biāo)準(zhǔn)偏差作為該光譜儀器檢測(cè)噪音值，取3倍噪音值作為最小有效響應(yīng)信號(hào)，本發(fā)明發(fā)明人通過大量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)及驗(yàn)證，Δ Amax ^ 5nm (消光峰紅移大于3倍噪音值)即為有效，其準(zhǔn)確率可達(dá)99%。
[0046]紫外-可見光光譜測(cè)試平臺(tái)可對(duì)微納金屬?gòu)?fù)合結(jié)構(gòu)納米粒子陣列進(jìn)行光譜分析，研究不同形狀、不同結(jié)構(gòu)參數(shù)的微納金屬?gòu)?fù)合結(jié)構(gòu)納米粒子陣列的局域表面等離子體共振(LSPR)特征峰值。此測(cè)試平臺(tái)的硬件主要分為鹵鎢燈和光譜儀兩大部分，鹵鎢燈輸出光波長(zhǎng)范圍從220nm到1020nm，經(jīng)過準(zhǔn)直后變?yōu)槠叫泄馐?，光譜儀對(duì)入射光分光處理后可獲得結(jié)構(gòu)的吸收、透射光譜。
[0047]本發(fā)明制備的生物敏感芯片基于貴金屬納米粒子對(duì)周圍介質(zhì)環(huán)境變化敏感的基本原理，可將生物分子吸附引發(fā)的金屬納米顆粒外界介質(zhì)折射率的改變轉(zhuǎn)化為可測(cè)量的LSPR峰值吸收波長(zhǎng)的有規(guī)律的 移動(dòng)以實(shí)現(xiàn)對(duì)傳感器表面樣品的檢測(cè)。它是一種靈敏、特異、簡(jiǎn)單、快速且可有望精確定量和實(shí)時(shí)檢測(cè)的替代新方法，在臨床實(shí)驗(yàn)診斷中具有重要的實(shí)用價(jià)值。它是納米技術(shù)與生物技術(shù)交叉滲透形成的新技術(shù)，是納米技術(shù)的重要組成部分，也是將來生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的一個(gè)重要發(fā)展方向。納米材料的介入為免疫分析的發(fā)展提供了無窮的想象空間，由于其量子尺寸效應(yīng)和表面效應(yīng)，可把免疫分析方法的性能提高到新的水平，使其不僅檢測(cè)的速度快、精度高、可靠性好，還可實(shí)現(xiàn)多功能化和選擇檢測(cè)。采用LSPR傳感技術(shù)，將其用于人體內(nèi)腫瘤標(biāo)志物(CA125、CEA、AFP、SCCAg)的聯(lián)合檢測(cè)，可實(shí)現(xiàn)將生物傳感與化學(xué)生物學(xué)、電磁物理學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)相結(jié)合，研制新一代免疫傳感器，方法較傳統(tǒng)的ELISA和放射性免疫分析(RIA)簡(jiǎn)單、快速，可望作為一種臨床診斷分析的工具。
[0048]本發(fā)明中PBS為磷酸鹽緩沖溶液，按常規(guī)方法配制；NHS為N-羥基琥珀酰亞胺；EDC.HCl為1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽。
[0049]實(shí)施例所采用的紫外-可見光譜儀購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院光電技術(shù)研究所光學(xué)元件廠，構(gòu)造如下:宏觀紫外-可見消光譜的測(cè)量是利用帶有探測(cè)器的Ocean Optics USB4000光纖光譜儀；光源為DH-2000UV-VIS-NIR光源，為非偏振光，所有的光譜測(cè)量都是在標(biāo)準(zhǔn)的幾何傳輸路徑進(jìn)行的；探測(cè)光纖的通光孔徑為0.6mm。
[0050]實(shí)施例所采用的玻璃基板為雙面精拋光K9玻璃基底，規(guī)格尺寸:20mmX IOmmX 2mm,購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院光電技術(shù)研究所光學(xué)元件廠，再通過上述所給的方法，制備銀納米芯片。
[0051]實(shí)施例中所采用的抗白蛋白單克隆抗體，購(gòu)自Novus公司，批號(hào)NB500-417 ;抗SCCA單克隆抗體，購(gòu)自Santa Cruz公司，批號(hào)TA502325 ;抗HE4單克隆抗體，購(gòu)自Abnova公司，批號(hào) H00010406-M01。
[0052]實(shí)施例1抗白蛋白單克隆抗體生物敏感芯片制備及對(duì)白蛋白的檢測(cè)
[0053]a、首先檢測(cè)銀納米芯片的紫外最大吸收波長(zhǎng)；
[0054]b、20°C下將銀納米芯片浸泡于ImM 11_巰基十一烷酸乙醇溶液12小時(shí)，分別用無水乙醇、超純水清洗，氮?dú)獯蹈珊髾z測(cè)紫外最大吸收波長(zhǎng)；
[0055]c、20°C下將銀納米芯片浸泡在75mM EDC.HCl、15mM NHS等體積混合水溶液中活化表面羧基2小時(shí)，用超純水清洗，氮?dú)獯蹈珊髾z測(cè)紫外最大吸收波長(zhǎng)；
[0056]d、銀納米芯片表面滴加10 μ g/ml抗白蛋白單克隆抗體溶液10 μ 1，4°C冰箱過夜10小時(shí)，pH=7.4、濃度為0.0lM的PBS清洗，氮?dú)獯蹈蓹z測(cè)紫外最大吸收波長(zhǎng)；
[0057]e、銀納米芯片表面滴加lng/ml白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液10 μ I, 37°C水浴60min,超純水清洗，氮?dú)獯蹈蓹z測(cè)紫外最大吸收波長(zhǎng)。
[0058]表1抗白蛋白單克隆抗體生物敏感芯片制備及檢測(cè)結(jié)果
[0059]
【權(quán)利要求】
1.一種生物敏感芯片，其特征在于:包括有銀納米芯片、固定在銀納米芯片上的11-巰基十一烷酸以及與11-巰基十一烷酸連接的抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物敏感芯片，其特征在于:所述的與11-巰基十一烷酸連接的抗體為:抗白蛋白單克隆抗體、抗SCCA單克隆抗體或抗HE4單克隆抗體。
3.權(quán)利要求1或2所述的生物敏感芯片的制備方法，其特征在于:包括以下步驟: a、在15~25°C下將銀納米芯片浸泡于0.1~5mM 11-巰基十一烷酸無水乙醇溶液中6~24h，分別用無水乙醇、超純水清洗，氮?dú)獯蹈桑? b、在15~25°C下將步驟a所得的芯片浸泡在7.5~150mM EDC.HCl和1.5~30mMNHS等體積混合水溶液中活化表面羧基I~10小時(shí)，用超純水清洗，氮?dú)獯蹈桑? C、在步驟b所得的芯片表面滴加濃度為I μ g/ml~30 μ g/ml、體積為I μ I~30 μ I的單克隆抗體，在I~10°C冰箱中冷藏6~14h，PBS清洗，氮?dú)獯蹈伞?br> 4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生物敏感芯片的制備方法，其特征在于:步驟a中，溫度為2(rC，ll-巰基十一烷酸的濃度為ImM，浸泡時(shí)間為12h。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生物敏感芯片的制備方法，其特征在于:步驟b中，溫度為20°C, EDC.HCl的濃度為75mM，NHS的濃度為15mM，表面活化羧基2h。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生物敏感芯片的制備方法，其特征在于:步驟c中，冷藏溫度為4°C，冷藏時(shí)間為10h。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生物敏感芯片的制備方法，其特征在于:步驟c中，采用pH=7.4,0.0lM的PBS來稀釋單克隆抗體和清洗芯片；滴加抗SCCA單克隆抗體濃度為5 μ g/ml、抗白蛋白單克隆抗體濃度為10 μ g/ml或抗HE4單克隆抗體濃度為10 μ g/ml，體積均為10μ 10
8.根據(jù)權(quán)利要求3~7所述的生物敏感芯片制備方法，其特征在于:在制備的過程中，分別對(duì)銀納米芯片以及a、b和c每步步驟所制備出的芯片進(jìn)行紫外最大吸收波長(zhǎng)檢測(cè)。
9.權(quán)利要求1或2所述的生物敏感芯片的用途，其特征在于:可以用來對(duì)抗原標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)方法包括以下步驟:在權(quán)利要求3~8所制備的生物敏感芯片表面滴加目標(biāo)蛋白，33~39°C水浴20~120min，超純水清洗，氮?dú)獯蹈?，檢測(cè)紫外最大吸收波長(zhǎng)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的生物敏感芯片的用途，其特征在于:水浴溫度為37°C，水浴時(shí)間為60min。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK103472237SQ201310428425
【公開日】2013年12月25日 申請(qǐng)日期:2013年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月18日
【發(fā)明者】郄明蓉, 丁一, 段瑞岐, 李林, 袁嘉玲, 程矗, 趙倩穎 申請(qǐng)人:四川大學(xué)華西第二醫(yī)院