一種血液和尿液中亞硝酸鹽的高靈敏快速檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種血液、尿液中亞硝酸鹽的快速檢測(cè)方法。利用亞硝酸鹽與Griess試劑發(fā)生重氮化偶合反應(yīng)，形成偶氮化合物，用非離子表面活性劑包括脂肪醇聚氧乙烯醚AEO系列進(jìn)行濁點(diǎn)萃取，具有操作條件溫和、濁點(diǎn)溫度低、分相時(shí)間短、萃取效率高等特點(diǎn)。體系中亞硝酸鹽檢測(cè)限可達(dá)0.005μg/mL。該發(fā)明具有簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高、可現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等特點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】一種血液和尿液中亞硝酸鹽的高靈敏快速檢測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于體內(nèi)藥物檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種血液和尿液中亞硝酸鹽的高靈 敏快速檢測(cè)方法。

【背景技術(shù)】
[0002] -氧化氮（N0)是一種帶有不成對(duì)電子的氣體，化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，半衰期很短，僅有 幾秒鐘，易形成亞硝酸鹽和硝酸鹽。N0是目前所知的最強(qiáng)的血管舒張因子和收縮因子，它 能作為介質(zhì)、信使、遞質(zhì)或細(xì)胞功能調(diào)節(jié)因子參與集體許多生理或病理過程。N0是調(diào)節(jié)心 肌正常生理活動(dòng)的重要分子，具有使血管擴(kuò)張，抑制血小板聚集與黏附，抗炎癥，抑制細(xì)胞 凋亡、增生等作用。人類有60萬(wàn)億細(xì)胞，一氧化氮在人體內(nèi)扮演著細(xì)胞間的傳導(dǎo)因子的角 色，也是重要的"信號(hào)分子"。作為相對(duì)穩(wěn)定的N0代謝產(chǎn)物，亞硝酸鹽（NCV)在最近10年成 為世界醫(yī)學(xué)界的熱點(diǎn)，通過測(cè)定尿液、血液中的NCV的含量來(lái)反映體內(nèi)N0含量和作為反應(yīng) 多項(xiàng)身體機(jī)能的重要指標(biāo)或疾病診斷。
[0003] 目前亞硝酸鹽檢測(cè)最通用的方法是食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB5009. 33- 2010,該標(biāo)準(zhǔn) 第一法中采用離子色譜法檢測(cè)各類食品中的亞硝酸鹽和硝酸鹽，第二法為分光光度法。同 時(shí)，亞硝酸鹽的測(cè)定還有熒光光度法、高效液相色譜法等。食品中亞硝酸鹽一是含量相對(duì) 高，二是基本沒有鹽的干擾，離子色譜法及光度法都是較適合的檢測(cè)方法，而體內(nèi)血液或尿 液中亞硝酸鹽卻含量低，有較高鹽含量，基體干擾嚴(yán)重。目前檢測(cè)通常用Griess檢測(cè)試劑 盒，由于受到檢測(cè)靈敏度的限制及基體干擾，通常很難檢測(cè)出亞硝酸鹽，其靈敏度通常只能 達(dá)到lKg/mg。研究小組之前已利用高效液相色譜（HPLC)對(duì)血液尿液及組織中硝酸鹽與亞 硝酸鹽檢測(cè)進(jìn)行了研究，取得了不錯(cuò)的效果，申請(qǐng)了發(fā)明專利（201310129291.X)，同時(shí)還將 亞硝酸鹽與Griess試劑反應(yīng)，經(jīng)濁點(diǎn)萃?。–PE)進(jìn)行分離、富集，直接目視比色，進(jìn)行血液 尿液中亞硝酸鹽簡(jiǎn)單快速檢測(cè)，申請(qǐng)了發(fā)明專利（201310274145. 6)。進(jìn)一步更加深入研究 發(fā)現(xiàn)，用非離子表面活性劑AE0系列作濁點(diǎn)萃取劑，與Triton系列及其他非離子表面活性 劑相比，該表面活性劑能達(dá)到相似或更高的萃取效率，由于不含芳環(huán)，更加環(huán)保、環(huán)境中易 降解，同時(shí)本發(fā)明通過研究發(fā)現(xiàn)幾種有機(jī)醇可以使AE0系列濁點(diǎn)溫度降低，分相時(shí)間更短， 具有檢測(cè)更加快速簡(jiǎn)便、靈敏的特點(diǎn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種簡(jiǎn)單快速、靈敏度、能現(xiàn)場(chǎng)檢 測(cè)、尿液中亞硝酸鹽定性、半定量的方法。
[0005] 本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)。
[0006] 除非另有說(shuō)明，本發(fā)明所采用的百分?jǐn)?shù)均為重量百分?jǐn)?shù)。
[0007]-種血液和尿液中亞硝酸鹽的檢測(cè)方法，包括以下步驟： (1)亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)色階制作：取濃度為5.OPg/mL的N02_標(biāo)準(zhǔn)溶液0. 005、0. 01、0. 05、 0. 10、0. 30、0. 70、1.OmL于刻度離心管中，用蒸餾水稀釋至5mL，加入GriessA試劑250ML，混 合均勻；lmin后加入GriessB試劑250ML，混合均勻，加入非離子表面活性劑0.lmL，降池點(diǎn) 和相分離促進(jìn)劑氯化鈉或硫酸銨〇. 1?〇. 5g或有機(jī)醇0. 05?0. 2mL，潤(rùn)旋混合lmin，離心 分相，在溶液上層出現(xiàn)由淺至深的紅色環(huán)色階溶液； (2)樣品檢測(cè)： 尿液的檢測(cè)：取10mL尿液，加入蛋白沉淀劑硫酸鋅0. 4?1. 0g，活性炭0. 5?1. 0g，混 合均勻，離心脫色、脫蛋白，濾紙過濾除去脫色劑和蛋白沉淀劑；取5mL處理后的尿液，加入 GriessA試劑250ML，混合均勻；lmin后加入GriessB試劑250ML，混合均勻，放置5min后， 加入非離子表面活性劑〇.lmL，降濁點(diǎn)和相分離促進(jìn)劑氯化鈉或硫酸銨0. 1?0. 5g或有機(jī) 醇0. 05?0. 2mL，渦旋混合lmin，離心分相，將溶液上層表面活性劑的顏色與步驟（1)標(biāo)準(zhǔn) 色階比較，判斷其含量； 血液的檢測(cè)：取5mL新鮮血液，放入離心機(jī)中離心，取上清液，加入活性炭0.5?l.Og、 蛋白沉淀劑0.lmol/L氫氧化鈉溶液0. 2mL和硫酸鋅0. 2g，混合均勻，加入乙腈lmL，離心 分離，取上清液2mL于10mL離心管中用蒸饋水定容至5mL,加入GriessA試劑250ML，混 合均勻；lmin后加入GriessB試劑250ML，混合均勻，放置5min,加入非離子表面活性劑 0.lmL，降濁點(diǎn)和相分離促進(jìn)劑氯化鈉或硫酸銨0. 1?0. 5g或有機(jī)醇0. 05?0. 2mL，渦旋混 合lmin，離心分相，將溶液上層表面活性劑的顏色與步驟（1)標(biāo)準(zhǔn)色階比較，判斷其含量； 其中，步驟（1)(2)中所述的GriessA試劑為50mg對(duì)氨基苯磺酸溶于5mL鹽酸（0. 5mol/ L) ;GriessB試劑為4mgN-1-萘乙二胺鹽酸鹽溶于4mL甲醇（50%); 所述非離子表面活性劑包括脂肪醇聚氧乙烯醚AEO-3、AEO-7、AE0-9之一種； 有機(jī)醇包括：正辛醇、正戊醇、正癸醇之一種； 所述的離心條件為離心時(shí)間5?15min，離心速率3000?10000r/min。
[0008] 相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下顯著優(yōu)點(diǎn)： 1、所采用的新型非離子表面活性劑AE0系列濁點(diǎn)（30°C)低，與通用濁點(diǎn)萃取表面活性 劑Triton系列濁點(diǎn)（40°C)或其他非離子表面活性劑相比，濁點(diǎn)明顯降低，操作條件溫和。 與其他傳統(tǒng)表面活性劑在相同條件下進(jìn)行濁點(diǎn)萃取，萃取時(shí)間短、萃取率更高，用目視比色 靈敏度達(dá)到了 〇.〇〇5Mg/mL。
[0009] 2、非離子表面活性劑AE0系列為脂肪醇聚氧乙烯醚，不含芳環(huán)，環(huán)保、易降解，其 價(jià)格低廉。
[0010]

【具體實(shí)施方式】
[0011] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步地說(shuō)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于此。
[0012] 實(shí)施例1 利用本發(fā)明檢測(cè)人體尿液中亞硝酸鹽的含量。
[0013] 1、亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)色階制作：取濃度為5.OPg/mL的N02_標(biāo)準(zhǔn)溶液0. 005、0. 01、 0. 05、0. 10、0. 30、0. 70、1.OmL于刻度離心管中，用蒸餾水稀釋至5mL，加入GriessA試劑 250ML，混合均勻；lmin后加入GriessB試劑250ML，混合均勻，放置5min后，加入非離子表 面活性劑AE0-9 0.lmL，硫酸銨0. 2g，潤(rùn)旋混合lmin，5000r/min離心10min后分相，在溶 液上層出現(xiàn)由淺至深的紅色環(huán)色階溶液； 2、樣品處理及測(cè)定結(jié)果 取10mL尿液于10mL離心管中，加入1.Og活性炭，0. 2g硫酸銨，混合均勻，4000r/ min離心lOmin，濾紙過濾除去活性炭和蛋白沉淀。取5. OmL脫色、脫蛋白后的尿液于10mL 離心管中，加入GriessA試劑250ML，混合均勻。lmin后加入GriessB試劑250ML，混合均勻， 放置5min后，加入非離子表面活性劑AE0-90. lmL，硫酸銨0. 2g，渦旋混合lmin，5000r/ min離心lOmin后分相，上層表面活性劑的色環(huán)與步驟（1)標(biāo)準(zhǔn)色階環(huán)比較，亞硝酸鹽含量 0? 005l^g/mL和0? Oll^g/mL之間。
[0014] 實(shí)施例2 利用本發(fā)明檢測(cè)人體血液中亞硝酸鹽的含量。
[0015] 1.按實(shí)施例1制作亞硝酸鹽的標(biāo)準(zhǔn)色階，非離子表面活性劑為AE0-7,正辛醇 0. 05mL替代硫酸銨。
[0016] 2.樣品處理及測(cè)定結(jié)果 取5 mL新鮮血液，6000r/min離心12min。取上清液于離心管中，加入0. lmol/L氫氧化 鈉溶液〇. 2mL和硫酸鋅0. 2g,混合均勻，加入乙腈lmL，4000r/min離心lOmin分離，取上清 液2mL于10mL離心管中用蒸饋水定容至5mL,加入GriessA試劑250ML，混合均勻，lmin后 加入GriesssB試劑250ML，混合均勻，加入非離子表面活性劑AE0-70. lmL，正辛醇0. 05mL， 潤(rùn)旋混合lmin，5000r/min離心15min后分相，上層表面活性劑的色環(huán)與步驟（1)標(biāo)準(zhǔn)色 階環(huán)比較，亞硝酸鹽含量為0. 30l^g/mL。
[0017] 實(shí)施例3 利用本發(fā)明檢測(cè)人體血液中亞硝酸鹽的含量。
[0018] 1.按實(shí)施例1制作亞硝酸鹽的標(biāo)準(zhǔn)色階，非離子表面活性劑為AE0-3有機(jī)醇為正 戊醇0.lmL。
[0019] 2.樣品處理及測(cè)定結(jié)果 取5mL新鮮血液于離心管中，6000r/min離心8min，取上清液于離心管中，0.lmol/L氫 氧化鈉溶液〇. 2mL和硫酸鋅0. 2g,混合均勻，加入乙腈lmL，4000r/min離心lOmin分離，取 上清液2mL于10mL離心管中用蒸饋水定容至5mL,加入GriessA試劑250ML，混合均勻。 lmin后加入GriessB試劑250ML，混合均勻，放置5min后，加入非離子表面活性劑AE0-3 0.lmL，正戊醇0.lmL，潤(rùn)旋混合lmin，5000r/min離心lOmin后分相，上層表面活性劑的色 環(huán)與步驟（1)標(biāo)準(zhǔn)色階環(huán)比較，亞硝酸鹽含量0.OlKg/mL和0. 05l^g/mL之間。
[0020] 實(shí)施例4 利用本發(fā)明檢測(cè)人體尿液中亞硝酸鹽的含量。
[0021] 1.按實(shí)施例1制作亞硝酸鹽的標(biāo)準(zhǔn)色階，非離子表面活性劑為AE0-9,有機(jī)醇為正 癸醇0.lmL。
[0022] 2、樣品處理及測(cè)定結(jié)果 取10mL尿液于10mL離心管中，加入加入活性炭0. 5g，硫酸鋅0. 5g,混合均勻，5000r/min離心lOmin,用定性濾紙過濾。取5.OmL處理后的尿液于10mL離心管中，加入GriessA 試劑250ML，混合均勻。lmin后加入GriessB試劑250ML，混合均勻，放置5min后，加入非離 子表面活性劑AE0-9 0.lmL，正癸醇0.lmL，潤(rùn)旋混合lmin, 4000r/min離心lOmin分相，上 層表面活性劑的色環(huán)與步驟（1)標(biāo)準(zhǔn)色階環(huán)比較，亞硝酸鹽含量0. 005Mg/mL和0.OlMg/mL 之間。在相同條件下，做了TritonX-114、TMN-6、NP-9、AE0-9濁點(diǎn)萃取的對(duì)比，其結(jié)果如下 表：

【權(quán)利要求】
1. 一種血液和尿液中亞硝酸鹽快速檢測(cè)方法，包括以下步驟： (1) 制備亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)色階溶液：取濃度為5. OPg/mL的N02_標(biāo)準(zhǔn)溶液0. 005、0. 01、 0. 05、0. 10、0. 30、0. 70、1. OmL于刻度離心管中，用蒸饋水稀釋至5mL，加入GriessA試 劑250ML，混合均勻；lmin后加入GriessB試劑250ML，混合均勻，加入非離子表面活性劑 0. lmL，降濁點(diǎn)和相分離促進(jìn)劑氯化鈉或硫酸銨0. 1?0. 5g或有機(jī)醇0. 05?0. 2mL，渦旋混 合lmin,離心5?15min分相，溶液上層表面活性劑相出現(xiàn)由淺至深的紅色環(huán)色階； (2) 檢測(cè)尿液中的亞硝酸鹽：取10mL尿液，硫酸鋅0. 4?1. 0g，加入活性炭0. 5?
1. 〇g，混合均勻，離心脫色，濾紙過濾除去活性炭；取5mL脫色后的尿液，加入GriessA試 劑250ML，混合均勻；lmin后加入GriessB試劑250ML，混合均勻，放置5min后，加入非離子 表面活性劑0. lmL，降濁點(diǎn)和相分離促進(jìn)劑氯化鈉或硫酸銨0. 1?0. 5g或有機(jī)醇0. 05? 0. 2mL，潤(rùn)旋混合lmin,離心5?15min分相，將溶液上層表面活性劑相的顏色與步驟（1)標(biāo) 準(zhǔn)色階比較，判斷其含量； (3) 檢測(cè)血液中的亞硝酸鹽：取5 mL新鮮血液，放入離心機(jī)中離心，取上清液，加入 0. lmol/L氫氧化鈉溶液0. 2mL和硫酸鋅0. 2g，混合均勻，加入乙腈lmL，離心分離，取上清 液2mL于10mL離心管中用蒸饋水定容至5mL,加入GriessA試劑250ML，混合均勻；lmin后 加入GriessB試劑250ML，混合均勻，放置5min，加入非離子表面活性劑0. 2mL，降濁點(diǎn)和相 分離促進(jìn)劑氯化鈉或硫酸銨〇. 1?〇. 5g或有機(jī)醇0. 05?0. 2mL，潤(rùn)旋混合lmin,離心5? 15min分相，將溶液上層表面活性劑相的顏色與步驟（1)標(biāo)準(zhǔn)色階比較，判斷其含量。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于：所述的GriessA試劑為50mg對(duì)氨基 苯磺酸溶于5mL鹽酸（0. 5mol/L);GriessB試劑為4mg N-1-萘乙二胺鹽酸鹽溶于4mL甲醇 (50%)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于：所述非離子表面活性劑包括脂肪醇 聚氧乙烯醚AE0-3、AE0-7、AE0-9中之一種。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于：所述的降濁點(diǎn)和相分離促進(jìn)劑，有機(jī) 醇包括正辛醇、正戊醇、正癸醇中的一種。
5. 權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于：樣品檢測(cè)中所述的離心條件為離心時(shí)間 5 ?15min，離心速率 3000 ?lOOOOr / min。
【文檔編號(hào)】G01N21/78GK104458712SQ201310428467
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2013年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月18日
【發(fā)明者】楊亞玲, 王軍, 趙嬌, 寧金艷 申請(qǐng)人:云南健牛生物科技有限公司