一種膽酸鈉含量的測(cè)定方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種膽酸鈉含量的測(cè)定方法，包括：（1）配制待測(cè)膽酸鈉溶液；（2）分別配制豬去氧膽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和鵝去氧膽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液；（3）用高效液相色譜法測(cè)定待測(cè)膽酸鈉溶液中豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸的含量。本發(fā)明具有簡(jiǎn)便易行、結(jié)果精準(zhǔn)、測(cè)定時(shí)間短、可推廣性強(qiáng)的特點(diǎn)，可以廣泛應(yīng)用于成分檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種膽酸鈉含量的測(cè)定方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種成分檢測(cè)方法，特別是涉及一種膽酸鈉含量的測(cè)定方法。

【背景技術(shù)】
[0002]膽酸鈉是從豬膽汁中提取的膽汁酸鹽混合物，臨床上是用于治療膽囊炎、膽汁缺乏等疾患的利膽藥。豬膽汁除含大量水分外，主要含有膽鹽、膽色素、膽固醇、脂肪酸、卵磷脂以及一些無(wú)機(jī)鹽，而膽鹽為各種膽酸與甘氨酸或牛磺酸結(jié)合而成的膽汁酸的鉀鹽或者鈉鹽形態(tài)。經(jīng)過(guò)提取和純化后，膽酸鈉中的主要成分為膽汁酸鈉鹽，是由甘氨酸和牛磺酸與各種膽酸類(lèi)的結(jié)合膽酸的鈉鹽等物質(zhì)組成的混合物。
[0003]《名醫(yī)別錄》記載:膽汁中主要的化學(xué)成分為膽汁酸類(lèi)、膽色素、粘蛋白、脂類(lèi)及無(wú)機(jī)物等。膽汁酸中有鵝脫氧膽酸、3 α -羥基-6-氧-5 α -膽烷酸和石膽酸，它們幾乎完全與甘氨酸結(jié)合而存在。另含豬膽酸和豬去氧膽酸。豬膽性味苦，寒。入肝、膽、肺、大腸經(jīng)。功效主治清熱、潤(rùn)燥、解毒。治熱病里熱燥渴、便秘，黃疸、百日咳、哮喘、泄瀉、痢疾、目赤、喉痹、聹耳、癰腫疔瘡。具有鎮(zhèn)咳、平喘、消炎、抗過(guò)敏、抑菌作用?！峨S息居飲食譜》記載:補(bǔ)膽、清熱、治熱痢、通熱秘?！毒V目》記載:通小便、敷惡瘡、殺疳匿、治日赤、目翳、明日、清心臟、涼肝脾。
[0004]近年來(lái)，隨著我國(guó)人民生活水平的提高，進(jìn)食高熱量食品的人數(shù)逐漸增多，這使膽囊炎的發(fā)病率也明顯增加。目前，我國(guó)膽囊炎和膽結(jié)石的發(fā)病率以每年80萬(wàn)新患者的速度增加。終其原因是經(jīng)常吃一些大魚(yú)大肉、油膩食品、高糖、高膽固醇的東西(比如松花蛋、無(wú)鱗魚(yú)等)，這都是含膽固醇比較高的食品，膽汁中膽固醇濃度增加或過(guò)飽和狀態(tài)使膽固醇易于析出并形成結(jié)石。所以膽結(jié)石癥的多發(fā)主要還是和生活中飲食不合理有關(guān)。這才導(dǎo)致了膽石癥發(fā)生的上升趨勢(shì)，從而引起膽囊炎，兩者互為因果。發(fā)病后，患者一般表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的右上腹或心窩部飽脹、疼痛，甚者有膽絞痛，痛引右肩背部，并發(fā)感染急性發(fā)作時(shí)可有惡寒、發(fā)熱，或寒熱往來(lái)。平素只感到右肋部脹痛，或心窩部飽脹、噯氣多、厭食、惡心，或見(jiàn)胃脘部灼熱，食油膩之物即感上腹部作脹，嚴(yán)重時(shí)大便泄瀉，以高脂餐后即發(fā)作為典型表現(xiàn)。如同時(shí)并發(fā)有結(jié)石者則常有反復(fù)發(fā)作的膽絞痛病史，給病人帶來(lái)了及大的痛苦。為了減輕受患者的癥狀，臨床上迫切需要更加方便、更有效的、患者自己能使用的藥物，從而使以膽酸鈉為主要原料的膽酸鈉片成為了治療膽囊炎的首選藥物。
[0005]另外一個(gè)以膽酸鈉為主要原料的藥物復(fù)方膽氨片則主要用于支氣管炎，支氣管哮喘急性發(fā)作以及肺氣腫及早期肺心病。支氣管炎，支氣管哮喘急性發(fā)作以及肺氣腫及早期肺心病在我國(guó)是一個(gè)發(fā)病率很高的疾病。70年代的全國(guó)性普查平均患病率就支氣管炎4% ；而且年齡愈大，患病率愈高，50歲以上的人可達(dá)13%。引起支氣管炎發(fā)病的原因比較復(fù)雜，且常常是多種因素長(zhǎng)期相互作用的結(jié)果。這些因素包括感染、理化因素、過(guò)敏、氣候變化等，而吸煙則被國(guó)內(nèi)外一致公認(rèn)與支氣管炎的發(fā)病有密切關(guān)系，吸煙時(shí)間愈長(zhǎng)，吸煙量愈多，患病率也愈高。在我國(guó)嗜好吸煙且成癮的人極為普遍，這是導(dǎo)致支氣管炎患病率增高的一個(gè)主要原因。另外近年由于工業(yè)化污染加重，環(huán)境中的粉塵和有害氣體也使支氣管炎的發(fā)病率不斷上升。
[0006]現(xiàn)有的膽酸鈉檢測(cè)方法，只能大致測(cè)定膽酸鈉所包含的物質(zhì)成分，難以將其具體成分和含量量化，因此，急需一種新的測(cè)定方法對(duì)膽酸鈉進(jìn)行精準(zhǔn)測(cè)定。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是為了克服上述【背景技術(shù)】的不足，提供一種膽酸鈉含量的測(cè)定方法，使其具有簡(jiǎn)便易行、結(jié)果精準(zhǔn)、測(cè)定時(shí)間短、可推廣性強(qiáng)的特點(diǎn)。
[0008]本發(fā)明提供的一種膽酸鈉含量的測(cè)定方法，包括:(1)配制待測(cè)膽酸鈉溶液；(2)分別配制豬去氧膽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和鵝去氧膽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液；(3)用高效液相色譜法測(cè)定待測(cè)膽酸鈉溶液中豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸的含量。
[0009]在上述技術(shù)方案中，所述步驟(3)中，所述高效液相色譜法步驟如下:以0.125%乙酸為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B，線性梯度洗脫:0?18min，60%A ； 18?22min，60%A — 40%A ；22 ?23min，40%A — 20%A ；23 ?33min，20%A ；33 ?35min，20%A — 60%A ；35 ?40min，60%A ；流速為lml/min ;采集時(shí)間40分鐘，最后，根據(jù)豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以膽酸鈉樣品溶液峰面積的大小來(lái)確定膽酸鈉樣品中豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸的含量。
[0010]在上述技術(shù)方案中，所述步驟(I)中，配制待測(cè)膽酸鈉溶液包括如下步驟:(1.0稱(chēng)定待測(cè)膽酸鈉樣品置于燒瓶中，加入氫氧化鈉溶液和乙醇加熱至沸騰，并通過(guò)冷凝管回流至燒瓶中；(1.2)向燒瓶中的回流液滴加硫酸調(diào)節(jié)PH值，放冷；(1.3)通過(guò)分液漏斗用乙酸乙酯振搖提取燒瓶中的回流液并過(guò)濾形成乙酸乙酯提取液；(1.4)除去乙酸乙酯提取液中的乙酸乙酯，并干燥至恒重；(1.5)將干燥物加甲醇溶解并稀釋至容量瓶刻度，將稀釋液過(guò)濾后再次稀釋至容量瓶刻度，得到待檢測(cè)膽酸鈉溶液。
[0011]在上述技術(shù)方案中，所述步驟(1.1)中，回流液回流至燒瓶后，用水沖洗冷凝管，過(guò)濾，并將洗液置于分液漏斗中，用熱水分別洗滌燒瓶和分液漏斗并合并至燒瓶。
[0012]在上述技術(shù)方案中，所述步驟(1.1)中，稱(chēng)定待測(cè)膽酸鈉樣品0.5g，加15%氫氧化鈉溶液30ml與乙醇5ml，加熱回流6小時(shí)，用30ml水沖洗冷凝管，過(guò)濾，并將洗液置于分液漏斗中，5ml熱水洗滌燒瓶和分液漏斗各2次，并將洗液和熱水合并至燒瓶。
[0013]在上述技術(shù)方案中，所述步驟(1.2)中，向回流液滴加硫酸使其PH值為2?3。
[0014]在上述技術(shù)方案中，所述步驟(1.3)中，形成乙酸乙酯提取液后，用水沖洗分液漏斗，用乙酸乙酯振搖提取沖洗液，過(guò)濾后與前述乙酸乙酯提取液合并。
[0015]在上述技術(shù)方案中，所述步驟(1.3)中，燒瓶中的回流液用乙酸乙酯振搖提取4次，依次為60ml、40ml、40ml、30ml，過(guò)濾后合并形成乙酸乙酯提取液，隨后用水沖洗分液漏斗2次，每次10ml，用15ml乙酸乙酯振搖提取，過(guò)濾后與前述乙酸乙酯提取液合并。
[0016]在上述技術(shù)方案中，所述步驟(1.4)中，通過(guò)蒸發(fā)方式除去乙酸乙酯提取液中的乙酸乙酯，并在105°C通過(guò)蒸發(fā)干燥至恒重。
[0017]在上述技術(shù)方案中，所述步驟(1.5)中，用30ml甲醇溶解干燥物，接著用2ml甲醇沖洗，合并至50ml容量瓶，將甲醇稀釋至刻度，將稀釋液過(guò)濾，取50ml容量瓶，再加甲醇稀釋至刻度，得到待檢測(cè)膽酸鈉溶液。
[0018]本發(fā)明膽酸鈉含量的測(cè)定方法，具有以下有益效果:不僅簡(jiǎn)便易行，測(cè)定所需時(shí)間短，并且能對(duì)膽酸鈉所含物質(zhì)進(jìn)行精確地定量分析，結(jié)果非常精準(zhǔn)；同時(shí)，由于高效液相色譜技術(shù)應(yīng)用非常廣泛，技術(shù)相對(duì)成熟，符合藥品含量測(cè)定技術(shù)發(fā)展的趨勢(shì)，在行業(yè)內(nèi)具有很強(qiáng)的推廣性。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0019]圖1為本發(fā)明膽酸鈉含量的測(cè)定方法中豬去氧膽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液樣品I的高效液相的檢測(cè)色譜圖；
[0020]圖2為本發(fā)明膽酸鈉含量的測(cè)定方法中豬去氧膽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液樣品2的高效液相的檢測(cè)色譜圖；
[0021]圖3為本發(fā)明膽酸鈉含量的測(cè)定方法中豬去氧膽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液樣品3的高效液相的檢測(cè)色譜圖；
[0022]圖4為本發(fā)明膽酸鈉含量的測(cè)定方法中鵝去氧膽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液樣品I的高效液相的檢測(cè)色譜圖；
[0023]圖5為本發(fā)明膽酸鈉含量的測(cè)定方法中鵝去氧膽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液樣品2的高效液相的檢測(cè)色譜圖；
[0024]圖6為本發(fā)明膽酸鈉含量的測(cè)定方法中鵝去氧膽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液樣品3的高效液相的檢測(cè)色譜圖；
[0025]圖7為待測(cè)膽酸鈉溶液高效液相的檢測(cè)色譜圖。

【具體實(shí)施方式】
[0026]下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，但該實(shí)施例不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。
[0027]一種膽酸鈉含量的測(cè)定方法，包括如下步驟:
[0028](I)配制待測(cè)膽酸鈉溶液:(1.1)取武漢生物化學(xué)制藥有限公司生產(chǎn)的膽酸鈉0.5g，精密稱(chēng)定并置于燒瓶中，加15%氫氧化鈉溶液30ml與乙醇5ml，加熱至沸騰后通過(guò)冷凝管回流6小時(shí)，用30ml水沖洗冷凝管，過(guò)濾，并將洗液置于分液漏斗中，用5ml熱水洗滌燒瓶與分液漏斗各2次，洗液合并至燒瓶中。
[0029](1.2)向回流液滴加硫酸使pH值為2.7，放冷。
[0030](1.3)燒瓶中的回流液用乙酸乙酯振搖提取4次，依次60ml、40ml、40ml、30ml，過(guò)濾后合并形成乙酸乙酯提取液，隨后用水沖洗分液漏斗2次，每次10ml，沖洗液用15ml乙酸乙酯振搖提取，過(guò)濾后，與前述乙酸乙酯提取液合并。
[0031](1.4)通過(guò)蒸發(fā)方式除去乙酸乙酯提取液中的乙酸乙酯，并在105°C通過(guò)蒸發(fā)干燥至恒重。
[0032](1.5)加甲醇30ml溶解干燥物，接著用2ml甲醇沖洗，合并至50ml容量瓶，將甲醇稀釋至刻度，將稀釋液過(guò)濾，取50ml容量瓶，再加甲醇稀釋至刻度，得到待檢測(cè)膽酸鈉溶液。
[0033](2)分別配制豬去氧膽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和鵝去氧膽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液:精密稱(chēng)取購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所的豬去氧膽酸適量，加甲醇制成每Iml中分別含豬去氧膽酸0.1mg,0.2mg、0.5mg的I--3號(hào)豬去氧膽酸溶液樣品；精密稱(chēng)取購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所的鵝去氧膽酸適量，加甲醇制成每Iml中分別含鵝去氧膽酸0.lmg、0.2mg、0.5mg的I?3
號(hào)鵝去氧膽酸溶液樣品。
[0034](3)用高效液相色譜法測(cè)定待測(cè)膽酸鈉溶液中豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸的含量:高效液相色譜(HPLC)儀器采用Waters公司出品的e2695Separat1ns Module,檢測(cè)器型號(hào)為2424ELS Detector,色譜柱型號(hào)為C18，以0.125%乙酸為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B，線性梯度洗脫:0 ?18min，60%A ；18 ?22min，60%A — 40%A ；22 ?23min，40%A — 20%A ；23 ?33min, 20%A ；33 ?35min，20%A — 60%A ；35 ?40min，60%A ;流速為 lml/min ;采集時(shí)間 40 分鐘。
[0035]由于在蒸發(fā)光散射檢測(cè)器下，豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸的含量和HPLC中相應(yīng)峰面積的對(duì)數(shù)是成正比的。因此根據(jù)豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以膽酸鈉樣品溶液峰面積的大小來(lái)確定膽酸鈉樣品中豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸的含量。豬去氧膽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的進(jìn)樣量為10μ 1，通過(guò)HPLC儀器測(cè)得的色譜圖如圖1?3所示。鵝去氧膽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的進(jìn)樣量為10 μ 1，通過(guò)HPLC儀器測(cè)得的色譜圖如圖4?6所示。
[0036]待測(cè)樣品進(jìn)樣量為10μ 1，通過(guò)HPLC儀器測(cè)得的色譜圖如7所示，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)樣品的保留時(shí)間對(duì)比，可以找到峰I保留時(shí)間為15.647分鐘，與標(biāo)準(zhǔn)樣品I?3里豬去養(yǎng)膽酸的保留時(shí)間15.686分鐘、15.584分鐘和15.588分鐘相近，應(yīng)該對(duì)應(yīng)豬去氧膽酸。而峰2的保留時(shí)間為25.852分鐘，與標(biāo)準(zhǔn)樣品I?3里鵝去氧膽酸的保留時(shí)間25.846分鐘、25.847分鐘和25.876分鐘相近，應(yīng)該對(duì)應(yīng)鵝去氧膽酸。由于在蒸發(fā)光散射的檢測(cè)條件下，豬去養(yǎng)膽酸和鵝去氧膽酸的含量和HPLC中相應(yīng)峰面積的對(duì)數(shù)是成正比的。因此待測(cè)樣品溶液中豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸的含量分別為12.2%和13.4%。
[0037]顯然，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種改動(dòng)和變型而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。這樣，倘若本發(fā)明的這些修改和變型屬于本發(fā)明權(quán)利要求及其等同技術(shù)的范圍之內(nèi)，則本發(fā)明也意圖包含這些改動(dòng)和變型在內(nèi)。
[0038]本說(shuō)明書(shū)中未作詳細(xì)描述的內(nèi)容屬于本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員公知的現(xiàn)有技術(shù)。
【權(quán)利要求】
1.一種膽酸鈉含量的測(cè)定方法，其特征在于:包括: (1)配制待測(cè)膽酸鈉溶液； (2)分別配制豬去氧膽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和鵝去氧膽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液； (3)用高效液相色譜法測(cè)定待測(cè)膽酸鈉溶液中豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膽酸鈉含量的測(cè)定方法，其特征在于:所述步驟(3)中，所述高效液相色譜法步驟如下:以0.125%乙酸為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B，線性梯度洗脫:0?18min, 60%A ； 18 ?22min，60%A — 40%A ；22 ?23min，40%A — 20%A ；23 ?33min，20%A ；33 ?35min, 20%A — 60%A ；35?40min，60%A ;流速為lml/min ;采集時(shí)間40分鐘，最后，根據(jù)豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以膽酸鈉樣品溶液峰面積的大小來(lái)確定膽酸鈉樣品中豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸的含量。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的膽酸鈉含量的測(cè)定方法，其特征在于:所述步驟(1)中，配制待測(cè)膽酸鈉溶液包括如下步驟: (1.1)稱(chēng)定待測(cè)膽酸鈉樣品置于燒瓶中，加入氫氧化鈉溶液和乙醇加熱至沸騰，并通過(guò)冷凝管回流至燒瓶中； (1.2)向燒瓶中的回流液滴加硫酸調(diào)節(jié)PH值，放冷； (1.3)通過(guò)分液漏斗用乙酸乙酯振搖提取燒瓶中的回流液并過(guò)濾形成乙酸乙酯提取液； (1.4)除去乙酸乙酯提取液中的乙酸乙酯，并干燥至恒重； (1.5)將干燥物加甲醇溶解并稀釋至容量瓶刻度，將稀釋液過(guò)濾后再次稀釋至容量瓶刻度，得到待檢測(cè)膽酸鈉溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的膽酸鈉含量的測(cè)定方法，其特征在于:所述步驟(1.1)中，回流液回流至燒瓶后，用水沖洗冷凝管，過(guò)濾，并將洗液置于分液漏斗中，用熱水分別洗滌燒瓶和分液漏斗并合并至燒瓶。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的膽酸鈉含量的測(cè)定方法，其特征在于:所述步驟(1.1)中，稱(chēng)定待測(cè)膽酸鈉樣品0.5g，加15%氫氧化鈉溶液30ml與乙醇5ml，加熱回流6小時(shí)，用30ml水沖洗冷凝管，過(guò)濾，并將洗液置于分液漏斗中，5ml熱水洗滌燒瓶和分液漏斗各2次，并將洗液和熱水合并至燒瓶。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的膽酸鈉含量的測(cè)定方法，其特征在于:所述步驟(1.2)中，向回流液滴加硫酸使其PH值為2?3。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的膽酸鈉含量的測(cè)定方法，其特征在于:所述步驟(1.3)中，形成乙酸乙酯提取液后，用水沖洗分液漏斗，用乙酸乙酯振搖提取沖洗液，過(guò)濾后與前述乙酸乙酯提取液合并。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的膽酸鈉含量的測(cè)定方法，其特征在于:所述步驟(1.3)中，燒瓶中的回流液用乙酸乙酯振搖提取4次,依次為60ml、40ml、40ml、30ml,過(guò)濾后合并形成乙酸乙酯提取液，隨后用水沖洗分液漏斗2次，每次10ml，用15ml乙酸乙酯振搖提取，過(guò)濾后與前述乙酸乙酯提取液合并。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的膽酸鈉含量的測(cè)定方法，其特征在于:所述步驟(1.4)中，通過(guò)蒸發(fā)方式除去乙酸乙酯提取液中的乙酸乙酯，并在105°C通過(guò)蒸發(fā)干燥至恒重。
10.根據(jù)權(quán)利要求3所述的膽酸鈉含量的測(cè)定方法，其特征在于:所述步驟(1.5)中，用30ml甲醇溶解干燥物，接著用2ml甲醇沖洗，合并至50ml容量瓶，將甲醇稀釋至刻度，將稀釋液過(guò)濾，取50ml容量瓶，再加甲醇稀釋至刻度，得到待檢測(cè)膽酸鈉溶液。
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK104458930SQ201310441950
【公開(kāi)日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2013年9月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月25日
【發(fā)明者】邵群梅, 胡文杰, 孫強(qiáng) 申請(qǐng)人:武漢生物化學(xué)制藥有限公司