一種鉛離子快速檢測(cè)金標(biāo)試紙條或卡的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種用于快速檢測(cè)鉛離子的金標(biāo)試紙條/卡，包括底層支撐板(1)、樣品墊(2)、金標(biāo)抗體結(jié)合墊(3)、纖維素膜(4)、吸水墊。本發(fā)明可以實(shí)現(xiàn)對(duì)環(huán)境、土壤、水、食品、藥物、化妝品中鉛離子污染殘留的快速檢測(cè)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種鉛離子快速檢測(cè)金標(biāo)試紙條或卡
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明涉及的是一種用于快速檢測(cè)鉛離子的金標(biāo)試紙條/卡及其制備方法與應(yīng)用，屬于免疫學(xué)和衛(wèi)生檢驗(yàn)學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】:
[0002]鉛(Pb)是一種青灰色重金屬，是我們所熟知的環(huán)境毒物之一，它在自然界中分布廣泛，而且又是在現(xiàn)代社會(huì)中具有多種用途的有色金屬之一。早在夏商時(shí)期，我們的祖先就利用銅與鉛冶煉出具高硬度與韌性的青銅，廣泛用于兵器、工具、禮器與食器制作，青銅器鉛含量最高可達(dá)40%左右。隨著工農(nóng)業(yè)的發(fā)展，鉛的用途也越來(lái)越廣泛，以致在空氣、土壤、食品、餐具、玩具中都能尋其身影，覓其蹤跡。在我國(guó)，鉛和精煉鉛產(chǎn)量居世界第三位，主要用于蓄電池制造、顏料、合金等行業(yè)。1923年開(kāi)始在汽油中加入鉛用作抗爆劑以后，更加速了全球性鉛的污染。鉛污染狀況已不容忽視。鉛是全身性毒物，具有高蓄積性與多親和性，可通過(guò)消化、呼吸等途徑被機(jī)體吸收，對(duì)人體無(wú)任何生理功能。急性鉛中毒多表現(xiàn)為胃疼，頭痛，顫抖，神經(jīng)性煩躁，嚴(yán)重時(shí)，昏迷，直至死亡。慢性鉛中毒大多表現(xiàn)為神經(jīng)毒性，對(duì)血液系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、腎臟等造成一定損害。鉛是對(duì)兒童威脅最大的環(huán)境污染物之一，兒童對(duì)鉛元素較成人敏感。由于血腦屏障沒(méi)有發(fā)育完整，嬰幼兒的血鉛水平在達(dá)到100 μ g/L時(shí)便可以引起認(rèn)知功能障礙或發(fā)育延遲。
[0003]由于鉛的污染和危害性較大，我國(guó)制定了土壤、食品、水體、玩具、用具等涉鉛領(lǐng)域中的國(guó)家限量標(biāo)準(zhǔn)，農(nóng)產(chǎn)品安全質(zhì)量無(wú)公害水產(chǎn)品安全要求(GB18406.4-2001)中對(duì)鉛含量都有限定量< 0.5mg/kg，地下水質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(GB/T14848-93)中規(guī)定，主要適用于集中式生活飲用水水源及工農(nóng)業(yè)用水的鉛離子限量< 0.05mg/L，熟肉制品(GB2726-2005)要求鉛含量< 0.5mg/kg。歐盟、日本、韓國(guó)等對(duì)我國(guó)的出口物資的重金屬含量標(biāo)準(zhǔn)也越來(lái)越嚴(yán)格。
[0004]目前，檢測(cè)環(huán)境鉛離子的方法主要有:
[0005](I)物理和化學(xué)分析方法:包括紫外分光光度法(UV)、電化學(xué)分析法(EC)、原子吸收光譜法(AAS)、電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(ICP-AES)、氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法(HG-AFS)、中子活化分析法(NAA)等。這些方法各有自己優(yōu)缺點(diǎn)，紫外分光光度法操作簡(jiǎn)單，快速，干擾小，但其靈敏度不高；電化學(xué)分析法具有靈敏、簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，對(duì)操作人員的技術(shù)要求高；原子吸收光譜法、電感耦合等離子體質(zhì)譜法、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法、氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法具有選擇性好、測(cè)定精度高、簡(jiǎn)單、快速等優(yōu)點(diǎn)，但所用儀器比較昂貴，只能在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)，且對(duì)操作人員技術(shù)要求較為嚴(yán)格，限制了其廣泛使用；中子活化分析法是一種以核反應(yīng)為基礎(chǔ)的分析方法，具有微量、快速、準(zhǔn)確和非破壞性且同時(shí)可分析多元素的優(yōu)點(diǎn)，但所需的設(shè)備不易為一般實(shí)驗(yàn)室所具備，很難得到廣泛應(yīng)用。
[0006](2)免疫學(xué)分析方法:包括酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，和膠體金免疫層析法。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)以競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫反應(yīng)為檢測(cè)原理，反應(yīng)顯色后用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光值(OD)值進(jìn)行結(jié)果判定。縮短了檢測(cè)時(shí)間，可以對(duì)殘留藥物進(jìn)行定性定量檢測(cè)。但ELISA方法需要配套的酶標(biāo)儀和配套試劑，操作過(guò)程仍較復(fù)雜，而且國(guó)內(nèi)現(xiàn)處在研發(fā)階段，進(jìn)口國(guó)外產(chǎn)品價(jià)格昂貴，因而ELISA方法的應(yīng)用受到了較大限制。膠體金免疫層析法(GICA)，其檢測(cè)原理是當(dāng)待檢樣本與吸附在在膜上的膠體金標(biāo)記物(抗體或單克隆抗體)結(jié)合后，通過(guò)層析，與固定在膜上的特異性的抗原或抗體發(fā)生特異性結(jié)合而被截留，聚集在檢測(cè)帶上，可通過(guò)肉眼觀察到膠體金標(biāo)記物的顯色結(jié)果。膠體金免疫層析技術(shù)因具有攜帶方便、操作簡(jiǎn)便、快速、特異性強(qiáng)、敏感性高、影響因素少、無(wú)需特殊儀器和標(biāo)本不易污染等優(yōu)點(diǎn)，適合對(duì)大批量樣品進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)初篩，從而被廣泛用于免疫學(xué)、組織學(xué)、病理學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等眾多領(lǐng)域。但對(duì)于鉛離子快速檢測(cè)金標(biāo)試紙條/卡研制的有關(guān)文獻(xiàn)和專(zhuān)利目前尚未見(jiàn)報(bào)道。
[0007]因此，鉛離子污染已對(duì)人類(lèi)健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅，研制快速、簡(jiǎn)便、敏感、特異、經(jīng)濟(jì)、篩檢量大的鉛離子快速檢測(cè)金標(biāo)試紙產(chǎn)品，對(duì)于減少環(huán)境污染、提高食品質(zhì)量、保障食品安全具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0008]本發(fā)明的目的:研制出一種能夠快速、簡(jiǎn)便、敏感、特異的檢測(cè)鉛離子污染殘留的快速檢測(cè)鉛離子金標(biāo)試紙條和試紙卡。
[0009]一種用于快速檢測(cè)鉛離子的金標(biāo)試紙條/卡，包括底層支撐板(I)、樣品墊(2)、金標(biāo)抗體結(jié)合墊(3)、纖維素膜(4)、吸水墊(5)、包被膜(6)和外卡(7)等部分。其特征在于:所述試紙條是以底層支撐板為底部支撐，將樣品墊、金標(biāo)抗體結(jié)合墊、纖維素膜、吸水墊和包被膜依次粘貼于底層支撐板上。所述試紙卡是以試紙條為基礎(chǔ)，加上外卡制成。所述底層支撐板和外卡均由硬質(zhì)塑料制成，所述樣品墊與金標(biāo)抗體結(jié)合墊由玻璃纖維棉制成；所述金標(biāo)抗體結(jié)合墊包被有膠體金標(biāo)記的能識(shí)別鉛離子的單克隆抗體；所述纖維素膜中部依次平行排列有隱形檢測(cè)線(xiàn)(T線(xiàn))和質(zhì)控線(xiàn)(C線(xiàn))，檢測(cè)線(xiàn)包被有鉛離子與載體蛋白形成的偶聯(lián)物，質(zhì)控線(xiàn)包被有兔抗鼠IgG(RaMIgG)。所述的鉛離子金標(biāo)試紙條/卡，其特征是:所述的檢測(cè)抗原鉛-異硫氰酸芐基乙二胺四乙酸-雞卵清白蛋白(Pb2+-1TCBE-OVA)，其制備步驟:
[0010](I)稱(chēng)取20mg卵清蛋白(OVA)溶于ImL pH9.0的HEPES緩沖液(10mM/L)中形成20mg/mL的載體蛋白溶液。
[0011](2)稱(chēng)取IOmgl-(4-異硫氰根苯基)-乙二胺四乙酸(ITCBE)溶于ImL 二甲基亞砜(DMSO)中形成金屬螯合劑溶液；
[0012](3)將0.5mL金屬螯合劑溶液逐滴加到OVA載體蛋白溶液中，混勻后，加入IOOul三正丁胺(1.5M)，搖床室溫反應(yīng)24h，制成0VA-1TCBE溶液。
[0013](4)取11.25mg硝酸鉛(Pb (N03) 2)溶于IOOul蒸餾水中，形成均勻的Pb2+溶液；
[0014](5)將Pb2+溶液加入到0VA-1TCBE溶液中，調(diào)節(jié)pH值至7.4，在室溫下，搖床孵育4h，然后移入透析袋中PBS透析10d，即形成Pb2+-1TCBE-OVA,收集分裝，一 20°C凍存。
[0015]所述的重金屬鉛離子金標(biāo)試紙條/卡制備步驟:
[0016](I)膠體金溶液制備:采用檸檬酸鹽還原法制備，取IOOOmL三角燒瓶，加入975mL雙蒸水煮沸，加入15mL朽1檬酸三鈉繼續(xù)加熱5min,加入IOmLl %氯金酸,繼續(xù)加熱至溶液呈現(xiàn)橘紅色，冷卻至室溫后，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0017](2)單克隆抗體制備:采用權(quán)利要求3所述的Pb2+-1TCBE-OVA免疫6周雌性BALB/C小鼠5只，劑量為50 μ g/0.2mL/只，背部皮下分點(diǎn)注射。采用細(xì)胞融合技術(shù)無(wú)菌取脾臟制備脾細(xì)胞，在聚乙二醇-1500作用下與NSO骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合；用間接ELISA法和阻斷ELISA法進(jìn)行陽(yáng)性孔篩選，，選擇強(qiáng)陽(yáng)性、抑制率高、細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛的孔進(jìn)行有限稀釋克隆化，擴(kuò)大培養(yǎng)、凍存并鑒定，獲得一株雜交瘤細(xì)胞株；之后采用體內(nèi)誘生腹水法制備Pb2+-1TCBE-OVA mAb ；
[0018](3)金標(biāo)抗體制備:將待標(biāo)單克隆抗體溶液10000r/min離心30min,用0.lmol/LK2CO3溶液調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH值至8.2 ;根據(jù)聚沉現(xiàn)象，確定Pb2+-1TCBE-0VA mAb與膠體金溶液最適標(biāo)記濃度，為0.175mg/mL。取膠體金溶液10mL，用0.lmol/L K2CO3溶液調(diào)節(jié)膠體金溶液的PH值至8.2。取等量的濃度為0.175mg/mL單克隆抗體溶液，磁力攪拌下混合，室溫孵育15min, 10000r/min離心30min,棄上清,沉淀物用0.02mol/L Na2B4O7溶液(含10g/L0VA、0.5g/L疊氮鈉)稀釋?zhuān)?°C保存?zhèn)溆谩?br> [0019](4)金標(biāo)抗體結(jié)合墊制備:裁取規(guī)格為20X4mm的玻璃纖維棉，將金標(biāo)抗體用X-only單向噴點(diǎn)儀均勻噴灑于玻璃纖維棉上，37°C干燥lh，密封，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0020](5)硝酸纖維素膜上檢測(cè)線(xiàn)、質(zhì)控線(xiàn)制備:將濃度為lmg/ml的Pb2+-1TCBE-OVA放于X-only單向噴點(diǎn)儀貯存池A，濃度為lmg/ml的RaMIgG放于貯存池B，開(kāi)機(jī)分別點(diǎn)射于膜中央，形成間距0.5cm的檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)，自然干燥，密封，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0021](6)金標(biāo)試紙條組裝:將樣品墊、金標(biāo)抗體結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊按順序依次粘貼于支撐板上，并在樣品墊與金標(biāo)抗體結(jié)合墊表面粘貼MAX線(xiàn)，在切槽機(jī)上切割成寬度4_的金標(biāo)試紙。
[0022](7)金標(biāo)試紙卡組裝:將制備好的金標(biāo)試紙條加上外卡制成。
[0023]所述的鉛離子金標(biāo)試紙條/卡檢測(cè)線(xiàn)上Pb2+-1TCBE-OVA的包被量為I μ L/cm, OVA濃度為lmg/mL ;所述質(zhì)控線(xiàn)上RaMIgG的包被量為I μ L/cm, RaMIgG的濃度為lmg/mL。
[0024]一種快速檢測(cè)鉛離子的金標(biāo)試紙條/卡，其檢測(cè)步驟:
[0025](I)樣品預(yù)處理方法:樣品包括土壤、水、食品、飼料、動(dòng)物組織、血液、尿液、器物(如玩具、油漆等)。固體待檢物研磨搗碎，進(jìn)行硝酸-高氯酸濕消化(a)或微波消解(b)。液體待檢物直接加入硝酸消化(C)。
[0026]a硝酸-高氯酸濕消化法:分別取0.5g樣品放入玻璃消化管中，加15ml濃硝酸，置于通風(fēng)窗過(guò)夜；然后加入5ml濃高氯酸，恒溫下緩緩加熱至高氯酸白色煙霧逸盡，同時(shí)溶液澄清透明為止，冷卻后轉(zhuǎn)移到25ml容量瓶中待用。
[0027]b微波消解法:分別稱(chēng)取0.5g樣品，放入體積為20ml密閉的聚四氟乙烯微波消化管中，加入12ml硝酸，浸泡過(guò)夜；然后，將裝有樣品的微波消化管放人微波爐中，按程序消解。消解完成后，冷卻，倒入燒杯，置于198°C恒溫電熱板中，體積濃縮至2-3ml時(shí)，冷卻后用
2.5%硝酸，定容到25ml容量瓶中待用。
[0028]c硝酸消化法:液體待檢物直接加入15ml硝酸，室溫靜置2h，恒溫電熱板中，體積濃縮至2-3ml時(shí)，冷卻后用2.5%硝酸，定容到25ml容量瓶中待用。
[0029]按照1:1體積將樣品消化液與10% ITCBE螯合劑混勻，使鉛離子與ITCBE充分螯合，形成樣品待測(cè)液。
[0030](2)檢測(cè)步驟:取100μ L待測(cè)樣品，將所述的鉛離子金標(biāo)試紙條插入待測(cè)樣品中，室溫反應(yīng)5min,水平放置,觀察結(jié)果，IOmin以后結(jié)果無(wú)效?；蛴玫喂芪〈郎y(cè)樣品100 μ L,滴加于試紙卡的樣品孔上，反應(yīng)5min,觀察結(jié)果，IOmin以后結(jié)果無(wú)效。
[0031](3)分析檢測(cè)結(jié)果:T線(xiàn)、C線(xiàn)均顯色，判為陰性，表示樣品中鉛離子濃度小于2ng/mL或樣品中不含鉛離子；僅C線(xiàn)顯色，而T線(xiàn)不顯色，判為陽(yáng)性，表示樣品中鉛離子濃度大于2ng/mL ;若C線(xiàn)不顯色，無(wú)論T線(xiàn)是否顯色，均判為金標(biāo)試紙失效。
[0032]所述的鉛離子金標(biāo)試紙的檢測(cè)靈敏度為2ng/mL ;所述的鉛離子金標(biāo)試紙可應(yīng)用于環(huán)境、土壤、水、食品、器物中鉛離子污染殘留快速檢測(cè)中。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】:
[0033]圖1，3為鉛離子快速檢測(cè)金標(biāo)試紙條/卡的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0034]圖2為鉛離子快速檢測(cè)金標(biāo)試紙的顯色結(jié)果示意圖。
【具體實(shí)施方式】:
[0035]實(shí)施例一、鉛離子人工免疫抗原制備
[0036]采用采用異硫氰酯法制備人工免疫抗原Pb2+-1TCBE_0VA。稱(chēng)取20mg卵清蛋白OVA溶于ImL pH9.0的HEPES緩沖液(10mM/L)中形成20mg/mL的載體蛋白溶液。稱(chēng)取IOmgITCBE溶于ImL 二甲基亞砜(DMSO)中形成金屬螯合劑溶液；將0.5mL金屬螯合劑溶液逐滴加到OVA載體蛋白溶液中，混勻后，加入IOOul三正丁胺(1.5M)，搖床室溫反應(yīng)24h，制成0VA-1TCBE溶液。取11.25mg硝酸鉛(Pb (NO3)2)溶于IOOul蒸餾水中，形成均勻的Pb2+溶液；將Pb2+溶液加入到0VA-1TCBE溶液中，調(diào)節(jié)pH值至7.4，在室溫下，搖床孵育4h，然后移入透析袋中PBS透析10d，即形成Pb2+-1TCBE-OVA,收集分裝，_20°C凍存。制備出人工免疫抗原 Pb2+-1TCBE-0VA。
[0037]紫外分光光度法掃描可見(jiàn)OVA的最大吸收峰在280nm處，偶聯(lián)物在濃度與OVA濃度相同的情況下的紫外掃描光譜中表現(xiàn)出了各自光譜圖的迭加性質(zhì)；SDS-PAGE電泳法結(jié)果可見(jiàn)OVA的泳動(dòng)速度大于偶聯(lián)物，說(shuō)明偶聯(lián)物Pd2+-1TCBE-OVA的分子量大于0VA，證明偶聯(lián)成功。
[0038]實(shí)施例二、鉛離子人工免疫抗原鑒定
[0039]采用二喹啉甲酸法測(cè)定Pb2+-1TCBE-OVA中載體蛋白OVA濃度。以O(shè)VA作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，配成 O μ g/mL、10 μ g/mL>20 μ g/mL>40 μ g/mL>60 μ g/mL>80 μ g/mL 的濃度梯度，用二喹啉甲酸法構(gòu)建濃度檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。OVA濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的線(xiàn)性方程為:y=0.0022x+0.008，R2=0.9987，其中y為樣品在波長(zhǎng)為562nm處吸光度，x為樣品蛋白濃度。
[0040]采用ICP-AES 法測(cè)定 Pb2+-1TCBE-OVA 中 Pb2+ 的濃度。將 100 μ g/mL 的Pb2+-1TCBE-OVA 中 Pb2+ 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用 2 % 的硝酸稀釋成 O μ g/mL,0.1 μ g/mL,0.2 μ g/mL、
0.3 μ g/mL、0.4 μ g/mL、0.5 μ g/mL的濃度梯度，儀器軟件自動(dòng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，并得出線(xiàn)性回歸方程Y=0.27X+0.0045，相關(guān)系數(shù)0.9998 ;在283nm波長(zhǎng)的最佳優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行測(cè)定，儀器軟件自動(dòng)分析結(jié)果。
[0041]實(shí)施例三、抗鉛離子單克隆抗體制備
[0042]用Pb2+-1TCBE-OVA免疫6周雌性BALB/C小鼠5只，劑量為50 μ g/0.2mL/只，背部皮下分點(diǎn)注射。選擇細(xì)胞融合備用小鼠，間接ELISA檢測(cè)抗血清中Pb2+螯合物pAb效價(jià)，阻斷ELISA檢測(cè)Pb2+-1TCBE pAb對(duì)Pb2+-1TCBE的IC5tl，挑選效價(jià)最高、IC5tl最低的小鼠，超免用于細(xì)胞融合。采用細(xì)胞融合技術(shù)無(wú)菌取脾臟制備脾細(xì)胞，在50% PEG(pH8.0)作用下與NSO骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合；用間接ELISA和阻斷ELISA進(jìn)行陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株的篩選，選擇強(qiáng)陽(yáng)性、抑制率高、細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛的孔進(jìn)行3次有限稀釋克隆化。分別于凍存15d、30d和60d后復(fù)蘇雜交瘤細(xì)胞，培養(yǎng)后取上清液，間接ELISA測(cè)定抗體效價(jià)，考察雜交瘤細(xì)胞分泌單克隆抗體的穩(wěn)定性，獲得一株雜交瘤細(xì)胞株；之后采用體內(nèi)誘生腹水法制備Pb2+-1TCBE-OVAmAb，取8周齡健康Balb/c雌性小鼠，腹腔注射FIA0.5mL/只，10?15天后使用。將培養(yǎng)的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞IOOOrpm離心IOmin棄上清，收集細(xì)胞沉淀。用滅菌的PBS將細(xì)胞沉淀懸浮、混勻，將細(xì)胞數(shù)調(diào)至106/mL，腹腔注射Balb/C小鼠0.5mL/只。接種細(xì)胞7_10天后產(chǎn)生腹水，進(jìn)行收集，于37°C水浴30min，4°C放置過(guò)夜，12000rpm離心5min，棄去上層的脂肪、IFA和下層的沉淀，飽和硫酸銨鹽析法提純后測(cè)定IgG含量和效價(jià)，_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0043]實(shí)施例四、抗鉛離子單克隆抗體鑒定
[0044]腹水效價(jià)測(cè)定。給腹腔注射液體石蠟IOd后的小鼠腹腔注射克隆化細(xì)胞株107個(gè)細(xì)胞，7d后抽取腹水，飽和硫酸銨鹽析法提純，間接ELISA測(cè)定效價(jià)。測(cè)定結(jié)果，單克隆抗體腹水效價(jià)為1:7.2Χ105。
[0045]親和力鑒定。飽和ELISA測(cè)定親和常數(shù)(Ka)，用濃度分別為3.4μ g/mL和Uyg/mL 的 Pb2+-1TCBE-OVA 包被，加入倍比稀釋的 Pb2+-1TCBE mAb,再加入 GaMIgG-HRP，TMB 顯色測(cè)A45tol值，以Pb2+-1TCBE mAb濃度為橫坐標(biāo)，以A45tol值為縱坐標(biāo)，繪出相應(yīng)的2條反應(yīng)曲線(xiàn)，以每條曲線(xiàn)上部平坦段的A45tlnm值作為100%，在曲線(xiàn)上算出50% A45tol值時(shí)對(duì)應(yīng)的Pb2+-1TCBE mAb 濃度,按照公式 Kaff= (n-1)/2 (n [Ab' ] t_[Ab] t)計(jì)算 Ka。單克隆抗體的Ka 為 1.87 X IO1Vmolo
[0046]敏感性鑒定。用阻斷ELISA測(cè)定Pb2+-1TCBE mAb對(duì)不同濃度Pb2+-1TCBE的抑制率，以抑制率BziBci為縱坐標(biāo)，以不同濃度Pb2+-1TCBE的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線(xiàn)，進(jìn)行相關(guān)回歸分析，計(jì)算Pb2+-1TCBE mAb對(duì)Pb2+-1TCBE的IC50 0鑒定結(jié)果，IC50為25.25 μ g/L0
[0047]特異性鑒定。采用交叉反應(yīng)試驗(yàn)鑒定其特異性。交叉反應(yīng)試驗(yàn)選擇汞、鉻、鉛、鋅、銅、銫、鈷、鑰、鐵與ITCBE的鰲合物(鰲合方法同上)和ITCBE溶液。做為抑制劑，用阻斷ELISA 測(cè)定各抑制物的 IC5(I，以 Pb2+-1TCBE mAb 對(duì) Pb2+-1TCBE 的 IC5tl 和 Pb2+-1TCBE mAb 對(duì)各競(jìng)爭(zhēng)物的IC5tl之比的百分?jǐn)?shù)為其交叉反應(yīng)率(cross-reactivity, CR% )。鑒定結(jié)果,與其它重金屬離子交叉反應(yīng)小于0.01 %。
[0048]實(shí)施例五、鉛離子金標(biāo)試紙條/卡制備
[0049](I)膠體金溶液制備:采用檸檬酸鹽還原法制備，取IOOOmL三角燒瓶，加入975mL雙蒸水煮沸，加入15mL朽1檬酸三鈉繼續(xù)加熱5min,加入IOmLl %氯金酸,繼續(xù)加熱至溶液呈現(xiàn)橘紅色，冷卻至室溫后，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0050](2)金標(biāo)抗體制備:將待標(biāo)單克隆抗體溶液10000r/min離心30min,用0.lmol/LK2CO3溶液調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH值至8.2 ;根據(jù)聚沉現(xiàn)象，確定Pb2+-1TCBE-OVA mAb與膠體金溶液最適標(biāo)記濃度，為0.175mg/mL。取膠體金溶液10mL，用0.lmol/L K2CO3溶液調(diào)節(jié)膠體金溶液的PH值至8.2。取等量的濃度為0.175mg/mL單克隆抗體溶液，磁力攪拌下混合，室溫孵育15min, 10000r/min離心30min,棄上清,沉淀物用0.02mol/L Na2B4O7溶液(含IOg/L0VA、0.5g/L疊氮鈉)稀釋?zhuān)?°C保存?zhèn)溆谩0051](3)金標(biāo)抗體結(jié)合墊制備:裁取規(guī)格為20X4m的玻璃纖維棉，將金標(biāo)抗體用X-only單向噴點(diǎn)儀均勻噴灑于玻璃纖維棉上，37°C干燥lh，密封，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0052](4)硝酸纖維素膜上檢測(cè)線(xiàn)、質(zhì)控線(xiàn)制備:將濃度為lmg/ml的Pb2+-1TCBE-OVA放于X-only單向噴點(diǎn)儀貯存池A，濃度為lmg/ml的RaMIgG放于貯存池B，開(kāi)機(jī)分別點(diǎn)射于膜中央，形成間距0.5cm的檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)，自然干燥，密封，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0053](5)金標(biāo)試紙條組裝:將樣品墊、金標(biāo)抗體結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊按順序依次粘貼于支撐板上，并在樣品墊與金標(biāo)抗體結(jié)合墊表面粘貼MAX線(xiàn)，在切槽機(jī)上切割成寬度4m的金標(biāo)試紙。
[0054](6)金標(biāo)試紙卡組裝:將制備好的金標(biāo)試紙條加上外卡制成。
[0055]實(shí)施例六、鉛離子金標(biāo)試紙條/卡性能測(cè)定
[0056](I)本發(fā)明鉛離子金標(biāo)試紙條/卡的敏感度試驗(yàn)
[0057]用鉛離子金標(biāo)試紙測(cè)定濃度分別為0、2、4、8、16、32、64、128、256、512ng/mL的鉛
離子標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)重復(fù)，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果判斷其敏感性。結(jié)果見(jiàn)表1，由表1可知，鉛離子金標(biāo)試紙的目測(cè)檢測(cè)限為2ng/mL。
[0058]判定方法為:顯色區(qū)出現(xiàn)兩條線(xiàn)，且T線(xiàn)顏色明顯淺于C線(xiàn)顏色；或者顯色區(qū)只出現(xiàn)一條C線(xiàn)，而T線(xiàn)不顯色，判為陽(yáng)性。陽(yáng)性結(jié)果表示含量汞離子≤Ing/mL;顯色區(qū)出現(xiàn)檢測(cè)線(xiàn)(T線(xiàn))和對(duì)照線(xiàn)(C線(xiàn))兩條線(xiàn)，且T線(xiàn)顏色不淺于C線(xiàn)顏色，判為陰性。無(wú)效:顯色區(qū)兩條線(xiàn)(T線(xiàn)和C線(xiàn))均不出現(xiàn)，表明操作有誤或試紙失效，判為無(wú)效。
[0059]表1測(cè)定金標(biāo)試紙 敏感度試驗(yàn)(n=6)
[0060]
【權(quán)利要求】
1.一種用于快速檢測(cè)鉛離子的金標(biāo)試紙條，包括底層支撐板(I)、樣品墊(2)、金標(biāo)抗體結(jié)合墊(3)、纖維素膜(4)、吸水墊(5)，其特征在于:所述試紙條是以底層支撐板為底部支撐，將樣品墊、金標(biāo)抗體結(jié)合墊、纖維素膜、吸水墊和包被膜依次粘貼于底層支撐板上所述底層支撐板和外卡均由硬質(zhì)塑料制成，所述樣品墊與金標(biāo)抗體結(jié)合墊以玻璃纖維棉為基質(zhì)，所述金標(biāo)抗體結(jié)合墊包被有膠體金標(biāo)記的能識(shí)別鉛離子的單克隆抗體；所述纖維素膜中部依次平行排列有隱形檢測(cè)線(xiàn)(T線(xiàn))和質(zhì)控線(xiàn)(C線(xiàn))，檢測(cè)線(xiàn)包被有鉛離子與載體蛋白通過(guò)螯合劑形成的偶聯(lián)物，質(zhì)控線(xiàn)包被有兔抗鼠IgG(RaMIgG)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)鉛離子金標(biāo)試紙條，其特征是:所述的螯合劑選自異硫氰酸芐基乙二胺四乙酸(ITCBE)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、還原谷胱甘肽(GSH)中的一種；所述載體蛋白選自雞卵清白蛋白(OVA)、牛血清白蛋白(BSA)、匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)中的一種；優(yōu)選的，所述的偶聯(lián)物為Pb2+-1TCBE-OVA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的快速檢測(cè)鉛離子金標(biāo)試紙條，其特征是所述的單克隆抗體是通過(guò)抗原鉛離子與載體蛋白通過(guò)螯合劑形成的偶聯(lián)物采用單克隆抗體技術(shù)制備得到。
4.據(jù)權(quán)利要求3所述的快速檢測(cè)鉛離子金標(biāo)試紙條，其特征在于所述的偶聯(lián)物為Pd2+-1TCBE-OVA,所述的金標(biāo)試紙條通過(guò)包括如下步驟在內(nèi)的方法制備得到: (1)稱(chēng)取20mgOVA溶于ImL ρΗ9.0的HEPES緩沖液(10mM/L)中形成20mg/mL的載體蛋白溶液； (2)稱(chēng)取IOmgITCBE溶于ImL 二甲基亞砜(DMSO)中形成金屬螯合劑溶液； (3)將0.5mL金屬螯合劑溶液逐滴加到OVA載體蛋白溶液中，混勻后，加入IOOul三正丁胺(1.5M)，搖床室溫反應(yīng)24h，制成0VA-1TCBE溶液； (4)取11.25mg硝酸鉛(Pb(NO3)2)溶于IOOul蒸餾水中，形成均勻的Pb2+溶液； (5)將Pb2+溶液加入到0VA-1TCBE溶液中，調(diào)節(jié)pH值至7.4，在室溫下，搖床孵育4h，然后移入透析袋中PBS透析10d，即形成Pb2+-1TCBE-OVA,收集分裝，_20°C凍存； (6)膠體金溶液制備:采用檸檬酸鹽還原法制備，取1000mL三角燒瓶，加入975mL雙蒸水煮沸，加入15mL檸檬酸三鈉繼續(xù)加熱5min,加入IOmLl %氯金酸,繼續(xù)加熱至溶液呈現(xiàn)橘紅色，冷卻至室溫后，4°C保存?zhèn)溆谩? (7)單克隆抗體制備:用鉛離子-螯合劑-載體蛋白免疫小鼠，以Pb2+-1TCBE-OVA為例，說(shuō)明如下:用Pb2+-1TCBE-OVA免疫6周雌性BALB/C小鼠5只，劑量為50 μ g/0.2mL/只，背部皮下分點(diǎn)注射。選擇細(xì)胞融合備用小鼠，間接ELISA檢測(cè)抗血清中Pb2+螯合物pAb效價(jià)，阻斷ELISA檢測(cè)Pb2+-1TCBEpAb對(duì)Pb2+-1TCBE的IC5(I，挑選效價(jià)最高、IC5tl最低的小鼠，超免用于細(xì)胞融合。采用細(xì)胞融合技術(shù)無(wú)菌取脾臟制備脾細(xì)胞，在50% PEG(pH8.0)作用下與NSO骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合；用間接ELISA和阻斷ELISA進(jìn)行陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株的篩選，選擇強(qiáng)陽(yáng)性、抑制率高、細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛的孔進(jìn)行3次有限稀釋克隆化。分別于凍存15d、30d和60d后復(fù)蘇雜交瘤細(xì)胞，培養(yǎng)后取上清液，間接ELISA測(cè)定抗體效價(jià)，考察雜交瘤細(xì)胞分泌單克隆抗體的穩(wěn)定性，獲得一株雜交瘤細(xì)胞株；之后采用體內(nèi)誘生腹水法制備Pb2+-1TCBE-OVAmAb，取8周齡健康Balb/c雌性小鼠，腹腔注射FIA0.5mL/只，10~15天后使用。將培養(yǎng)的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞1000rpm離心IOmin棄上清，收集細(xì)胞沉淀。用滅菌的PBS將細(xì)胞沉淀懸浮、混勻，將細(xì)胞數(shù)調(diào)至106/mL，腹腔注射Balb/C小鼠0.5mL/只；接種細(xì)胞7_10天后產(chǎn)生腹水，進(jìn)行收集，于37°C水浴30min，4°C放置過(guò)夜，12000rpm離心5min，棄去上層的脂肪、IFA和下層的沉淀，飽和硫酸銨鹽析法提純后測(cè)定IgG含量和效價(jià)，_20°C保存?zhèn)溆茫? (8)金標(biāo)抗體制備:將待標(biāo)單克隆抗體溶液10000r/min離心30min,用0.lmol/L K2CO3溶液調(diào)節(jié)膠體金溶液的PH值至8.2 ;根據(jù)聚沉現(xiàn)象，確定鉛離子-螯合劑-載體蛋白mAb與膠體金溶液最適標(biāo)記濃度，Pb2+-1TCBE-OVAmAb為0.175mg/mL。取膠體金溶液10mL，用`0.lmol/L K2CO3溶液調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH值至8.2。取等量的濃度為0.175mg/mL單克隆抗體溶液，磁力攪拌下混合，室溫孵育15min, 10000r/min離心30min,棄上清,沉淀物用`0.02mol/LNa2B407 溶液(含 10g/L OVA,0.5g/L 疊氮鈉)稀釋?zhuān)?°C保存?zhèn)溆茫? (9)金標(biāo)抗體結(jié)合墊制備:裁取規(guī)格為20X 4mm的玻璃纖維棉,將金標(biāo)抗體用X_only單向噴點(diǎn)儀均勻噴灑于玻璃纖維棉上，37°C干燥lh，密封，4°C保存?zhèn)溆茫? (10)硝酸纖維素膜上檢測(cè)線(xiàn)、質(zhì)控線(xiàn)制備:將濃度為lmg/ml的鉛離子-螯合劑-載體蛋白放于X-only單向噴點(diǎn)儀貯存池A，濃度為lmg/ml的RaMIgG(GaMIgG)放于貯存池B，開(kāi)機(jī)分別點(diǎn)射于膜中央，形成間距0.5cm的檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)，自然干燥，密封，4°C保存?zhèn)溆茫? (11)金標(biāo)試紙條組裝:將樣品墊、金標(biāo)抗體結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊按順序依次粘貼于支撐板上，并在樣品墊與金標(biāo)抗體結(jié)合墊表面粘貼MAX線(xiàn)，在切槽機(jī)上切割成寬度4mm的金標(biāo)試紙。
5.根據(jù)權(quán)利要求1~4所述的快速檢測(cè)鉛離子金標(biāo)試紙條，檢測(cè)線(xiàn)上鉛離子-螯合劑-載體蛋白的包被量為I μ L/cm，載體蛋白濃度為lmg/mL。
6.根據(jù)權(quán)利要求1~4所述的快速檢測(cè)鉛離子金標(biāo)試紙條，其特征是:所述質(zhì)控線(xiàn)上RaMIgG (或 GaMIgG)的包被量為 I μ L/cm, RaMIgG (或 GaMIgG)的濃度為 lmg/mL。
7.根據(jù)權(quán)利要求1~4所述的快速檢測(cè)鉛離子金標(biāo)試紙條，其特征是:所述的膠體金溶液中金顆粒的粒徑為30nm`,標(biāo)記量為ImL膠體金:3ng單克隆抗體。`
8.用于檢測(cè)鉛離子的金標(biāo)試紙卡，其特征在于:所述試紙卡是以權(quán)利要求1-7任意一項(xiàng)所述的快速檢測(cè)鉛離子金標(biāo)試紙條為基礎(chǔ)，加上外卡制成。
9.一種如權(quán)利要求1~7所述的快速檢測(cè)鉛離子金標(biāo)試紙條或權(quán)利要求8所述的用于檢測(cè)鉛離子的金標(biāo)試紙卡在環(huán)境、土壤、水、食品、化妝產(chǎn)品或藥物中鉛離子污染殘留快速檢測(cè)中的應(yīng)用，優(yōu)選的，所述的檢測(cè)用于檢測(cè)鉛離子含量在10ng/mL的樣品。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征是:樣品預(yù)處理方法是樣品消解后，采用10%EDTA作為螯合劑處理溶液，離心取上清液用于檢測(cè)。
【文檔編號(hào)】G01N33/544GK103487577SQ201310445840
【公開(kāi)日】2014年1月1日 申請(qǐng)日期:2013年9月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月27日
【發(fā)明者】葛亞明, 王自良, 范國(guó)英, 王愛(ài)萍, 張海棠, 張慧輝 申請(qǐng)人:河南科技學(xué)院