一種不對稱菁染料化合物及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種不對稱菁染料化合物（I），及其作為淬滅劑的應(yīng)用。本發(fā)明提供的不對稱菁染料的熒光淬滅劑化合物，可有效淬滅FAM的熒光，同時可以對穩(wěn)定DNA雙鏈，使PCR過程中解鏈溫度增加2～3℃，不但可以應(yīng)用于常規(guī)的實時熒光定量PCR檢測方法，而且可以有效地使用在針對單核苷酸多態(tài)性分析領(lǐng)域。
【專利說明】一種不對稱菁染料化合物及其應(yīng)用
(-)【技術(shù)領(lǐng)域】[0001]本發(fā)明涉及一種在FRET中作為淬滅劑使用的化合物，更進一步而言，本發(fā)明涉及作為淬滅劑的菁染料化合物，試劑及其在FRET中的應(yīng)用。
(二)【背景技術(shù)】
[0002]核酸雜交技術(shù)是分子生物學(xué)的基本技術(shù)之一，可以用來對遺傳疾病進行診斷，人體鑒定，微生物鑒定，親子鑒定，近年來正逐漸用于病毒的特異，敏感和快速診斷。
[0003]核酸雜交技術(shù)一個很重要的方面是對雜交的探測，一個經(jīng)常使用的工具是熒光寡核苷酸探針，一種特別有用的熒光探針類型是自淬滅探針，此探針包括了報告染料和淬滅染料，二者之間通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)過程發(fā)生作用。盡管使用該基序的不同探針的設(shè)計可能在細節(jié)上存在差異，F(xiàn)RET探針含有連接到寡核苷酸上的熒光團和淬滅劑。
[0004]實時熒光定量PCR技術(shù)通過檢測PCR產(chǎn)物中熒光信號強度來達到定量的目的，該技術(shù)不僅實現(xiàn)了 PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點，目前已在動植物基因工程，微生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用。
[0005]熒光染料廣泛用于生物學(xué)研究和診斷，熒光染料優(yōu)于常規(guī)的放射性材料，因為熒光染料通常具有足夠的檢測靈敏度，廉價并且無毒，具有可區(qū)分顏色范圍的各種熒光團使得能平行檢測多種生物學(xué)靶標(biāo)的多重實驗更加可行，在體外和體內(nèi)描述不同生物學(xué)靶標(biāo)之間在空間和時間上的關(guān)系常要求能平行顯示多個靶標(biāo)。此外，大量熒光染料為進行高通量和自動化試驗打開了新的通道。而在基于DNA的FRET檢測中，F(xiàn)AM以其完美匹配的光源，廉價的成本，高度的穩(wěn)定性，較高的量子產(chǎn)率成為各種檢測中最常用的報告染料，特別是在實時熒光定量PCR技術(shù)中的應(yīng)用更加廣泛。
[0006]而作為與FAM相匹配的淬滅基團，目前大部分為偶氮染料淬滅劑，即暗淬滅劑，這類淬滅劑不占據(jù)發(fā)射帶寬。并且大部分能夠多路復(fù)用。一種典型的暗淬滅劑是DABCYL(4-[[4- (二甲氨基)_苯基]-偶氮基]-苯甲酸)，它常常與分子信標(biāo)聯(lián)用。DABCYL在380~530nm的范圍內(nèi)淬滅染料。因此，即使具有較長發(fā)射的熒光團(例如Cy3_染料)也可被DABCYL更好的淬滅。然而，DABCYL具有不適當(dāng)?shù)奈兆V帶，與在488nm以上發(fā)射的熒光團的重疊非常差。又一種非熒光染料為Eclipse淬滅劑(4-[ [2-氯-4-硝基-苯基]-偶氮基]-苯胺，Epoch Biosciences, Inc.)它在530nm處吸收最大，并且有效淬滅從520nm到670nm的光譜。
[0007]對上述暗淬滅劑的一種改進為Black Hole淬滅劑，例如BHQ-1 ([4-(2-硝基-4-甲基-苯基)-偶氮基]-基-((2-甲氧基-5-甲基-苯基)_偶氮基))-苯胺)(為BiosearchTechnologies, Inc.)，它能夠淬滅可見光譜，這些非熒光常用作熒光受體的替代物，目的是為了降低背景熒光并以此提高靈敏度。
[0008]然而，已知的非熒光淬滅劑的缺點是其淬滅功效不足，這導(dǎo)致了高背景信號，進而又導(dǎo)致了信號動力學(xué)特征受到限制。(三)
【發(fā)明內(nèi)容】
[0009]本發(fā)明的目的是提供新的淬滅劑，其具有低背景信號和/或高淬滅功效。本發(fā)明提供一種不對稱菁染料的熒光淬滅劑化合物，可有效淬滅FAM的熒光，令人意想不到的是，而且此種菁染料化合物顯示出與未淬滅前相似的與DNA結(jié)合的功效，即可以穩(wěn)定DNA雙鏈，這樣就可以PCR過程中解鏈溫度增加，即Tm值升高。
[0010]本發(fā)明涉及下式I的化合物:
[0011]一種不對稱菁染料化合物，其結(jié)構(gòu)如式(I)所示:
【權(quán)利要求】
1.一種不對稱菁染料化合物，其結(jié)構(gòu)如式(I)所示:
2.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，所述活性基團為下列之一:羧酸，羧酸的丁二酰亞胺酯，肼，胺，馬來酰亞胺，亞磷酰胺。
3.如權(quán)利要求1所述的不對稱菁染料化合物，其特征在于所述化合物為下列之一:城脊(11)
4.權(quán)利要求1所述的不對稱菁染料化合物作為熒光淬滅劑的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要 求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述淬滅劑為FAM通道淬滅劑。
【文檔編號】G01N33/52GK103554096SQ201310467180
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月9日
【發(fā)明者】李輝, 金大智, 方維佳, 王堯, 柯炳欣 申請人:上海輝睿生物科技有限公司, 浙江省疾病預(yù)防控制中心, 浙江大學(xué)