一種基于酪胺信號放大技術(shù)和適配體識別的金黃色葡萄球菌可視化檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種基于酪胺信號放大技術(shù)和適配體識別的金黃色葡萄球菌可視化檢測方法，本發(fā)明涉及到分子生物學(xué)和微生物學(xué)的方法及技術(shù)，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。其方法主要是利用生物素標(biāo)記的金黃色葡萄球菌的適配體能夠特異性的識別和結(jié)合金黃色葡萄球菌，從而實現(xiàn)對菌體的捕獲，通過親和素與生物素的結(jié)合將菌體固定到包被鏈霉親和素的酶標(biāo)板的底部，然后再將生物素標(biāo)記的適配體和Streptavidin-HRP的復(fù)合物固定到菌體表面。在H2O2的作用下，HRP催化沉積生物素-酪胺分子沉積在HRP周圍的位點上，這時體系中再次加入Streptavidin-HRP，通過生物素與鏈霉親和素的結(jié)合而導(dǎo)致HRP大量的結(jié)合在菌體上，從而使信號實現(xiàn)幾何級的放大。本方法建立的方法能夠?qū)瘘S色葡萄球菌實現(xiàn)快速、靈敏、準(zhǔn)確的檢測，對于食品安全有著重要的意義。
【專利說明】一種基于酪胺信號放大技術(shù)和適配體識別的金黃色葡萄球菌可視化檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明主要是通過金黃色葡萄球菌適配體對金黃色葡萄球菌的特異性識別，并且通過酪胺信號放大的方法來實現(xiàn)可視化檢測的。本發(fā)明涉及到分子生物學(xué)和微生物學(xué)的方法及技術(shù)，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]近些年來，食品質(zhì)量與安全越來越引起人們的關(guān)注，并逐漸成為了一個社會焦點和熱點問題，這其中由食源性致病菌引起的食品安全問題還是比較多的。金黃色葡萄球菌是一種革蘭氏陽性菌，它會產(chǎn)生一些對人體有毒的物質(zhì)，比如毒素、酶和一些菌體成分。根據(jù)美國疾病預(yù)防與控制中心的統(tǒng)計，由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒，占到整個細(xì)菌性食物中毒病例的33%，位居第二位，而加拿大則高達(dá)45 %。因此研究一種能夠?qū)瘘S色葡萄球菌實現(xiàn)快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)、可靠的檢測方法是非常有必要的。但是一些傳統(tǒng)的檢測方法由于在特異性、靈敏度和操作方面存在著各種缺陷，無法滿足人們對于食品安全的要求。
[0003]適配體是一種具有能夠與靶分子高親和性和特異性結(jié)合的一段DNA或RNA序列，這些靶分子包括一些藥物、蛋白和其他有機(jī)、無機(jī)小分子，它是利用體外篩選技術(shù)一指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(systematic evolution of ligands by exponentialenrichment, SELEX)，從含有IO13-1O15不同隨機(jī)序列的DNA或RNA核酸分子文庫中得到的寡核苷酸片段。此外由于適配體具有穩(wěn)定、容易合成和進(jìn)行化學(xué)修飾等優(yōu)點，因此，適配體被廣泛的應(yīng)用于分析檢測、疾病的診斷和治療等方面，并且適配體在生物、化學(xué)及醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域有著十分重要的應(yīng)用前景。
[0004]酪胺信號放大(TSA)技術(shù)是一種基于辣根過氧化物酶(HRP)催化的生物信號放大技術(shù)，其原理是在HRP酶催化下，大量連接半抗原的酪胺分子的沉積，這些半抗原主要是生物素、熒光光素等小分子物質(zhì)。目前TSA技術(shù)在分子原位雜交、ELISA、分析檢測、疾病診斷等方面有著十分廣泛的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]鑒于現(xiàn)有檢測技術(shù)在檢測的靈敏度、檢測時間以及特異性上存在的缺陷，本發(fā)明主要是針對這些缺陷，提供了一種快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高的可視化檢測金黃色葡萄球菌的新方法。
[0006]本發(fā)明的優(yōu)點:
[0007](I)由于金黃色葡萄球菌適配體能夠高親和力和特異性的與靶物質(zhì)結(jié)合，因此本方法具有較高的特異性。
[0008](2)本發(fā)明中所涉及的各種試劑廉價易得，節(jié)省了實驗成本，并且實驗的操作步驟比較簡單，因此，本發(fā)明在成本及實驗操作具有優(yōu)勢。
[0009](3)本發(fā)明對金黃色葡萄球菌的檢測限比較低，達(dá)到了 8cfu / mL ;而且檢測范圍較大，在IO7-1Ocfu / mL范圍內(nèi)線性良好(R2=0.9976)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1是特異性實驗；a.金黃色葡萄球菌，b.鼠傷寒沙門氏菌，c.副溶血性弧菌，d.化膿鏈球菌，e.阪崎桿菌，f.大腸桿菌，g.單增李斯特菌。
[0011]圖2是標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0012]圖3是酪胺放大技術(shù)在本實驗中的作用；a.未應(yīng)用酪胺信號放大技術(shù)的檢測方法，b.本方法
[0013]圖4是本方法與傳統(tǒng)平板計數(shù)法的相關(guān)性實驗。
[0014]實驗步驟:
[0015]1、合成生物素修飾的金黃色葡萄球菌適配體(上海生工生物工程股份有限公司完成)。
[0016]生物素修飾的適配體:5’-biotin-C6-GCAATG GTA CGG TAC TTC CTC GGC ACG TTCTCA GTA GCG CTC GCT GGT CAT CCC ACA GCT ACG TCA MA GTG CAC GCT ACT TTG CTM-3’。
[0017]2、制備生物素-酪胺。
[0018]準(zhǔn)確稱取IOmg Bio-NHS,溶于ImL DMF中制成溶液A ;稱取2.8mg的酪胺鹽酸，溶于0.28mL DMF中，然后加入2.8 μ L的三乙胺，制成溶液B ;將溶液A與溶液B充分震蕩混勻，然后在室溫下避光反應(yīng)2h，加入8.72mL無水乙醇，從而制得IOmL生物素-酪胺溶液，并于4°C環(huán)境避光保存。
[0019]3、親和素包被酶標(biāo)板
[0020]將親和素(lmg/mL)用碳酸鹽包被液(Na2CO30.16g，NaHCO30.29g，IOOmL H2O:ρΗ9.6)按1:100稀釋，每孔包被200yL，置于4°C環(huán)境，12h，拍干，用I XPBST (I XPBS緩沖液+0.05% (v / V)吐溫20)洗滌3次，每次I分鐘，拍干。
[0021]4、牛血清蛋白(BSA)封閉酶標(biāo)板
[0022]每孔加入10(^1^1%85八溶液，371:搖床301^11，拍干，用I XPBST洗滌3次，拍干。
[0023]5、每孔加入10 μ L濃度為10-6πιο1 / L的生物素修飾的金黃色葡萄球菌適配體，37°C搖床30min，拍干，用I XPBST洗滌3次，每次I分鐘，拍干。
[0024]6、每孔加入100μ L的樣品，37°C搖床30min。同時將生物素修飾的金黃色葡萄球菌的適配體與鏈霉親和素標(biāo)記的HRP(StaptaVidin-HRP)按4:1的比例混勻，37°C孵育30min，拍干，用I XPBST洗滌3次，每次I分鐘，拍干。
[0025]7、每孔加入10 μ L生物素修飾的適配體和Str印tavidin-HRP的復(fù)合物，37°C搖床30min，拍干，用I XPBST洗滌5次，每次I分鐘，拍干。
[0026]8、取10 μ L生物素-酪胺溶液，加到酶標(biāo)板中，然后再加入5 μ L0.5% (v / V)的過氧化氫(H2O2), 37。。孵育30min，拍干，用I XPBST洗滌3次，每次I分鐘，拍干。
[0027]9、在酶標(biāo)板的每個微孔中加入IOyL的Streptavidin-HRP, 37 °C孵育30min,拍干，用I XPBST洗滌5次，每次I分鐘，拍干。
[0028]10、最后在每孔中加入100 μ LTMB顯色試劑，室溫放置20min后，加入50 μ L的終止液。
[0029]11、酶標(biāo)儀檢測吸光度值[0030]將酶標(biāo)板置于酶標(biāo)儀中，檢測樣品在450nm波長處的吸光度值。根據(jù)450nm處的吸光度值計算相應(yīng)的金黃色葡萄球菌的數(shù)量。
【具體實施方式】:
[0031]以下結(jié)合說明書附圖和實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但不是限制本發(fā)明。
[0032]實施例1:應(yīng)用基于酪胺信號放大和適配體識別的金黃色葡萄球菌可視化檢測方法檢測水樣
[0033]樣品的處理:
[0034]本實驗所選取的水樣均采自于蠡湖，將3份水樣室溫下靜置30min，從而將其中較大的團(tuán)聚物和懸浮物沉淀，然后IOOOOrpm / min離心20min,再用0.45 μ m的濾膜過濾上清，以去除其中較小的懸浮物，防止其對本實驗造成干擾；然后121°C滅菌處理20min。
[0035]應(yīng)用本方法和傳統(tǒng)的平板計數(shù)法對樣品進(jìn)行檢測:
[0036]將過夜培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌菌液用0.9%的生理鹽水做梯度稀釋，然后將稀釋后的不同菌液加到已處理過的水樣中；分別取100 μ L不同濃度的水樣進(jìn)行平板計數(shù)，另取100 μ L不同濃度的菌液采用本實驗的方法進(jìn)行檢測，將得到的檢測結(jié)果與平板計數(shù)法所得到的結(jié)果進(jìn)行比較。實驗結(jié)果如附圖4.
【權(quán)利要求】
1.一種基于酪胺信號放大技術(shù)和適配體識別的金黃色葡萄球菌可視化檢測方法，其特征在于:通過生物素修飾的金黃色葡萄球菌適配體將樣品中的金黃色葡萄球菌捕獲并將其固定到鏈霉親和素包被的酶標(biāo)板底部，另一條生物素標(biāo)記的金黃色葡萄球菌的適配體將鏈霉親和素標(biāo)記的HRP(Streptavidin-HRP)引入檢測體系中,然后經(jīng)過酪胺信號放大技術(shù)使信號實現(xiàn)幾何級的放大，最后加入TMB顯色試劑和終止液，利用酶標(biāo)儀檢測吸光度值，基于此建立檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線，達(dá)到檢測金黃色葡萄球菌的目的。
2.如權(quán)利要求1所述的一種基于酪胺信號放大技術(shù)和適配體識別的金黃色葡萄球菌可視化檢測方法，其特征在于生物素-酪胺的制備:準(zhǔn)確稱取IOmg Bio-NHS,溶于ImL DMF中制成溶液A ;稱取2.8mg的酪胺鹽酸，溶于0.28mLDMF中，然后加入2.8 μ L的三乙胺，制成溶液B ;將溶液A與溶液B充分震蕩混勻，然后在室溫下避光反應(yīng)2h，加入8.72mL無水乙醇，從而制得IOmL生物素-酪胺溶液，并于4°C環(huán)境避光保存。
3.如權(quán)利要求1所述的一種基于酪胺信號放大技術(shù)和適配體識別的金黃色葡萄球菌可視化檢測方法，其特征在于酪胺信號放大技術(shù):將生物素標(biāo)記的金黃色葡萄球菌的適配體與鏈霉親和素標(biāo)記的HRP (Sti^ptavidin-HRP)按4:1的比例混勻，37°C孵育30min，每孔加入10 μ L的適配體和Str印tavidin-HRP的復(fù)合物，取10 μ L的生物素-酪胺溶液，加到酶標(biāo)板中，然后再加入5 μ L0.5% (V / V)的過氧化氫(H2O2)，37°C孵育30min，在酶標(biāo)板的每個微孔中加入 10 μ L 的 St`reptavidin-HRP, 37°C孵育 30min。
【文檔編號】G01N21/31GK103513033SQ201310473852
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年10月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月11日
【發(fā)明者】王周平, 袁京磊, 何良興, 茹巧美 申請人:江南大學(xué), 杭州市余杭區(qū)農(nóng)產(chǎn)品監(jiān)測中心