一種檢測(cè)桃蚜抗藥性的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種檢測(cè)桃蚜抗藥性的方法，其是在診斷劑量下采用酶標(biāo)儀動(dòng)力學(xué)法檢測(cè)桃蚜田間種群個(gè)體對(duì)有機(jī)磷或氨基甲酸酯類殺蟲藥劑的抗藥性，所述有機(jī)磷殺蟲藥劑為氧化樂(lè)果，氨基甲酸酯類殺蟲藥劑為抗蚜威；氧化樂(lè)果的診斷劑量為180.43μM，抗蚜威的診斷劑量為18.85μM。
【專利說(shuō)明】一種檢測(cè)桃蚜抗藥性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種對(duì)農(nóng)業(yè)害蟲抗藥性進(jìn)行監(jiān)測(cè)的測(cè)定技術(shù)方法，具體地說(shuō)，是以診斷劑量檢測(cè)桃蚜對(duì)有機(jī)磷和氨基甲酸酯類兩大系列殺蟲藥劑抗藥性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]桃蚜是世界上分布最廣最為重要的害蟲之一，可以在50多個(gè)科400多種植物上取食，不僅能夠直接刺吸植物營(yíng)養(yǎng)，造成植物嚴(yán)重失水和營(yíng)養(yǎng)不良，還可以傳播病毒，對(duì)植物造成更大的間接傷害，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。長(zhǎng)期以來(lái)，對(duì)桃蚜的防治主要以化學(xué)防治為主，由于化學(xué)殺蟲劑的大量、持續(xù)及不合理使用，致使許多國(guó)家和地區(qū)的桃蚜對(duì)常用殺蟲劑產(chǎn)生了不同程度的抗藥性。
[0003]乙酰膽堿酯酶作為神經(jīng)系統(tǒng)膽堿激性傳導(dǎo)的重要組分，主要功能是快速水解神經(jīng)傳遞介質(zhì)一乙酰膽堿。以乙酰膽堿酯酶為分子靶標(biāo)發(fā)展了有機(jī)磷和氨基甲酸酯類兩大系列的殺蟲藥劑。昆蟲乙酰膽堿酯酶基因在這兩類藥劑的脅迫作用下，發(fā)生變異后會(huì)導(dǎo)致抗藥性的產(chǎn)生。
[0004]桃蚜抗藥性的形成和發(fā)展給化學(xué)防治造成了很大困難，如何快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)桃蚜抗藥性水平是非常重要的?，F(xiàn)在用于抗藥性監(jiān)測(cè)的方法主要包括傳統(tǒng)的生物測(cè)定、生化檢測(cè)法、免疫學(xué)方法以及分子生物學(xué)方法，其中生化檢測(cè)方法是簡(jiǎn)單快速準(zhǔn)確反映靶標(biāo)酶變異情況的檢測(cè)方法。
[0005]現(xiàn)有技術(shù)利用生化方法測(cè)定桃蚜抗藥性，一般采用分光光度計(jì)，測(cè)定群體比活力，這種方法不但用蟲量大，而且操作程序復(fù)雜。本發(fā)明采用酶標(biāo)儀法，利用診斷劑量可快速診斷桃蚜個(gè)體抗性水平，用蟲量少，通過(guò)個(gè)體抗性水平了解種群抗性水平，簡(jiǎn)化操作，儀器自動(dòng)化讀數(shù)精確，可以同時(shí)了解個(gè)體及種群抗性水平，診斷劑量的應(yīng)用，可以快速準(zhǔn)確區(qū)別抗性水平高低的個(gè)體，從而了解種群抗性水平，指導(dǎo)田間用藥。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)桃蚜抗藥性的方法，其是在診斷劑量下采用酶標(biāo)儀動(dòng)力學(xué)法檢測(cè)桃蚜田間種群個(gè)體對(duì)有機(jī)磷或氨基甲酸酯類殺蟲藥劑的抗藥性。
[0007]所述有機(jī)磷殺蟲藥劑為氧化樂(lè)果，氨基甲酸酯類殺蟲藥劑為抗蚜威；所述診斷劑量氧化樂(lè)果為180.43 μ Μ,抗蟲牙威為18.85 μ Μ。
[0008]進(jìn)一步地，氧化樂(lè)果和抗蚜威的診斷劑量的獲得是通過(guò)選用室內(nèi)選育的敏感種群；采用酶標(biāo)儀動(dòng)力學(xué)法，分別測(cè)定氧化樂(lè)果和抗蚜威對(duì)敏感種群AChE的抑制曲線；根據(jù)測(cè)定的抑制曲線，計(jì)算氧化樂(lè)果和抗蚜威抑制該敏感種群90%AChE活性的濃度，即IC9tl,作為氧化樂(lè)果和抗蚜威AChE的診斷劑量。
[0009]所述室內(nèi)敏感種群為田間采集桃蚜種群，室內(nèi)單頭飼養(yǎng)反選多代后獲得。
[0010]更為具體地，上述確定氧化樂(lè)果和抗蚜威的診斷劑量的具體步驟包括:
[0011](I)桃蚜室內(nèi)敏感種群的飼養(yǎng):桃蚜田間種群室內(nèi)單頭飼養(yǎng)反選多代，獲得敏感種群。
[0012](2)丙酮稀釋抑制劑為不同的濃度梯度:所述抑制劑為氧化樂(lè)果和抗蚜威。
[0013](3)緩沖液的配制:pH7.5,0.1M的磷酸緩沖液。
[0014](4)底物ATChI的配制:母液濃度2.5mM，底物終濃度為0.5mM，保存于4°C冰箱中，備用。
[0015](5)顯色劑DTNB的配制:母液濃度37.5 μ M，顯色劑終濃度為15“11，保存于41:冰箱中，備用。
[0016](6)酶液的制備:挑選120頭無(wú)翅成蚜，加入2mL磷酸緩沖液，使用勻漿器冰浴勻漿，酶液10800g，4°C離心15min，之后將離心上清液稀釋定容至24mL。
[0017](7) 96孔酶標(biāo)板中加入50 μ L步驟(6)制備的酶液。
[0018](8)將步驟(2)稀釋好的各濃度抑制劑50yL、步驟(4)配置的底物ATChI50yL以及步驟(5)中的顯色劑DTNB100 μ L混合均勻后加入到步驟(7)對(duì)應(yīng)有酶液的孔中，輕輕混勻。
[0019](9)將步驟(8)的酶標(biāo)板405nm動(dòng)力學(xué)測(cè)定15min,測(cè)定氧化樂(lè)果和抗姆威對(duì)敏感種群AChE的抑制曲線。
[0020]( 10)根據(jù)測(cè)定的抑制曲線，計(jì)算氧化樂(lè)果和抗蚜威對(duì)該敏感種群的IC9tl,作為氧化樂(lè)果和抗蚜威AChE的診斷劑量。
[0021]其中，步驟(2)中的抑制劑的稀釋用含0.05%Triton的磷酸緩沖液，稀釋至7?8個(gè)濃度梯度。
[0022]其中，步驟(4)和步驟(5)中底物和顯色劑的配置均用步驟(3)制備的磷酸緩沖液配制。
[0023]其中，步驟(6)用于勻漿的勻漿器及緩沖液需提前冰浴5min。
[0024]其中，步驟(6)中制備酶液的緩沖液為步驟(3)制備的含0.05%Triton的ρΗ7.5，
0.1M的磷酸緩沖液。
[0025]其中，步驟(8)中最終反應(yīng)體系中丙酮含量不超過(guò)0.5%。
[0026]本發(fā)明的有益效果在于:
[0027]本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)單，使用酶標(biāo)儀精細(xì)數(shù)據(jù)，所得數(shù)據(jù)更加真實(shí)可靠，用蟲量少，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)生化方法用蟲量大的問(wèn)題，可在快速診斷桃蚜個(gè)體抗性水平的基礎(chǔ)上有效區(qū)分敏感和抗性個(gè)體及種群。因此，利用本專利的診斷劑量，可快速精確區(qū)分敏感及抗性個(gè)體及種群。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0028]圖1為加樣后的96孔板。
[0029]圖2為抗蚜威對(duì)敏感種群AChE抑制曲線。
[0030]圖3為氧化樂(lè)果對(duì)敏感種群AChE抑制曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0031]以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
[0032]實(shí)施例1診斷劑量的獲得[0033]1.研究對(duì)象
[0034]此專利的研究對(duì)象為實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)反選多代的桃蚜敏感種群。
[0035]2.方法
[0036]供試藥劑抗蚜威、氧化樂(lè)果，采用酶標(biāo)儀動(dòng)力學(xué)測(cè)定方法，得出抗蚜威和氧化樂(lè)果抑制曲線及對(duì)應(yīng)診斷劑量(ic9(l)。
[0037]2.1供試桃蚜樣本的采集及處理
[0038]挑選室內(nèi)敏感品系無(wú)翅成蚜120頭于1.5ml離心管中，液氮速凍后用于酶液的制備。
[0039]2.2反應(yīng)試劑的配制
[0040]pH7.5,0.1M的磷酸緩沖液，2.5mM的底物ATChI，37.5 μ M的顯色劑DTNB，其中底物和顯色劑需保存于4°C的冰箱中。
[0041]2.3酶液的制備
[0042]用2.1中的桃蚜樣本，加入2mL磷酸緩沖液，冰浴勻漿(其中勻漿器及緩沖液需預(yù)冷5min)，酶液10800g，4°C離心15min，將離心上清液稀釋定容至24mL。
[0043]2.4酶標(biāo)儀動(dòng)力學(xué)測(cè)定
[0044]將2.3制備的酶液加入96孔酶標(biāo)板中，每孔50 μ L，對(duì)應(yīng)加入事先混勻的50yLATChI+50yL抑制劑+IOOyL DTNB，抑制劑濃度為7-8個(gè)梯度濃度，反應(yīng)總體系250 μ L0所述抑制劑為抗蚜威或氧化樂(lè)果。
[0045]其中，底物ATChI終濃度0.5mM,顯色劑DTNB終濃度15 μ Μ，丙酮含量不超過(guò)0.5%。將加好樣品的酶標(biāo)板在405nm下,讀數(shù)15min。
[0046]繪制抑制劑的抑制曲線。抗蚜威的抑制曲線如圖2所示；氧化樂(lè)果的抑制曲線如圖3所示。
[0047]2.5診斷劑量
[0048]根據(jù)2.4獲得的抑制曲線，分別求出抗蚜威和氧化樂(lè)果對(duì)敏感品系的IC9tl,即診斷劑量，該診斷劑量可用于檢測(cè)桃蚜田間種群個(gè)體AChE變異情況。
[0049]以抑制該種群AChE活性90% (IC9tl)抗蚜威和氧化樂(lè)果的濃度作為診斷劑量，氧化樂(lè)果的診斷劑量為180.43 μ Μ，抗蚜威的診斷劑量為18.85 μ Μ。以該診斷劑量檢測(cè)桃蚜田間種群，AChE活性抑制率超過(guò)90%的個(gè)體為敏感個(gè)體，AChE活性抑制率低于90%的個(gè)體為抗性個(gè)體。在此基礎(chǔ)上統(tǒng)計(jì)種群抗性個(gè)體百分率，從而了解被測(cè)種群抗性水平。
[0050]實(shí)施例2診斷劑量對(duì)桃姆抗藥性檢測(cè)
[0051]具體操作:
[0052]1.供試桃蚜樣本的采集及處理
[0053]挑選待測(cè)種群?jiǎn)晤^無(wú)翅成蚜于1.5ml離心管中，液氮速凍后用于酶液的制備，每個(gè)待測(cè)種群至少測(cè)定100頭。
[0054]2.反應(yīng)試劑的配制
[0055]pH7.5,0.1M的磷酸緩沖液，2.5mM的底物ATChI，37.5 μ M的顯色劑DTNB，其中底物和顯色劑需保存于4°C的冰箱中。
[0056]3.酶液的制備
[0057]用I中的桃蚜樣本，加入200 μ I磷酸緩沖液，冰浴勻漿(其中勻漿器及緩沖液需預(yù)冷 5min),酶液 10800g,4°C離心 15min。
[0058]4.酶標(biāo)儀動(dòng)力學(xué)測(cè)定
[0059]將3制備的酶液加入96孔酶標(biāo)板中，每孔50 μ L，對(duì)應(yīng)加入事先混勻的50 μ LATChI+50 μ L抑制劑+100 μ L DTNB,反應(yīng)總體系250 μ L，其中對(duì)照中以緩沖液代替抑制劑。所述抑制劑為抗蚜威或氧化樂(lè)果。
[0060]其中，底物ATChI終濃度0.5mM,顯色劑DTNB終濃度15 μ Μ，丙酮含量不超過(guò)0.5%。將加好樣品的酶標(biāo)板在405nm下,讀數(shù)15min。
[0061]5.數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析
[0062]利用本
【發(fā)明內(nèi)容】
獲得的氧化樂(lè)果及抗蚜威的診斷劑量檢測(cè)田間種群不同桃蚜個(gè)體AChE抑制率，頭驗(yàn)結(jié)果如表1所不:
[0063]表1氧化樂(lè)果及抗蚜威的診斷劑量檢測(cè)田間種群不同桃蚜個(gè)體AChE抑制率
[0064]
【權(quán)利要求】
1.一種檢測(cè)桃蚜抗藥性的方法，在診斷劑量下采用酶標(biāo)儀動(dòng)力學(xué)法檢測(cè)桃蚜田間種群個(gè)體對(duì)有機(jī)磷或氨基甲酸酯類殺蟲藥劑的抗藥性，其特征在于，所述有機(jī)磷殺蟲藥劑為氧化樂(lè)果，氨基甲酸酯類殺蟲藥劑為抗蚜威；所述診斷劑量氧化樂(lè)果為180.43 μ M，抗蚜威為18.85 μ Mo
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，氧化樂(lè)果和抗蚜威的診斷劑量的獲得是通過(guò)選用室內(nèi)選育的敏感種群；采用酶標(biāo)儀動(dòng)力學(xué)法，分別測(cè)定氧化樂(lè)果和抗蚜威對(duì)敏感種群乙酰膽堿酯酶(AChE)的抑制曲線；根據(jù)測(cè)定的抑制曲線，計(jì)算氧化樂(lè)果和抗蚜威抑制該敏感種群90%AChE活性的濃度，作為氧化樂(lè)果和抗蚜威AChE的診斷劑量。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述室內(nèi)敏感種群為田間采集桃蚜種群，室內(nèi)單頭飼養(yǎng)反選多代后獲得。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，氧化樂(lè)果和抗蚜威的診斷劑量是通過(guò)如下步驟確定的: (1)桃蚜室內(nèi)敏感種群的飼養(yǎng):桃蚜田間種群室內(nèi)單頭飼養(yǎng)反選多代，獲得敏感種群。 (2)用丙酮配置抑制劑母液，用0.05%Triton X-100磷酸鹽緩沖液稀釋抑制劑母液到不同的濃度梯度:所述抑制劑為氧化樂(lè)果和抗蚜威。 (3)緩沖液的配制:pH7.5,0.1M的磷酸緩沖液。 (4)底物ATChI的配制:母液濃度2.5mM，底物終濃度為0.5mM，保存于4°C冰箱中，備用。 (5)顯色劑DTNB的配制:母液濃度37.5 μ Μ，顯色劑終濃度為15 μ Μ，保存于4°C冰箱`中，備用。 (6)酶液的制備:挑選120頭無(wú)翅成蚜，加入2mL磷酸緩沖液，使用勻漿器冰浴勻漿，酶液10800g，4°C離心15min，之后將離心上清液稀釋定容至24mL。 (7)96孔酶標(biāo)板中加入50μ L步驟(6)制備的酶液。 (8)將步驟(2)稀釋好的各濃度抑制劑50111^步驟(4)配置的底物410115(^1^以及步驟(5)中的顯色劑DTNBlOOy L混合均勻后加入到步驟(7)對(duì)應(yīng)有酶液的孔中，輕輕混勻。 (9)將步驟(8)的酶標(biāo)板405nm動(dòng)力學(xué)測(cè)定15min，測(cè)定氧化樂(lè)果和抗蚜威對(duì)敏感種群AChE的抑制曲線。 (10)根據(jù)測(cè)定的抑制曲線，計(jì)算氧化樂(lè)果和抗蚜威對(duì)該敏感種群的IC9tl,作為氧化樂(lè)果和抗蚜威AChE的診斷劑量。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(2)中的抑制劑的稀釋用含Triton的磷酸緩沖液，稀釋至7~8個(gè)濃度梯度。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(3)配制的緩沖液為含0.05%Triton的pH7.5,0.1M的磷酸緩沖液。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(4)和步驟(5)中底物和顯色劑的配置均用步驟(3)制備的不含Triton的磷酸緩沖液配制。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(6)用于勻漿的勻漿器及緩沖液需提前冰浴5min。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(6)中制備酶液的緩沖液為步驟(3)制備的含0.05%Triton的pH7.5,0.1M的磷酸緩沖液。
10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(8)中最終反應(yīng)體系中丙酮含量不超過(guò)0.5%ο`
【文檔編號(hào)】G01N33/53GK103499684SQ201310476077
【公開日】2014年1月8日 申請(qǐng)日期:2013年10月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月12日
【發(fā)明者】高希武, 劉曉嵐, 湯秋玲 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)