檢測脊髓灰質(zhì)炎病毒的方法及量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析試紙及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)免疫檢測方法，特別是涉及使用量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析試紙，以免疫學(xué)的方法檢測脊髓灰質(zhì)炎病毒的方法。一種量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析試紙，在塑料板上從下到上依次粘貼有玻璃纖維素膜A、量子點(diǎn)標(biāo)記脊髓灰質(zhì)炎病毒IgG單克隆抗體的玻璃纖維素膜B、硝酸纖維素膜、吸水紙；其中，所述硝酸纖維素膜一端有脊髓灰質(zhì)炎病毒多克隆抗體和兔抗鼠二抗，以此形成檢測帶T和質(zhì)控帶C；所述量子點(diǎn)標(biāo)記的脊髓灰質(zhì)炎病毒IgG單克隆抗體位于玻璃纖維素膜B的一端，與檢測帶T和質(zhì)控帶C相對應(yīng)，并且量子點(diǎn)標(biāo)記的脊髓灰質(zhì)炎病毒IgG單克隆抗體位于進(jìn)樣點(diǎn)一端。該方法的檢測靈敏度比目前常用的高1000倍左右。
【專利說明】檢測脊髓灰質(zhì)炎病毒的方法及量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析試紙及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)免疫檢測方法，特別是涉及使用量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析試紙，以免疫學(xué)的方法檢測脊髓灰質(zhì)炎病毒的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]脊髓灰質(zhì)炎病毒(Poliovirus，或稱為脊髓灰白質(zhì)炎病毒)是脊髓灰質(zhì)炎(小兒麻痹)的病原，又稱小兒麻痹病毒。它是一個沒有包膜的病毒，由一條單股RNA和蛋白質(zhì)外殼組成，直徑約25納米，屬于小核糖核酸病毒科腸道病毒屬。除人外，猴也會受這種病毒感染。脊髓灰白質(zhì)炎病毒通過糞便和飲食以及通過接觸感染。衛(wèi)生措施對感染途徑的影響比較小。它首先感染消化系統(tǒng)，在少數(shù)情況下通過血液傳播到身體其它部分。在大多數(shù)情況下脊髓質(zhì)炎沒有任何病癥，有時它會造成流行性感冒似的癥狀。在少數(shù)情況下(約1%)它會感染神經(jīng)細(xì)胞，主要是對肌肉運(yùn)動重要的脊髓中的細(xì)胞造成麻痹。
[0003]目前，常用的檢測方法是膠體金法，此法雖然檢測快速簡便，容易操作，但是準(zhǔn)確率較低，靈敏度也較低。因此尋求一種價格便宜、操作簡便、靈敏度和特異性都較高的檢測方法是迫切需要解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對上述技術(shù)的不足之處，本發(fā)明提供一種價格便宜、操作簡便、靈敏度和特異性都較高的檢測試紙以及用該試紙檢測脊髓灰質(zhì)炎病毒的方法。
[0005]一種量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析試紙，設(shè)有塑料板、硝酸纖維素膜、玻璃纖維素膜A、量子點(diǎn)標(biāo)記脊髓灰質(zhì)炎病毒IgG單克隆抗體的玻璃纖維素膜B、吸水紙；
[0006]其中，所述塑料板上依次粘貼有玻璃纖維素膜A、量子點(diǎn)標(biāo)記脊髓灰質(zhì)炎病毒IgG單克隆抗體的玻璃纖維素膜B、硝酸纖維素膜、吸水紙；
[0007]其中，所述硝酸纖維素膜一端有脊髓灰質(zhì)炎病毒多克隆抗體和兔抗鼠二抗，以此形成檢測帶T和質(zhì)控帶C ；
[0008]其中，所述量子點(diǎn)標(biāo)記的脊髓灰質(zhì)炎病毒IgG單克隆抗體位于玻璃纖維素膜B的另一端，與檢測帶T和質(zhì)控帶C相對應(yīng)，并且量子點(diǎn)標(biāo)記的脊髓灰質(zhì)炎病毒IgG單克隆抗體位于進(jìn)樣點(diǎn)一端。
[0009]優(yōu)選的,所述量子點(diǎn)為CdTe/ZnSe核殼量子點(diǎn)。
[0010]優(yōu)選的，所述塑料板為粘性PVC底板。
[0011]優(yōu)選的，所述脊髓灰質(zhì)炎病毒多克隆抗體的濃度為0.5g/L。
[0012]優(yōu)選的，所述兔抗鼠二抗的濃度為1.0g/L。
[0013]優(yōu)選的，所述檢測帶T和質(zhì)控帶C間距不少于5_。
[0014]如上所述的試紙的制備方法，包括如下步驟:
[0015]( I)量子點(diǎn)與脊髓灰質(zhì)炎病毒IgG單克隆抗體的偶聯(lián):[0016]取0.0lM的PBS緩沖液100?200uL與5?20uL表面連有羧基的量子點(diǎn)；
[0017]選取偶聯(lián)試劑，偶聯(lián)試劑選自羥基硫代琥珀酸亞胺、1- (3-二甲基氨丙基)_3乙基碳二胺鹽酸鹽；
[0018]加入脊髓灰質(zhì)炎病毒IgG單克隆抗體150?200uL ；
[0019]搖床反應(yīng)I?4小時；
[0020]層析柱過濾，離心純化；
[0021 ] 用1%?5%的牛血清白蛋白封閉；
[0022]4°C 保存；
[0023](2)試紙的制備:
[0024]用0.05?0.15M的PBS緩沖液稀釋脊髓灰質(zhì)炎病毒多克隆抗體及兔抗鼠二抗，將
0.5g/L脊髓灰質(zhì)炎病毒多克隆抗體和1.0g/L兔抗鼠二抗噴在硝酸纖維素膜一端,形成檢測帶T和質(zhì)控帶C，T帶和C帶間隔5mm，室溫晾干，將硝酸纖維素膜放入PBS緩沖液中，37°C封閉待用，或者干燥后4°C保存；
[0025]將量子點(diǎn)標(biāo)記脊髓灰質(zhì)炎病毒IgG單克隆抗體均勻噴覆于玻璃纖維膜B —端,與形成的T帶和C帶相對應(yīng)，室溫干燥，4°C保存；
[0026]在塑料板上依次粘帖玻璃纖維素膜A、量子點(diǎn)標(biāo)記脊髓灰質(zhì)炎病毒IgG單克隆抗體的玻璃纖維素膜B、硝酸纖維素膜、吸水紙；
[0027]用試紙切刀切割成試紙，干燥后密封保存。
[0028]用所述的試紙檢測脊髓灰質(zhì)炎病毒，包括如下步驟:將樣品點(diǎn)樣在組裝好的試紙上接近脊髓灰質(zhì)炎病毒IgG單克隆抗體的一端，反應(yīng)5min后，在紫外分析儀中觀察結(jié)果。
[0029]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):由于在所制備的試紙中加入了核殼量子點(diǎn)，特別是采用了 CdTe/ZnSe水溶性核殼量子點(diǎn)，將水溶性的量子點(diǎn)與特異性的通過共價偶聯(lián)，然后利用雙抗夾心原理結(jié)合量子點(diǎn)的熒光性質(zhì)檢測樣品中是否含有目標(biāo)物。在紫外燈的照射下，通過觀察免疫層析試紙條上檢測帶和質(zhì)控帶的熒光線，判斷檢測結(jié)果。本發(fā)明將免疫反應(yīng)的高特異性和量子點(diǎn)的熒光特性相結(jié)合，利用量子點(diǎn)多波長激發(fā)，高強(qiáng)度熒光發(fā)射，發(fā)射峰窄，峰形對稱，發(fā)光穩(wěn)定性好的熒光特性，建立了快速，特異，簡便，靈敏的免疫層析檢測方法。通過觀察熒光信號達(dá)到了定量檢測的目的。該方法的檢測靈敏度比目前常用的一種快速檢測方法-膠體金的檢測靈敏度高約1000倍左右。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]圖1為試紙制備的工藝流程圖。
【具體實施方式】
[0031]下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0032]實施例1:一種量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析試紙，設(shè)有塑料板、硝酸纖維素膜、玻璃纖維素膜A、量子點(diǎn)標(biāo)記脊髓灰質(zhì)炎病毒IgG單克隆抗體的玻璃纖維素膜B、吸水紙，所述玻璃纖維素膜A為沒有點(diǎn)樣的市場上購買的玻璃纖維素膜；
[0033]其中，所述塑料板上依次粘貼有玻璃纖維素膜A、量子點(diǎn)標(biāo)記脊髓灰質(zhì)炎病毒IgG單克隆抗體的玻璃纖維素膜B、硝酸纖維素膜、吸水紙；[0034]其中，所述硝酸纖維素膜一端有脊髓灰質(zhì)炎病毒多克隆抗體和兔抗鼠二抗，以此形成檢測帶T和質(zhì)控帶C ；
[0035]其中，所述量子點(diǎn)標(biāo)記的脊髓灰質(zhì)炎病毒IgG單克隆抗體位于玻璃纖維素膜B的另一端，與檢測帶T和質(zhì)控帶C相對應(yīng)，并且量子點(diǎn)標(biāo)記的脊髓灰質(zhì)炎病毒IgG單克隆抗體位于進(jìn)樣點(diǎn)一端。
[0036]優(yōu)選的,所述量子點(diǎn)為CdTe/ZnSe核殼量子點(diǎn)。
[0037]優(yōu)選的，所述塑料板為粘性PVC底板。
[0038]優(yōu)選的，所述脊髓灰質(zhì)炎病毒多克隆抗體的濃度為0.5g/L。
[0039]優(yōu)選的，所述兔抗鼠二抗的濃度為1.0g/L。
[0040]優(yōu)選的，所述檢測帶T和質(zhì)控帶C間距不少于5mm。
[0041]實施例2:如上所述的試紙的制備方法，如圖1所示，包括如下步驟:
[0042](I)量子點(diǎn)與脊髓灰質(zhì)炎病毒IgG單克隆抗體的偶聯(lián):
[0043]取0.0lM的PBS緩沖液100?200uL與5?20uL表面連有羧基的量子點(diǎn)；
[0044]選取偶聯(lián)試劑，偶聯(lián)試劑選自羥基硫代琥珀酸亞胺、1- (3-二甲基氨丙基)_3乙基碳二胺鹽酸鹽；
[0045]加入脊髓灰質(zhì)炎病毒IgG單克隆抗體150?200uL ；
[0046]搖床反應(yīng)I?4小時；
[0047]層析柱過濾，離心純化；
[0048]用1%?5%的牛血清白蛋白封閉；
[0049]4°C 保存；
[0050](2)試紙的制備:
[0051]用0.05?0.15M的PBS緩沖液稀釋脊髓灰質(zhì)炎病毒多克隆抗體及兔抗鼠二抗，將
0.5g/L脊髓灰質(zhì)炎病毒多克隆抗體和1.0g/L兔抗鼠二抗噴在硝酸纖維素膜一端,形成檢測帶T和質(zhì)控帶C，T帶和C帶間隔5mm，室溫晾干，將硝酸纖維素膜放入PBS緩沖液中，37°C封閉待用，或者干燥后4°C保存；
[0052]將量子點(diǎn)標(biāo)記的脊髓灰質(zhì)炎病毒IgG單克隆抗體均勻噴覆于玻璃纖維膜B —端，與T帶和C帶相對應(yīng)，室溫干燥，4°C保存；
[0053]在塑料板上依次粘帖玻璃纖維素膜A、量子點(diǎn)標(biāo)記脊髓灰質(zhì)炎病毒IgG單克隆抗體的玻璃纖維素膜B、硝酸纖維素膜、吸水紙；
[0054]用試紙切刀切割成試紙，干燥后密封保存。
[0055]其中，步驟(I)中偶聯(lián)效果的檢測方法如下:
[0056]凝膠電泳法:采用0.8瓊脂糖凝膠，電壓為80V，電泳15min后，在紫外分析儀中觀察電泳結(jié)果。
[0057]斑點(diǎn)印跡法:將0.3g/L脊髓灰質(zhì)炎病毒-BSA液點(diǎn)在硝酸纖維素膜上，晾干后浸泡于含 5%BSA 的 0.01mol/L 磷酸鹽緩沖液(PBS，IOnmoI/L, PH=7.4，含 NaC18.5g/L)中，封閉膜上剩余的蛋白結(jié)合位點(diǎn)，于37°C孵育lh，封閉后取出，PBS洗滌。制備三個完全相同的脊髓灰質(zhì)炎病毒印跡膜，晾干后分別放入量子點(diǎn)標(biāo)記脊髓灰質(zhì)炎病毒IgG單克隆抗體，量子點(diǎn)-BSA及量子點(diǎn)溶液，于37°C搖床反應(yīng)30min，PBS洗滌。紫外分析儀中觀察結(jié)果。
[0058]實施例3:用所述的試紙檢測脊髓灰質(zhì)炎病毒，包括如下步驟:將樣品點(diǎn)樣在組裝好的試紙上接近脊髓灰質(zhì)炎病毒IgG單克隆抗體的一端，反應(yīng)5min后，在紫外分析儀中觀察結(jié)果。用PBS緩沖液及正常人的血液設(shè)為空白對照。
[0059]結(jié)果判定:在C帶顯現(xiàn)紅色熒光帶的前提下，目視T帶的熒光帶強(qiáng)度，與空白對照，熒光越弱，代表待測液中含被檢物的濃度越低。
[0060]實施例4:試紙檢測有效性驗證，配制四種濃度的脊髓灰質(zhì)炎病毒溶液，濃度分別為0.5，1.0，2.0，5.0ug/L。利用檢測試紙和化學(xué)發(fā)光試紙盒對樣本進(jìn)行檢測，每個濃度檢測6次，測定試紙檢出結(jié)果的有效性。如表一所示，結(jié)果表明用本發(fā)明制備的試紙檢測出來的呈現(xiàn)陽性，并且溶液濃度越大熒光強(qiáng)度越大。
[0061]表一:各種濃度脊髓灰質(zhì)炎病毒的試紙條檢測結(jié)果
[0062]
【權(quán)利要求】
1.一種量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析試紙，其特征在于，設(shè)有塑料板、硝酸纖維素膜、玻璃纖維素膜A、量子點(diǎn)標(biāo)記脊髓灰質(zhì)炎病毒IgG單克隆抗體的玻璃纖維素膜B、吸水紙； 其中，所述塑料板上從下到上依次粘貼有玻璃纖維素膜A、量子點(diǎn)標(biāo)記脊髓灰質(zhì)炎病毒IgG單克隆抗體的玻璃纖維素膜B、硝酸纖維素膜、吸水紙； 其中，所述硝酸纖維素膜一端有脊髓灰質(zhì)炎病毒多克隆抗體和兔抗鼠二抗，以此形成檢測帶T和質(zhì)控帶C ； 其中，所述量子點(diǎn)標(biāo)記的脊髓灰質(zhì)炎病毒IgG單克隆抗體位于玻璃纖維素膜B的另一端，與檢測帶T和質(zhì)控帶C相對應(yīng)，并且量子點(diǎn)標(biāo)記的脊髓灰質(zhì)炎病毒IgG單克隆抗體位于進(jìn)樣點(diǎn)一端。
2.如權(quán)利要求1所述的量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析試紙，其特征在于，所述量子點(diǎn)為CdTe/ZnSe核殼量子點(diǎn)。
3.如權(quán)利要求1所述的量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析試紙，其特征在于，所述塑料板為粘性PVC底板。
4.如權(quán)利要求1所述的量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析試紙，其特征在于，所述脊髓灰質(zhì)炎病毒多克隆抗體的濃度為0.5g/L。
5.如權(quán)利要求1所述的量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析試紙，其特征在于，所述兔抗鼠二抗的濃度為 1.0g/L。
6.如權(quán)利要求1所述的量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析試紙，其特征在于，所述檢測帶T和質(zhì)控帶C間距不少于5mm。
7.如上任意一項權(quán)利要求所述的量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析試紙的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)量子點(diǎn)與脊髓灰質(zhì)炎病毒1gG單克隆抗體的偶聯(lián): 取0.01M的PBS緩沖液100~200uL與5~20uL表面連有羧基的量子點(diǎn)； 選取偶聯(lián)試劑； 加入脊髓灰質(zhì)炎病毒IgG單克隆抗體150~200uL ； 搖床反應(yīng)I~4小時； 層析柱過濾，離心純化； 用1%~5%的牛血清白蛋白封閉；4°C保存； (2)試紙的制備: 用0.05~0.15M的PBS緩沖液稀釋脊髓灰質(zhì)炎病毒多克隆抗體及兔抗鼠二抗，將0.5g/L脊髓灰質(zhì)炎病毒多克隆抗體和1.0g/L兔抗鼠二抗噴在硝酸纖維素膜上，形成檢測帶T和質(zhì)控帶C，T帶和C帶間隔5mm，室溫晾干，將硝酸纖維素膜放入PBS緩沖液中，37°C封閉待用，或者干燥后4°C保存； 將量子點(diǎn)標(biāo)記的脊髓灰質(zhì)炎病毒1gG單克隆抗體均勻噴覆于玻璃纖維膜B上，室溫干燥，4°C保存； 在塑料板上依次粘帖玻璃纖維素膜A、量子點(diǎn)標(biāo)記脊髓灰質(zhì)炎病毒IgG單克隆抗體的玻璃纖維素膜B、硝酸纖維素膜、吸水紙； 用試紙切刀切割成試紙，干燥后密封保存。
8.如權(quán)利要求7所述的量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析試紙的制備方法，其特征在于，步驟(1)中的偶聯(lián)試劑選自羥基硫代琥珀酸亞胺、1- (3-二甲基氨丙基)-3乙基碳二胺鹽酸鹽。
9.用權(quán)利要求1-6任意一項所述的試紙檢測脊髓灰質(zhì)炎病毒，其特征在于，包括如下步驟:將樣品點(diǎn)樣在組裝好的試紙上接近脊髓灰質(zhì)炎病毒IgG單克隆抗體的一端，反應(yīng)5min后，在紫外分析儀中觀察·結(jié)果。
【文檔編號】G01N33/531GK103529217SQ201310485272
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月16日
【發(fā)明者】文德敏, 申有長, 于曉永 申請人:北京華衛(wèi)博沃生物科技有限公司