一種脂蛋白相關(guān)磷脂酶a2含量檢測試劑盒及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2含量檢測試劑盒及其制備方法，屬于脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2含量的檢測領(lǐng)域。試劑盒由彼此獨立的試劑Ⅰ和試劑Ⅱ組成；其中，試劑Ⅰ的組分包括：生物緩沖劑、促凝劑、防腐劑、螯合劑和水；試劑Ⅱ的組分包括：包被脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體的膠乳顆粒、生物緩沖劑、表面活性劑、防腐劑、助懸劑和水。本發(fā)明采用粒徑為120～180nm的膠乳顆粒制備包被脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體的膠乳顆粒，能有效保證試劑盒的穩(wěn)定性、靈敏度以及較寬的檢測線性范圍，同時本發(fā)明中采用特定的方法制備包被脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體的膠乳顆粒使得試劑盒的開瓶穩(wěn)定性以及檢測特異性更好，使產(chǎn)品更適合于臨床檢測的推廣和應用。
【專利說明】一種脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2含量檢測試劑盒及其制備方法【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2含量的檢測領(lǐng)域，特別涉及一種脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2含量檢測試劑盒及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]脂蛋白相關(guān)憐脂酶A2 (Lipoprotein-associated Phospholipase A2, Lp_PLA2)是由PLA2G7基因編碼，由于脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2具有降解血小板活化因子的活性，因而也被稱為降解血小板活化因子(platelet-activating factor acetylhydro-lase, PAF-AH)0脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2是磷脂酶A2超家族成員之一，與磷脂酶A2家族其他成員不同的是，Lp-PLA2不需要鈣離子維持其催化活性。迄今為止，已知Lp-PLA2有兩種類型:血漿型Lp-PLA2、細胞型Lp-PLA2。血漿型Lp_PLA2由441個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，分子量為45kDa。細胞型Lp-PLA2包括兩種不同的類型。人血漿Lp-PLA2主要由成熟的巨噬細胞、單核細胞、T淋巴細胞、肥大細胞、干細胞等分泌產(chǎn)生，并受炎性介質(zhì)的調(diào)節(jié)，如Y干擾素和脂多糖抑制其分泌，血小板活化因子(platelet-activating factor, PAF)促進其分泌。Lp_PLA2的主要作用包括:產(chǎn)生二十烷酸類炎性介質(zhì)、參與磷脂重建及生物膜的穩(wěn)定平衡、脂蛋白的代謝、細胞傳遞、宿主反應、促進機體壞死組織自體消失等。血小板活化因子有促進血小板聚集、中性粒細胞和單核細胞趨化以及促進白三烯等炎癥介質(zhì)釋放，從而促進血栓形成和炎癥反應。而Lp-PLA2能將PAF水解為無活性的溶血PAF，故能減少炎癥和血栓的形成，具有抗炎和抗動脈粥樣硬化作用。
[0003]Lp-PLA2似乎在血管炎癥中發(fā)揮作用，且被認為促進動脈粥樣硬化。最近的一些研究表明，Lp-PLA2是心血管病(CVD)、冠心病(CHD)以及缺血性腦卒中的獨立危險因素。在這些研究中，我們可以在很多被診斷為冠心病和缺血性腦卒中的患者中看到Lp-PLA2濃度的增加。這些發(fā)現(xiàn)使這個相對較新的檢測作為越來越多的心臟風險標志物之一是有用的，心臟風險標志物是用 來幫助確定一個人發(fā)展心血管疾病的風險。當患者有冠心病，代謝綜合癥，和/或被認為有中度或更高的風險患冠心病或缺血性腦卒中時，醫(yī)生會建議進行LP-PLA2的測試。當患者有炎癥，及高敏C反應蛋白檢測無法進行時，這個測試是很有用的。
[0004]鑒于Lp-PLA2的檢測可以作為評價心臟風險標志物的指標，開發(fā)該指標的檢測試劑盒有利于該指標檢測的臨床應用。目前該指標常用的檢測方法有酶聯(lián)免疫吸附測定法、酶法以及免疫比濁法。酶聯(lián)免疫法具有檢測精確度高、靈敏度好等優(yōu)良特性，但該檢測方法操作繁瑣、檢測耗時長，且樣本只能批量檢測，不能滿足醫(yī)院對該檢測指標的時效性、可重復性及操作簡單等特性方面的需求；酶法檢測的精確度不高，容易導致檢測實驗結(jié)果的誤差，從而導致結(jié)果誤判，對病人產(chǎn)生不利的影響。膠乳免疫比濁法也是測定Lp-PLA2的一種方法，它是基于普通的免疫比濁法，但它克服了普通免疫比濁法靈敏度不高的缺陷，同時還克服了 ELISA方法的缺陷，具有操作簡單、檢測時間短、靈敏度高、線性范圍寬等諸多優(yōu)良的特性。目前，也有一些Lp-PLA2的膠乳免疫比濁法產(chǎn)品及試劑盒，但是這些試劑盒存在著線性范圍窄、穩(wěn)定性差以及檢測靈敏度及特異性差等方面的問題，需要做進一步的改進，以使研發(fā)和生產(chǎn)出來的試劑盒能更好的滿足臨床檢測的需求。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明的目的是為解決上述問題而提供了一種穩(wěn)定性好、靈敏度高、特異性強、操作簡單、線性范圍寬的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2含量檢測試劑盒及其制備方法。
[0006]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:
[0007]一種脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2含量檢測試劑盒，所述試劑盒由試劑I和試劑II組成，所述試劑I的組分包括:生物緩沖劑、促凝劑、防腐劑、螯合劑和水；試劑II的組分包括:包被脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體的膠乳顆粒、生物緩沖劑、表面活性劑、防腐劑、助懸劑和水。
[0008]優(yōu)選地，所述包被脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體的膠乳顆粒的粒徑為120?180nm。
[0009]膠乳顆粒的粒徑對試劑盒的穩(wěn)定性、靈敏度以及檢測結(jié)果的準確性等有著非常顯著的影響，當選用的膠乳顆粒的粒徑為120?ISOnm時，制備出的檢測試劑盒的穩(wěn)定性、靈敏度以及檢測線性范圍等特性要明顯優(yōu)于其它粒徑的膠乳顆粒。
[0010]進一步地，所述包被脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體的膠乳顆粒采用化學交聯(lián)法制備得到，所述化學交聯(lián)法制備包被脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體的膠乳顆粒包括以下步驟:
[0011](I)膠乳顆粒的洗滌活化:取粒徑為120?ISOnm的聚苯乙烯膠乳顆粒分散于MES緩沖液中，緩沖液中膠乳顆粒的濃度為0.6%?3%，離心棄上清；將洗滌過的膠乳顆粒分散于MES緩沖液中，緩沖液中膠乳顆粒的濃度為0.6%?3%，取碳化二亞胺和N-羥基硫代琥珀酰亞胺分別用MES緩沖液溶解后加入膠乳溶液中，混合均勻置于26?38°C恒溫搖床上反應0.5?3h，得到活化的膠乳顆粒；
[0012](2)膠乳顆粒的抗體致敏:向活化完成的膠乳溶液中加入脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體，震蕩混合均勻，置于26?38°C恒溫搖床上反應8?12h，反應完成后向反應體系中加入甘氨酸溶液，混合均勻，并在室溫下靜置反應15?40min ；
[0013](3)致敏膠乳顆粒的封閉及洗滌:向步驟(2)得到的終止反應的體系中加入BSA溶液，混合均勻，并于室溫下靜置反應10?30min，得到包被脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體的膠乳顆粒。
[0014]包被脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2致敏膠乳顆粒可以采用化學交聯(lián)法或物理吸附法等本領(lǐng)域的常規(guī)方法制備得到。本發(fā)明采用化學交聯(lián)法制備的致敏膠乳顆粒，抗體與膠乳顆粒通過化學鍵結(jié)合，從而使抗體不容易從膠乳顆粒上脫落下來，有利于維持試劑盒產(chǎn)品的穩(wěn)定性，使產(chǎn)品的貨架期能顯著延長、開瓶穩(wěn)定性更好。其中脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2單克隆抗體或多克隆抗體能很好的識別樣品中的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗原，從而能很好的提高檢測試劑盒的特異性。
[0015]優(yōu)選地，所述生物緩沖劑為3-(N-嗎啉基)丙磺酸；所述促凝劑為聚乙二醇6000 ；所述防腐劑為疊氮化鈉；所述表面活性劑為吐溫-20 ;所述螯合劑為乙二胺四乙酸二鈉；所述的助懸劑是海藻酸鈉。
[0016]本發(fā)明所述的生物緩沖劑能夠使反應體系維持一定的pH值，各種能是反應體系維持一定PH值的物質(zhì)均能作為本發(fā)明的生物緩沖劑，例如三羥甲基氨基甲烷(Tris)、三羥甲基甲胺基乙磺酸(TES)、2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)、哌嗪-1，4-二羥基丙磺酸(P0PS0)、
3-(N-嗎啉)丙磺酸(MOPS)中的一種或幾種混合物；為了使試劑盒的各項性能最佳，本發(fā)明試劑I和試劑II中的生物緩沖劑優(yōu)選為3-(N-嗎啉基)丙磺酸。
[0017]本發(fā)明所述的防腐劑主要是為了防止微生物滋生導致的產(chǎn)品變質(zhì)從而對檢測結(jié)果帶來不良影響，因此，任何一種能阻止微生物繁殖的物質(zhì)均能適用于本發(fā)明的防腐劑，如:苯甲酸、苯甲酸鈉、山梨酸、山梨酸鉀、疊氮鈉等中的一種或幾種的混合物；為了保證試劑盒的各項性能處于最佳狀態(tài)，本發(fā)明試劑I和試劑II優(yōu)選疊氮化鈉作為防腐劑。
[0018]本發(fā)明試劑I所述的促凝劑可以促進樣本中的抗原與膠乳顆粒表面的抗體相結(jié)合，有利于膠乳顆粒相互之間的交聯(lián)，提高檢測試劑盒的靈敏度；常用的促凝劑為聚乙二醇系列；本發(fā)明中采用聚乙二醇6000可以很好的促進膠乳顆粒的形成，并且也能較好的控制膠乳顆粒形成的速度和大小，對檢測結(jié)果的判讀有很大的好處，本發(fā)明優(yōu)選聚乙二醇6000作為促凝劑。
[0019]本發(fā)明試劑I中所述的螯合劑能夠絡合檢測樣本中的金屬離子，避免金屬離子對檢測結(jié)果造成不良影響，能絡合金屬離子的各種螯合劑均能夠適用本發(fā)明，例如:乙二胺四乙酸二鈉，氨基三乙酸等。本發(fā)明優(yōu)選乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)作為螯合劑。
[0020]本發(fā)明試劑II所述的表面活性劑有利于反應過程中各組分以及檢測樣本各物質(zhì)的均勻分散，使反應體系能處于均相狀態(tài)，達到減少樣本濁度對測定結(jié)果的影響的目的；現(xiàn)有的具有增溶性質(zhì)物質(zhì)均可以作為本發(fā)明的表面活性劑如:吐溫系列、曲拉通系列、乙基苯基聚乙二醇等。為了保證試劑盒的性能更優(yōu)良，本發(fā)明優(yōu)選吐溫-20作為表面活性劑。
[0021]本發(fā)明試劑II所述的助懸劑可以幫助膠乳顆粒維持良好的分散狀態(tài)，防止膠乳顆粒下沉對檢測試劑盒的穩(wěn)定性及檢測結(jié)果的可靠性帶來不良影響，各種能增加反應體系黏度的物質(zhì)均能作為本發(fā)明的助懸劑，本發(fā)明優(yōu)選海藻酸鈉作為助懸劑。
[0022]優(yōu)選地，每I升試劑I中各組分的用量為:生物緩沖劑5?100g，促凝劑I?38g，防腐劑0.1?10g，螯合劑0.05?6g，余量為水。
[0023]更優(yōu)選地，每I升試劑I中各組分的用量為:生物緩沖劑10?25g，促凝劑12?25g，防腐劑0.5?5g，螯合劑0.1?3g，余量為水。
[0024]優(yōu)選地，每I升試劑II中各組分的用量為:包被脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體的膠乳顆粒0.5?4g，生物緩沖劑5?100g，表面活性劑0.1?5mL，防腐劑0.1?10g，助懸劑5?50g，余量為水。
[0025]更優(yōu)選地，每I升試劑II中各組分的用量為:包被脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體的膠乳顆粒0.8?3g，生物緩沖劑10?30g,表面活性劑I?3mL,防腐劑0.5?5g，助懸劑10?30g，余量為水。
[0026]優(yōu)選地，所述試劑I和試劑II的的pH值范圍為6.5?8.5。
[0027]—種脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2含量檢測試劑盒的制備方法，包括以下步驟:
[0028](I)制備試劑1:將各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中，混合均勻，定容得到試劑I ;
[0029](2)制備試劑I1:首先制備脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體包被的膠乳顆粒溶液；將其余各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中得到混合溶液；將脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體包被的膠乳溶液與混合溶液混合均勻，定容，得到試劑II ；
[0030](3)將試劑I和試劑II單獨分裝，密封，即得。
[0031]本發(fā)明具有以下優(yōu)點:[0032]本發(fā)明檢測試劑盒采用粒徑為120_180nm的膠乳顆粒制備包被脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體的膠乳顆粒，能有效保證試劑盒的穩(wěn)定性、靈敏度以及較寬的檢測線性范圍，同時本發(fā)明檢測試劑盒抗體包被膠乳顆粒的工藝采用化學交聯(lián)法保證了檢測試劑盒具有良好的開瓶穩(wěn)定性，包被膠乳顆粒的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體能很好的識別樣本中的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗原，保證了試劑盒具有良好的特異性。本發(fā)明試劑盒具有穩(wěn)定性好、靈敏度高、特異性強、操作簡便等優(yōu)點，適合于推廣和應用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0033]圖1為實施例1-5制備的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2檢測試劑盒標準工作曲線圖；
[0034]圖2為本發(fā)明實施例1與對比實施例1-5制備的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2檢測試劑盒標準工作曲線的比對圖；
[0035]圖3為實施例1檢測試劑盒與酶聯(lián)免疫檢測試劑盒測定人血清中脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2含量其結(jié)果的相關(guān)性圖。
【具體實施方式】
[0036]下面結(jié)合附圖和實施方式對本發(fā)明做進一步詳細的說明。
[0037]實施例1
[0038]包被脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體的膠乳顆粒溶液的制備:
[0039](I)膠乳顆粒的洗滌活化:取0.18g粒徑為160nm的聚苯乙烯膠乳顆粒(購自PolyMicrospheres公司)于5OmL離心管中，再向離心管中加入15mLpH為7.0白勺MES緩沖液，震蕩分散均勻，將 離心管置于離心機中于25000轉(zhuǎn)/min，離心20min，棄上清，重復洗滌兩次；向洗滌過的膠乳顆粒中加入IOmLpH為7.0的MES緩沖液重懸膠乳顆粒。準確稱取35mgl-乙基-3- (3- 二甲基氨基丙基)碳化二亞胺(EDC)和35mgN_羥基硫代琥珀酰亞胺(NHS)分別用ImLpH為7.0的MES緩沖液溶解，溶解完全后將各溶液加入膠乳溶液中，震蕩混合均勻，置于30°C恒溫搖床上，200轉(zhuǎn)/min，反應1.5小時；
[0040](2)膠乳顆粒的抗體致敏:向(I)步反應完成的溶液中加入2mLlmg/mL脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2多克隆抗體(購自BiossInc.)，震蕩混合均勻，置于水平搖床上，30°C，200轉(zhuǎn)/min,反應10h。反應完成后向反應體系中加入200 y L2%濃度的甘氨酸溶液,混合均勻，并于室溫下靜置反應30min ；
[0041](3)致敏膠乳顆粒的封閉及洗滌:步驟(2)反應完成后，向反應體系中加入180 u L5%濃度的BSA溶液，震蕩，混合均勻，并在室溫下靜置反應30min。將反應體系置于12000轉(zhuǎn)/min，離心30min，棄上清，并用pH為7.0的MES緩沖液洗滌沉淀兩次，既得包被脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體的膠乳顆粒，再用IOmLpH為7.0的MES緩沖液復溶膠乳顆粒，即得包被抗體的膠乳顆粒溶液。
[0042]檢測試劑盒的制備:
[0043]1、試劑I的制備:
[0044]按所述用量取各組分:
[0045]3- (N-嗎啉基)丙磺酸15g
[0046]聚乙二醇600015g[0047]疊氮化鈉3g
[0048]乙二胺四乙酸二鈉Ig
[0049]將上述各組分溶解于900mL雙蒸水中，用lmol/L鹽酸和lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液PH至7.5，后用蒸餾水定容至1L，密封4°C保存，備用。
[0050]2、試劑II的制備:
[0051]按所述用量取各組分:
[0052]3- (N-嗎啉基)丙磺酸15g
[0053]吐溫-202mL
[0054]疊氮化鈉3g
[0055]海藻酸鈉20g
[0056]將上述各組分溶解于700mL雙蒸水中，攪拌、充分溶解后加入10份上述步驟制備的包被脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體的膠乳顆粒溶液，充分混勻之后，用lmol/L鹽酸和Imol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液pH至7.5，后用雙蒸水定容至1L，密封4°C保存，備用。
[0057]實施例2
[0058]包被脂蛋 白相關(guān)磷脂酶A2抗體的膠乳顆粒溶液的制備:
[0059](I)膠乳顆粒的洗滌活化:取0.1g粒徑為120nm的聚苯乙烯膠乳顆粒(購自PolyMicrospheres公司)于5OmL離心管中，再向離心管中加入10mT, pH為7.0的MES緩沖液，震蕩分散均勻，將離心管置于離心機中于25000轉(zhuǎn)/min，離心30min，棄上清，重復洗滌兩次；向洗滌過的膠乳顆粒中加入IOmL pH為7.0的MES緩沖液重懸膠乳顆粒。準確稱取50mgl-乙基-3- (3- 二甲基氨基丙基)碳化二亞胺(EDC)和50mgN_羥基硫代琥珀酰亞胺(NHS)分別用ImL pH為7.0的MES緩沖液溶解，溶解完全后將各溶液加入膠乳溶液中，震蕩混合均勻，置于30°C恒溫搖床上，200轉(zhuǎn)/min，反應2小時；
[0060](2)膠乳顆粒的抗體致敏:向(I)步反應完成的溶液中加入2mLlmg/mL脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2多克隆抗體(購自Bioss Inc.)，震蕩混合均勻，置于水平搖床上，30°C，200轉(zhuǎn)/min,反應10h。反應完成后向反應體系中加入200 y L2%濃度的甘氨酸溶液,混合均勻，并于室溫下靜置反應30min ；
[0061](3)致敏膠乳顆粒的封閉及洗滌:步驟(2)反應完成后，向反應體系中加入200 u L5%濃度的BSA溶液，震蕩，混合均勻，并在室溫下靜置反應30min。將反應體系置于12000轉(zhuǎn)/min，離心30min，棄上清，并用pH為7.0的MES緩沖液洗滌沉淀兩次，既得包被脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體的膠乳顆粒，再用IOmLpH為7.0的MES緩沖液復溶膠乳顆粒，即得包被抗體的膠乳顆粒溶液。
[0062]檢測試劑盒的制備:
[0063]1、試劑I的制備:
[0064]按所述用量取各組分:
[0065]3- (N-嗎啉基)丙磺酸20g
[0066]聚乙二醇600018g
[0067]疊氮化鈉2g
[0068]乙二胺四乙酸二鈉 2g
[0069]將上述各組分溶解于900mL雙蒸水中，用lmol/L鹽酸和lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液pH至8.0，后用蒸餾水定容至1L，密封4°C保存，備用。
[0070]2、試劑II的制備:
[0071]按所述用量量取各組分:
[0072]3- (N-嗎啉基)丙磺酸20g
[0073]吐溫-202.5mL
[0074]疊氮化鈉2g
[0075]海藻酸鈉15g
[0076]將上述各組分溶解于700mL雙蒸水中，攪拌、充分溶解后加入9份預上述步驟制備的包被脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體的膠乳顆粒溶液，充分混勻之后，用lmol/L鹽酸和Imol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液pH至8.0，后用雙蒸水定容至1L，密封4°C保存，備用。
[0077]實施例3
[0078]包被脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體的膠乳顆粒溶液的制備:
[0079](I)膠乳顆粒的洗滌活化:取0.15g粒徑為ISOnm的聚苯乙烯膠乳顆粒(購自PolyMicrospheres公司)于5OmL離心管中，再向離心管中加入15mLpH為7.0白勺MES緩沖液，震蕩分散均勻，將離心管置于離心機中于25000轉(zhuǎn)/min，離心20min，棄上清，重復洗滌兩次；向洗滌過的膠乳顆 粒中加入IOmL pH為7.0的MES緩沖液重懸膠乳顆粒。準確稱取40mgl-乙基-3- (3- 二甲基氨基丙基)碳化二亞胺(EDC)和40mg N-羥基硫代琥珀酰亞胺(NHS)分別用ImL pH為7.0的MES緩沖液溶解，溶解完全后將各溶液加入膠乳溶液中，震蕩混合均勻，置于30°C恒溫搖床上，200轉(zhuǎn)/min，反應1.5小時；
[0080](2)膠乳顆粒的抗體致敏:向(I)步反應完成的溶液中加入2mLlmg/mL脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2多克隆抗體(購自Bioss Inc.)，震蕩混合均勻，置于水平搖床上，30°C，200轉(zhuǎn)/min,反應10h。反應完成后向反應體系中加入200 y L2%濃度的甘氨酸溶液,混合均勻，并于室溫下靜置反應30min ；
[0081](3)致敏膠乳顆粒的封閉及洗滌:步驟(2)反應完成后，向反應體系中加入150 u L5%濃度的BSA溶液，震蕩，混合均勻，并在室溫下靜置反應30min。將反應體系置于12000轉(zhuǎn)/min，離心30min，棄上清，并用pH為7.0的MES緩沖液洗滌沉淀兩次，既得包被脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體的膠乳顆粒，再用IOmL pH為7.0的MES緩沖液復溶膠乳顆粒，即得包被抗體的膠乳顆粒溶液。
[0082]檢測試劑盒的制備
[0083]1、試劑I的制備:
[0084]按所述用量取各組分:
[0085]3- (N-嗎啉基)丙磺酸40g
[0086]聚乙二醇600025g
[0087]疊氮化鈉4g
[0088]乙二胺四乙酸二鈉 3g
[0089]將上述各組分溶解于900mL雙蒸水中，用lmol/L鹽酸和lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液PH至7.0，后用蒸餾水定容至1L，密封4°C保存，備用。
[0090]2、試劑II的制備:
[0091]按所述用量取各組分:[0092]3- (N-嗎啉基)丙磺酸40g
[0093]吐溫-203mL
[0094]疊氮化鈉4g
[0095]海藻酸鈉30g
[0096]將上述各組分溶解于700mL雙蒸水中，攪拌、充分溶解后加入12份上述步驟制備的包被脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體的膠乳顆粒溶液，充分混勻之后，用lmol/L鹽酸和Imol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液pH至7.0，后用雙蒸水定容至1L，密封4°C保存，備用。
[0097]實施例4
[0098]包被脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體的膠乳顆粒溶液的制備:
[0099](I)膠乳顆粒的洗滌活化:取0.18g粒徑為140nm的聚苯乙烯膠乳顆粒(購自PolyMicrospheres公司)于5OmL離心管中，再向離心管中加入15mL pH為7.0的MES緩沖液，震蕩分散均勻，將離心管置于離心機中于25000轉(zhuǎn)/min，離心20min，棄上清，重復洗滌兩次；向洗滌過的膠乳顆粒中加入IOmL pH為7.0的MES緩沖液重懸膠乳顆粒。準確稱取35mgl-乙基-3- (3- 二甲基氨基丙基)碳化二亞胺(EDC)和35mg N-羥基硫代琥珀酰亞胺(NHS)分別用ImL pH為7.0的MES緩沖液溶解，溶解完全后將各溶液加入膠乳溶液中，震蕩混合均勻，置于30°C恒溫搖床上，200轉(zhuǎn)/min，反應1.5小時；
[0100](2)膠乳顆粒的抗體致敏:向(I)步反應完成的溶液中加入2mLlmg/mL脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2多克隆抗 體(購自Bioss Inc.)，震蕩混合均勻，置于水平搖床上，30°C，200轉(zhuǎn)/min,反應10h。反應完成后向反應體系中加入200 y L2%濃度的甘氨酸溶液,混合均勻，并于室溫下靜置反應30min ；
[0101](3)致敏膠乳顆粒的封閉及洗滌:步驟(2)反應完成后，向反應體系中加入180 u L5%濃度的BSA溶液，震蕩，混合均勻，并在室溫下靜置反應30min。將反應體系置于12000轉(zhuǎn)/min，離心30min，棄上清，并用pH為7.0的MES緩沖液洗滌沉淀兩次，既得包被脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體的膠乳顆粒，再用IOmL pH為7.0的MES緩沖液復溶膠乳顆粒，即得包被抗體的膠乳顆粒溶液。
[0102]檢測試劑盒的制備
[0103]1、試劑I的制備:
[0104]按所述用量取各組分:
[0105]3- (N-嗎啉基)丙磺酸IOg
[0106]聚乙二醇6000IOg
[0107]疊氮化鈉2g
[0108]乙二胺四乙酸二鈉 2g
[0109]將上述各組分溶解于900mL雙蒸水中，用lmol/L鹽酸和lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液PH至6.8，后用蒸餾水定容至1L，密封4°C保存，備用。
[0110]2、試劑II的制備:
[0111]按所述用量取各組分:
[0112]3- (N-嗎啉基)丙磺酸 IOg
[0113]吐溫-204mL
[0114]疊氮化鈉2g[0115]海藻酸鈉40g
[0116]將上述各組分溶解于700mL雙蒸水中，攪拌、充分溶解后加入11份上述步驟制備的包被脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體的膠乳顆粒溶液，充分混勻之后，用lmol/L鹽酸和Imol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液pH至6.8，后用雙蒸水定容至1L，密封4°C保存，備用。
[0117]實施例5
[0118]包被脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體的膠乳顆粒溶液的制備:
[0119](I)膠乳顆粒的洗滌活化:取0.18g粒徑為170nm的聚苯乙烯膠乳顆粒(購自PolyMicrospheres公司)于5OmL離心管中，再向離心管中加入15mL pH為7.0的MES緩沖液，震蕩分散均勻，將離心管置于離心機中于25000轉(zhuǎn)/min，離心20min，棄上清，重復洗滌兩次；向洗滌過的膠乳顆粒中加入IOmL pH為7.0的MES緩沖液重懸膠乳顆粒。準確稱取35mgl-乙基-3- (3- 二甲基氨基丙基)碳化二亞胺(EDC)和35mg N-羥基硫代琥珀酰亞胺(NHS)分別用ImL pH為7.0的MES緩沖液溶解，溶解完全后將各溶液加入膠乳溶液中，震蕩混合均勻，置于30°C恒溫搖床上，200轉(zhuǎn)/min，反應1.5小時；
[0120](2)膠乳顆粒的抗體致敏:向(I)步反應完成的溶液中加入2mLlmg/mL脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2多克隆抗體(購自Bioss Inc.)，震蕩混合均勻，置于水平搖床上，30°C，200轉(zhuǎn)/min,反應10h。反應完成后向反應體系中加入200 y L2%濃度的甘氨酸溶液,混合均勻，并于室溫下靜置反應30min ；
[0121](3)致敏膠乳顆粒的封閉及洗滌:步驟(2)反應完成后，向反應體系中加入180 u L5%濃度的BSA溶液，震蕩，混合均勻，并在室溫下靜置反應30min。將反應體系置于12000轉(zhuǎn)/min，離心 30min，棄上清，并用pH為7.0的MES緩沖液洗滌沉淀兩次，既得包被脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體的膠乳顆粒，再用IOmL pH為7.0的MES緩沖液復溶膠乳顆粒，即得包被抗體的膠乳顆粒溶液。
[0122]檢測試劑盒的制備
[0123]1、試劑I的制備:
[0124]按所述用量取各組分:
[0125]3- (N-嗎啉基)丙磺酸50g
[0126]聚乙二醇600025g
[0127]疊氮化鈉6g
[0128]乙二胺四乙酸二鈉2g
[0129]將上述各組分溶解于900mL雙蒸水中，用lmol/L鹽酸和lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液PH至7.2，后用蒸餾水定容至1L，密封4°C保存，備用。
[0130]2、試劑II的制備:
[0131 ] 按所述用量取各組分:
[0132]3- (N-嗎啉基)丙磺酸50g
[0133]吐溫-204mL
[0134]疊氮化鈉6g
[0135]海藻酸鈉24g
[0136]將上述各組分溶解于700mL雙蒸水中，攪拌、充分溶解后加入10份預備實施例5制備的包被脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體的膠乳顆粒溶液，充分混勻之后，用lmol/L鹽酸和lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液pH至7.2，后用雙蒸水定容至1L，密封4°C保存，備用。
[0137]對比實施例1
[0138]脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2檢測試劑盒的制備，除了膠乳顆粒的粒徑為IlOnm外，其余均與實施例2完全相同。
[0139]對比實施例2
[0140]脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2檢測試劑盒的制備，除了膠乳顆粒的粒徑為190nm外，其余均與實施例3完全相同。
[0141]對比實施例3
[0142]脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2檢測試劑盒的制備，除了膠乳顆粒的粒徑為IOOnm外，其余均與實施例4完全相同。
[0143]對比實施例4
[0144]脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2檢測試劑盒的制備，除了膠乳顆粒的粒徑為200nm外，其余均與實施例5完全相同。
[0145]對比實施例5
[0146]脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2檢測試劑盒的制備，除了膠乳顆粒的粒徑為SOnm外，其余均與實施例1完全相同。
[0147]試驗例I試劑盒標準工作曲線的測定:
[0148]取濃度為0ng/mL,200ng/mL,400ng/mL,800ng/mL, 1600ng/mL 的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2標準品溶液，用本發(fā)明實施例1-5及對比實施例1-5所制備的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2檢測試劑盒對其進行檢測，繪制各檢測試劑盒標準工作曲線。
[0149]測定結(jié)果見圖1和圖2。從圖1可以看出本發(fā)明實施例1-5所制備的檢測試劑盒具有良好的線性，另本發(fā)明采用最優(yōu)化的條件制備出的試劑盒(實施例1 )，其標準工作曲線較其余優(yōu)選條件制備出的試劑盒線性更優(yōu)良；根據(jù)圖2可以看出本發(fā)明實施例1-5所制備的檢測試劑盒的線性范圍要明顯的優(yōu)于對比實施例1-5所制備的檢測試劑盒。
[0150]試驗例2試劑盒與酶聯(lián)免疫分析試劑盒測值的相關(guān)性試驗
[0151]1.供試試劑盒:
[0152]實施例1所制備的試劑盒以及酶聯(lián)免疫試劑盒(購自美國Diadexus公司)；
[0153]2.試驗方法及結(jié)果:
[0154]通過用本發(fā)明實施例1所制備的試劑盒與購自Diadexus公司的酶聯(lián)免疫試劑盒測定血清中脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2的含量的測定值進行比較，試驗結(jié)果為圖3所示，并進行回歸分析。從圖3中可以看出本發(fā)明試劑盒與酶聯(lián)試劑盒在血清中脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2測定方面具有良好的相關(guān)性。
[0155]試驗例3試劑盒的重復性和準確度試驗
[0156]用購自英國Randox Life Sciences公司的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2粉末配制200ng/mL的校準品作為樣本，用本發(fā)明實施例1、實施例4及實施例5制備的檢測試劑盒測定校準品溶液，每個試劑盒重復測定10次，分別計算測定均值(M)和標準差(S)，以S/MX 100%計算變異系數(shù)進行重復性考察，以(1-M/樣本濃度)X 100%計算相對偏差進行準確度考察，實驗結(jié)果見下表1，由表I的結(jié)果可知本發(fā)明實施例1采用最優(yōu)粒徑制備的檢測試劑盒其準確度及精密度優(yōu)于采用其他粒徑制備的檢測試劑盒。[0157]表1實施例檢測試劑盒的重復性及其準確度結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2含量檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒由試劑I和試劑II組成，所述試劑1的組分包括:生物緩沖劑、促凝劑、防腐劑、螯合劑和水；試劑II的組分包括:包被脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體的膠乳顆粒、生物緩沖劑、表面活性劑、防腐劑、助懸劑和水。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2含量檢測試劑盒，其特征在于，所述包被脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體的膠乳顆粒的粒徑為120~180nm。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2含量檢測試劑盒，其特征在于，所述包被脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體的膠乳顆粒采用化學交聯(lián)法制備得到，所述化學交聯(lián)法制備包被脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體的膠乳顆粒包括以下步驟: (1)膠乳顆粒的洗滌活化:取粒徑為120~180nm的聚苯乙烯膠乳顆粒分散于MES緩沖液中，緩沖液中膠乳顆粒的濃度為0.6%~3%，離心棄上清；將洗滌過的膠乳顆粒分散于MES緩沖液中，緩沖液中膠乳顆粒的濃度為0.6%~3%，取碳化二亞胺和N-羥基硫代琥珀酰亞胺分別用MES緩沖液溶解后加入膠乳溶液中，混合均勻置于26~38°C恒溫搖床上反應0.5~3h，得到活化的膠乳顆粒； (2)膠乳顆粒的抗體致敏:向活化完成的膠乳溶液中加入脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體，震蕩混合均勻，置于26~38°C恒溫搖床上反應8~12h，反應完成后向反應體系中加入甘氨酸溶液，混合均勻，并在室溫下靜置反應15~40min ； (3)致敏膠乳顆粒的封閉及洗滌:向步驟(2)得到的終止反應的體系中加入BSA溶液，混合均勻，并于室溫下靜置反應10~30min，得到包被脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體的膠乳顆粒。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2含量檢測試劑盒，其特征在于，所述生物緩沖劑為3-(N-嗎啉基)丙磺酸；所述促凝劑為聚乙二醇6000 ;所述防腐劑為疊氮化鈉；所述表面活性劑為吐溫-20 ;所述螯合劑為乙二胺四乙酸二鈉；所述的助懸劑是海藻酸鈉。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2含量檢測試劑盒，其特征在于，每I升試劑I中各組分的用量為:生物緩沖劑5~100g，促凝劑1~38g，防腐劑0.1~10g，螯合劑0.05~6g，余量為水。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2含量檢測試劑盒，其特征在于，每I升試劑I中各組分的用量為:生物緩沖劑10~25g，促凝劑12~25g，防腐劑0.5~5g，螯合劑0.1~3g，余量為水。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2含量檢測試劑盒，其特征在于，每I升試劑II中各組分的用量為:包被脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體的膠乳顆粒0.5~4g，生物緩沖劑5~100g，表面活性劑0.1~5mL，防腐劑0.1~10g，助懸劑5~50g，余量為水。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2含量檢測試劑盒，其特征在于，每I升試劑II中各組分的用量為:包被脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體的膠乳顆粒0.8~3g，生物緩沖劑10~30g，表面活性劑I~3mL，防腐劑0.5~5g，助懸劑10~30g，余量為水。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2含量檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑I和試劑II的的PH值范圍為6.5~8.5。
10.一種權(quán)利要求1至9任一項所述的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2含量檢測試劑盒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟:(1)制備試劑1:將各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中，混合均勻，定容得到試劑I ; (2)制備試劑I1:首先制備脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體包被的膠乳顆粒溶液；將其余各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中得到混合溶液；將脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體包被的膠乳溶液與混合溶液混合均勻，定容，得到試劑II ； (3)將試劑I和試劑II單 獨分裝，密封，即得。
【文檔編號】G01N33/573GK103792353SQ201310487191
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2013年10月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月17日
【發(fā)明者】不公告發(fā)明人 申請人:武漢生之源生物科技有限公司