一種核糖轉(zhuǎn)移基酶基因突變的電化學(xué)檢測(cè)方法
【專利摘要】一種核糖轉(zhuǎn)移基酶基因突變的電化學(xué)檢測(cè)方法，它涉及一種基因突變的電化學(xué)檢測(cè)方法。本發(fā)明是要解決現(xiàn)有方法在檢測(cè)細(xì)胞株基因突變時(shí)僅能通過檢測(cè)遺傳學(xué)終點(diǎn)來確定結(jié)果，手段繁復(fù)、費(fèi)用高、誤差大，且會(huì)對(duì)試驗(yàn)人員健康造成傷害的問題。本發(fā)明的一種核糖轉(zhuǎn)移基酶基因突變的電化學(xué)檢測(cè)方法步驟如下：一：制備納米復(fù)合工作電極；二：使用上述制備的納米復(fù)合工作電極分別檢測(cè)細(xì)胞裂解液、嘌呤堿基單體、嘌呤堿基混合液的電化學(xué)信號(hào)，分析并確定嘌呤堿基電化學(xué)信號(hào)所在的峰位；三：用致突變劑使細(xì)胞發(fā)生突變后，每12h進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)，以不同時(shí)間電化學(xué)信號(hào)變化為指標(biāo)，建立HGPRT基因突變電化學(xué)試驗(yàn)方法。本發(fā)明用于電化學(xué)檢測(cè)方法領(lǐng)域。
【專利說明】—種核糖轉(zhuǎn)移基酶基因突變的電化學(xué)檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種哺乳類動(dòng)物細(xì)胞株基因突變的電化學(xué)檢測(cè)方法，尤其涉及對(duì)核糖轉(zhuǎn)移基酶基因位點(diǎn)的基因突變電化學(xué)檢測(cè)。
【背景技術(shù)】
[0002]哺乳動(dòng)物細(xì)胞致突變?cè)囼?yàn)是國(guó)際評(píng)價(jià)致突因素的重要傳統(tǒng)方法，它以哺乳動(dòng)物細(xì)胞為材料，通過檢測(cè)細(xì)胞中特定基因的突變確定受試物的致突性。次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移基酶(HGPRT )基因是理想的突變生物標(biāo)志物，它作為內(nèi)源性結(jié)構(gòu)基因，編碼產(chǎn)生嘌呤代謝補(bǔ)救途徑的關(guān)鍵酶，因其具有對(duì)各種致突因素敏感、自發(fā)突變率低等優(yōu)點(diǎn)，已成為基因突變研究中的 重要靶基因。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞HGPRT基因突變?cè)囼?yàn)中，HGPRT基因突變會(huì)引發(fā)嘌呤代謝補(bǔ)救途徑中的關(guān)鍵酶一HGPRT活性下降甚至消失，引起相關(guān)通路中核苷酸代謝異常，進(jìn)而導(dǎo)致嘌呤堿基及尿酸含量關(guān)系發(fā)生特征性變化。因而，如果能夠?qū)崟r(shí)跟蹤檢測(cè)這種變化，必然可以及時(shí)反映HGPRT基因位點(diǎn)突變情況。
[0003]目前，對(duì)傳統(tǒng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞株基因突變的檢測(cè)方法僅能通過檢測(cè)遺傳學(xué)終點(diǎn)來確定基因突變結(jié)果，周期較長(zhǎng)，一般需要15天以上，易造成假陰性結(jié)果，而且手段繁復(fù)，費(fèi)用高、誤差大。另外，試驗(yàn)中需要熒光和放射性標(biāo)記，會(huì)對(duì)試驗(yàn)人員健康造成傷害。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有方法在檢測(cè)傳統(tǒng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞株基因突變時(shí)僅能通過檢測(cè)遺傳學(xué)終點(diǎn)來確定基因突變結(jié)果，周期長(zhǎng)，手段繁復(fù)，費(fèi)用高、誤差大，易出現(xiàn)由于表達(dá)不完全而造成的假陰性結(jié)果，而且試驗(yàn)中需要熒光和放射性標(biāo)記，會(huì)對(duì)試驗(yàn)人員健康造成傷害的問題，而提供的一種核糖轉(zhuǎn)移基酶基因突變的電化學(xué)檢測(cè)方法。
[0005]本發(fā)明的一種核糖轉(zhuǎn)移基酶基因突變的電化學(xué)檢測(cè)方法，它是按以下步驟進(jìn)行:
[0006]步驟一:將經(jīng)酸化處理的多壁碳納米管與離子液體研磨混合20_30min，直至形成均勻的電極修飾液，按0.01-0.07uL/mm2的滴涂量將電極修飾液均勻涂敷于玻碳電極表面，室溫下干燥，即得納米復(fù)合工作電極；其中，碳納米管與離子液體的質(zhì)量體積比為Img:(15μ L-25y L)；
[0007]步驟二:按4.5X104-5.5 X IO4個(gè)/cm2的接種量將模型細(xì)胞接種于含0.2-0.25mL/Cm2DMEM細(xì)胞完全培養(yǎng)液的η個(gè)培養(yǎng)皿中，放于37°C、C02體積百分含量為5%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h-50h后，取出培養(yǎng)皿，棄去DMEM細(xì)胞完全培養(yǎng)液，用pH=7.0-7.4的PBS緩沖溶液漂洗；然后每個(gè)培養(yǎng)皿中按21-24 μ L/cm2的加入量加入pH=7.0-7.4的PBS緩沖溶液，在45_55°C水浴中原位裂解細(xì)胞25-35min，獲得細(xì)胞裂解液；
[0008]步驟三:用步驟一制備的納米復(fù)合工作電極分別檢測(cè)嘌呤堿基單體溶液、嘌呤堿基混合溶液和步驟二中得到的細(xì)胞裂解液的電化學(xué)信號(hào)，確定細(xì)胞裂解液的電化學(xué)信號(hào)中嘌呤堿基電化學(xué)信號(hào)所在的峰位；其中，納米復(fù)合工作電極工作條件為溫度25°C、pH=7.2、掃描速度lOOmv/s ;所述的嘌呤堿基單體為鳥嘌呤、黃嘌呤、腺嘌呤或次黃嘌呤中的一種，嘌呤堿基單體溶液濃度為5 X 10_6-9 X 10_6M，溶劑為pH=7.0-7.4的PBS緩沖液；嘌呤堿基混合液由各嘌呤堿基單體和pH=7.0-7.4的PBS緩沖液混合制成，各嘌呤堿基單體在混合液中的終濃度均為5 X 10-6-9 X I(T6M ；
[0009]步驟四:按4.5X104-5.5 X IO4個(gè)/cm2的接種量將模型細(xì)胞接種于含0.2-0.25mL/Cm2DMEM細(xì)胞完全培養(yǎng)液的η個(gè)培養(yǎng)皿中，放于37°C、C02體積百分含量為5%培養(yǎng)箱中培培養(yǎng)24-26h后，棄去DMEM細(xì)胞完全培養(yǎng)液，然后將η個(gè)培養(yǎng)皿隨機(jī)均分成二組，一組加入含有質(zhì)量百分含量為0.03-0.13%的致突變劑的無血清DMEM培養(yǎng)液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)l_3h，做為加藥組；另一組用含有0.1%-0.5%DMS0的無血清DMEM培養(yǎng)液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)l_3h，做為陰性對(duì)照組；其中，二組無血清DMEM培養(yǎng)液的加入量均為0.2-0.25mL/cm2 ；
[0010] 步驟五:將步驟四的兩組培養(yǎng)的細(xì)胞用緩沖液分別沖洗2-3次，然后加入DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，放于37°C、C02體積百分含量為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7-9天，每12h或24h進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)，然后以電化學(xué)檢測(cè)時(shí)間為橫坐標(biāo)，以在步驟三中嘌呤堿基電化學(xué)信號(hào)所確認(rèn)的峰位對(duì)應(yīng)的電壓下所測(cè)得的基因突變前和突變過程中細(xì)胞嘌呤核苷酸代謝電流信號(hào)為縱坐標(biāo)，建立HGPRT基因突變電化學(xué)信號(hào)變化規(guī)律圖，即完成一種核糖轉(zhuǎn)移基酶基因突變的電化學(xué)檢測(cè)方法；其中，DMEM細(xì)胞完全培養(yǎng)液加入量為0.2-0.25mL/cm2。
[0011]本發(fā)明包含以下有益效果:
[0012]本發(fā)明建立的HGPRT基因突變電化學(xué)試驗(yàn)方法，以細(xì)胞內(nèi)嘌呤含量為檢測(cè)指標(biāo)，在基因突變表達(dá)期7天內(nèi)，便可觀察到明顯的兩個(gè)電化學(xué)信號(hào)的變化，其中信號(hào)一(0.7V左右)，在第四天對(duì)照組和加藥組開始有明顯變化，而信號(hào)二(1.0V左右)在表達(dá)期第三天開始即有明顯變化，說明采用電化學(xué)方法檢測(cè)基因突變?cè)诒磉_(dá)期7天內(nèi)即可完成基因突變檢測(cè)。
[0013]本發(fā)明的一種核糖轉(zhuǎn)移基酶基因突變的電化學(xué)檢測(cè)方法利用電化學(xué)靈敏、快速、客觀的特點(diǎn)，突破了傳統(tǒng)生物學(xué)方法僅能檢測(cè)基因突變遺傳學(xué)終點(diǎn)的限制，通過采用電化學(xué)手段檢測(cè)細(xì)胞中嘌呤含量變化來指示基因突變的情況，首次建立了無標(biāo)記、快速、原位、實(shí)時(shí)檢測(cè)基因突變的試驗(yàn)新方法，手段簡(jiǎn)單，費(fèi)用低、誤差小，而且不需要熒光和放射性標(biāo)記，不會(huì)對(duì)試驗(yàn)人員健康造成傷害。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為實(shí)施例一中四種標(biāo)準(zhǔn)品與v79細(xì)胞循環(huán)伏安結(jié)果圖；其中，a為鳥嘌呤，b為黃嘌呤，c為腺嘌呤，d為次黃嘌呤，e為四種嘌呤混合物，f為V79細(xì)胞；I為信號(hào)一，2為信
號(hào)二 ;
[0015]圖2為實(shí)施例一中V79細(xì)胞加藥組峰值與對(duì)照組峰信號(hào)一電流強(qiáng)度變化趨勢(shì)；其中，I為加藥組，2為對(duì)照組；
[0016]圖3為實(shí)施例一中V79細(xì)胞加藥組峰值與對(duì)照組峰信號(hào)二電流強(qiáng)度變化趨勢(shì)；其中，I為加藥組，2為對(duì)照組。
【具體實(shí)施方式】
[0017]【具體實(shí)施方式】一:本實(shí)施方式的一種核糖轉(zhuǎn)移基酶基因突變的電化學(xué)檢測(cè)方法，其特征在于它是按以下步驟進(jìn)行:[0018]步驟一:將經(jīng)酸化處理的多壁碳納米管與離子液體研磨混合20_30min，直至形成均勻的電極修飾液，按0.01-0.07uL/mm2的滴涂量將電極修飾液均勻涂敷于玻碳電極表面，室溫下干燥，即得納米復(fù)合工作電極；其中，碳納米管與離子液體的質(zhì)量體積比為Img:(15μ L-25y L)；
[0019]步驟二:按4.5X104-5.5 X IO4個(gè)/cm2的接種量將模型細(xì)胞接種于含0.2-0.25mL/Cm2DMEM細(xì)胞完全培養(yǎng)液的η個(gè)培養(yǎng)皿中，放于37°C、C02體積百分含量為5%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h-50h后，取出培養(yǎng)皿，棄去DMEM細(xì)胞完全培養(yǎng)液，用pH=7.0-7.4的PBS緩沖溶液漂洗；然后每個(gè)培養(yǎng)皿中按21-24 μ L/cm2的加入量加入pH=7.0-7.4的PBS緩沖溶液，在45_55°C水浴中原位裂解細(xì)胞25-35min，獲得細(xì)胞裂解液；
[0020]其中，接種量是根據(jù)培養(yǎng)皿總面積內(nèi)所接種細(xì)胞總數(shù)量計(jì)算得到，DMEM細(xì)胞完全培養(yǎng)液含量是根據(jù)培養(yǎng)皿總面積內(nèi)所加入DMEM細(xì)胞完全培養(yǎng)液的總量計(jì)算得到，加入PBS緩沖溶液的量是根據(jù)培養(yǎng)皿總面積內(nèi)所加入PBS緩沖溶液的總量計(jì)算得到。
[0021]步驟三:用步驟一制備的納米復(fù)合工作電極分別檢測(cè)嘌呤堿基單體溶液、嘌呤堿基混合溶液和步驟二中得到的細(xì)胞裂解液的電化學(xué)信號(hào)，分析對(duì)比獲得的電化學(xué)檢測(cè)數(shù)據(jù)，確定細(xì)胞裂解液的電化學(xué)信號(hào)中嘌呤堿基電化學(xué)信號(hào)所在的峰位；其中，檢測(cè)前將所得納米復(fù)合工作電極置于pH=7.0~7.4的PBS溶液中，在0.0~1.1V范圍內(nèi)循環(huán)伏安法掃描至背景穩(wěn)定；納米復(fù)合工作電極工作條件為溫度25V、pH=7.2、掃描速度lOOmv/s ；所述的嘌呤堿基單體為鳥嘌呤、黃嘌呤、腺嘌呤或次黃嘌呤中的一種，嘌呤堿基單體溶液濃度為5X 10_6-9X 10_6M，溶劑為pH=7.0-7.4的PBS緩沖液；嘌呤堿基混合液由各嘌呤堿基單體和pH=7.0-7.4的PBS緩沖液混合制成，各嘌呤堿基單體在混合液中的終濃度均為5Χ10-6-9Χ10-6Μ ；
[0022]其中，各嘌呤堿基 單體均購(gòu)自百靈威科技有限公司。
[0023]步驟四:按4.5X104-5.5 X IO4個(gè)/cm2的接種量將模型細(xì)胞接種于含0.2-0.25mL/Cm2DMEM細(xì)胞完全培養(yǎng)液的η個(gè)培養(yǎng)皿中，放于37°C、C02體積百分含量為5%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-26h后，棄去DMEM細(xì)胞完全培養(yǎng)液，然后將η個(gè)培養(yǎng)皿隨機(jī)均分成二組，一組加入含有質(zhì)量百分含量為0.03-0.13%的致突變劑的無血清DMEM培養(yǎng)液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)l_3h，做為加藥組；另一組用4-6mL含有0.1%-0.5%DMS0的無血清DMEM培養(yǎng)液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)l_3h，做為陰性對(duì)照組；其中，二組無血清DMEM培養(yǎng)液的加入量均為0.2-0.25mL/cm2 ；
[0024]步驟五:將步驟四的兩組培養(yǎng)的細(xì)胞用緩沖液分別沖洗2-3次，然后加入DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，放于37°C、C02體積百分含量為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7-9天，每12h或24h進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)，然后以電化學(xué)檢測(cè)時(shí)間為橫坐標(biāo)，以在步驟三中嘌呤堿基電化學(xué)信號(hào)所確認(rèn)的峰位對(duì)應(yīng)的電壓下所測(cè)得的基因突變前和突變過程中細(xì)胞嘌呤核苷酸代謝電流信號(hào)為縱坐標(biāo)，建立HGPRT基因突變電化學(xué)信號(hào)變化規(guī)律圖，即完成一種核糖轉(zhuǎn)移基酶基因突變的電化學(xué)檢測(cè)方法；其中，DMEM細(xì)胞完全培養(yǎng)液加入量為0.2-0.25mL/cm2。
[0025]【具體實(shí)施方式】二:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一不同的是:步驟一中所述的研磨混合時(shí)間為30min。其它與【具體實(shí)施方式】一相同。
[0026]【具體實(shí)施方式】三:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一或二不同的是:步驟一中所述的電極修飾液滴涂量為0.02uL/mm2。其它與【具體實(shí)施方式】一或二相同。
[0027]【具體實(shí)施方式】四:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一至三之一不同的是:步驟一中所述的檢碳納米管與離子液體的質(zhì)量體積比為lmg:20y I。其它與【具體實(shí)施方式】一至三之一相同。
[0028]【具體實(shí)施方式】五:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一至四之一不同的是:步驟二中所述的放于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)時(shí)間為48h。其它與【具體實(shí)施方式】一至四之一相同。
[0029]【具體實(shí)施方式】六:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一至五之一不同的是:步驟二中所述的原位裂解細(xì)胞加入的PBS緩沖溶液的加入量為24μ L/cm2，pH=7.4，裂解溫度為50°C，時(shí)間為30min。其它與【具體實(shí)施方式】一至五之一相同。
[0030]【具體實(shí)施方式】七:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一至六之一不同的是:步驟三中所述的嘌呤堿基單體濃度均為8 X 10_6M，各嘌呤堿基單體在混合液中的終濃度均為8X 10_6M。其它與【具體實(shí)施方式】一至六之一相同。
[0031]【具體實(shí)施方式】八:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一至七之一不同的是:步驟二和步驟四中所述的模型細(xì)胞為中國(guó)倉(cāng)鼠肺V79細(xì)胞或中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢CHO細(xì)胞為模型細(xì)胞系。其它與【具體實(shí)施方式】一至七之一相同。
[0032]其中，中國(guó)倉(cāng)鼠肺V 79細(xì)胞或中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢CHO細(xì)胞購(gòu)買自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。
[0033]【具體實(shí)施方式】九:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一至八之一不同的是:步驟四中所述的模型細(xì)胞在DMEM細(xì)胞完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)時(shí)間為24h，加藥組和陰性對(duì)照組培養(yǎng)時(shí)間均為3h。其它與【具體實(shí)施方式】一至八之一相同。
[0034]【具體實(shí)施方式】十:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一至九之一不同的是:步驟四中所述的致突變劑為ENU或EMS，百分含量為0.06%, DMSO百分含量為0.1%。其它與【具體實(shí)施方式】一至九之一相同。
[0035]【具體實(shí)施方式】^:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一至十之一不同的是:步驟五中所述的培養(yǎng)時(shí)間為8天，每隔24h進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)。其它與【具體實(shí)施方式】一至十之一相同。
[0036]【具體實(shí)施方式】十二:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一至i 之一不同的是:步驟五中所述的緩沖液為D-Hanks液或PBS緩沖溶液。其它與【具體實(shí)施方式】一至十一之一相同。
[0037]【具體實(shí)施方式】十三:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一至十二之一不同的是:步驟五中所述的緩沖液沖洗次數(shù)為2次。其它與【具體實(shí)施方式】一至十二之一相同。
[0038]【具體實(shí)施方式】十四:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一至十三之一不同的是:步驟二、步驟四和步驟五中所述的接種量均為5X IO4個(gè)/cm2，步驟四中所述的二組無血清DMEM培養(yǎng)液的加入量均為0.23mL/cm2,步驟二和步驟五中所述的DMEM完全培養(yǎng)液加入量均為0.23mL/cm2。其它與【具體實(shí)施方式】一至十三之一相同。
[0039]實(shí)施例1
[0040]本實(shí)施例的一種核糖轉(zhuǎn)移基酶基因突變的電化學(xué)檢測(cè)方法，按以下步驟進(jìn)行:
[0041]步驟一:將5mg碳納米管與100 μ I離子液體混合,對(duì)其研磨20min直至形成均勻的電極修飾液，將0.07 μ I電極修飾液均勻涂敷于直徑為3mm的玻碳電極表面，室溫下干燥，即得納米復(fù)合工作電極；
[0042]步驟二:按5 X IO4個(gè)/cm2的接種量將v79模型細(xì)胞接種于含5mL DMEM細(xì)胞完全培養(yǎng)液的規(guī)格為60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，放于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，取出培養(yǎng)皿，棄去DMEM細(xì)胞完全培養(yǎng)液，用pH=7.4的PBS緩沖溶液漂洗；然后每皿加入500 μ I pH=7.4的PBS緩沖溶液，在50°C水浴中原位裂解細(xì)胞30min，獲得細(xì)胞裂解液；[0043]其中，中國(guó)倉(cāng)鼠肺V79模型細(xì)胞購(gòu)買自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。
[0044]步驟三:使步驟一制備的納米復(fù)合工作電極分別檢測(cè)細(xì)胞裂解液、嘌呤堿基單體、嘌呤堿基混合液的電化學(xué)信號(hào)，分析對(duì)比獲得的電化學(xué)檢測(cè)數(shù)據(jù)，確定細(xì)胞裂解液的電化學(xué)信號(hào)中嘌呤堿基電化學(xué)信號(hào)所在的峰位；其中，檢測(cè)前將所得納米復(fù)合工作電極置于pH=7.4的PBS溶液中，在0.0~1.1V范圍內(nèi)循環(huán)伏安法掃描至背景穩(wěn)定；納米復(fù)合工作電極工作條件為溫度25V、pH=7.2、掃描速度lOOmv/s ;所述的嘌呤堿基單體為鳥嘌呤、為黃嘌呤、為腺嘌呤或次黃嘌呤中的一種，嘌呤堿基單體溶液濃度為8X 10_6M，溶劑為pH=7.4的PBS緩沖液；嘌呤堿基混合液由各嘌呤堿基單體和pH=7.4的PBS緩沖液混合制成，各嘌呤堿基單體在混合液中的終濃度均為8X 10_6M。
[0045]其中，各嘌呤堿基單體均購(gòu)自百靈威科技有限公司。
[0046]步驟四:按5X104個(gè)/cm2的接種量將v79模型細(xì)胞接種于6個(gè)含5mL DMEM細(xì)胞完全培養(yǎng)液的規(guī)格為60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24h后，隨機(jī)均分成二組，一組用5ml含
0.043%致突變劑的無血清DMEM培養(yǎng)液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)3h，做為加藥組；另一組用5ml含有
0.1%DMS0的無血清DMEM培養(yǎng)液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)3h，做為陰性對(duì)照組。
[0047]步驟五:將步驟四的兩組培養(yǎng)的細(xì)胞分別用pH=7.4的PBS緩沖液沖洗2次，然后每皿加入5mL DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，放于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8天，每24h進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)，根據(jù)步驟三中嘌呤堿基電化學(xué)信號(hào)所確認(rèn)的峰位以及基因突變前和突變過程中細(xì)胞嘌呤核苷酸代謝電化學(xué)信號(hào)變化規(guī)律，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，電流信號(hào)為縱坐標(biāo)，建立HGPRT基因突變電化學(xué)信號(hào)變化規(guī)律圖，即完成一種核糖轉(zhuǎn)移基酶基因突變的電化學(xué)檢測(cè)方法。
[0048]與常規(guī)哺乳動(dòng)物突變?cè)囼?yàn)結(jié)果進(jìn)行比較，驗(yàn)證EMS致基因突變的電化學(xué)檢測(cè)方法的可靠性，常規(guī)哺乳動(dòng)物HGPRT位點(diǎn)基因突變?cè)囼?yàn)按照國(guó)標(biāo)法(GB15193.12-200，體外哺乳類細(xì)胞(V79/HGPRT)基因突變?cè)囼?yàn))進(jìn)行。結(jié)果如下表所示:
[0049]表1EMS對(duì)V79細(xì)胞HGPRT基因位點(diǎn)突變頻率的影響
【權(quán)利要求】
1.一種核糖轉(zhuǎn)移基酶基因突變的電化學(xué)檢測(cè)方法，其特征在于它是按以下步驟進(jìn)行: 步驟一:將經(jīng)酸化處理的多壁碳納米管與離子液體研磨混合20-30min，直至形成均勻的電極修飾液，按0.01-0.07uL/mm2的滴涂量將電極修飾液均勻涂敷于玻碳電極表面，室溫下干燥，即得納米復(fù)合工作電極；其中，碳納米管與離子液體的質(zhì)量體積比為Img:(15μ L-25y L)； 步驟二:按4.5X104-5.5X IO4個(gè)/cm2的接種量將模型細(xì)胞接種于含0.2-0.25mL/Cm2DMEM細(xì)胞完全培養(yǎng)液的η個(gè)培養(yǎng)皿中，放于37°C、C02體積百分含量為5%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h-50h后，取出培養(yǎng)皿，棄去DMEM細(xì)胞完全培養(yǎng)液，用pH=7.0-7.4的PBS緩沖溶液漂洗；然后每個(gè)培養(yǎng)皿中按21-24 μ L/cm2的加入量加入pH=7.0-7.4的PBS緩沖溶液，在45_55°C水浴中原位裂解細(xì)胞25-35min，獲得細(xì)胞裂解液； 步驟三:用步驟一制備的納米復(fù)合工作電極分別檢測(cè)嘌呤堿基單體溶液、嘌呤堿基混合溶液和步驟二中得到的細(xì)胞裂解液的電化學(xué)信號(hào)，確定細(xì)胞裂解液的電化學(xué)信號(hào)中嘌呤堿基電化學(xué)信號(hào)所在的峰位；其中，納米復(fù)合工作電極工作條件為溫度25°C、pH=7.2、掃描速度lOOmv/s ;所述的嘌呤堿基單體為鳥嘌呤、黃嘌呤、腺嘌呤或次黃嘌呤中的一種，嘌呤堿基單體溶液濃度為5X 10-6-9X IO-6M,溶劑為pH=7.0-7.4的PBS緩沖液；嘌呤堿基混合液由各嘌呤堿基單體和pH=7.0-7.4的PBS緩沖液混合制成，各嘌呤堿基單體在混合液中的終濃度均為5 X 10-6-9 X I(T6M ； 步驟四:按4.5Χ104-5.5Χ IO4個(gè)/cm2的接種量將模型細(xì)胞接種于含0.2-0.25mL/Cm2DMEM細(xì)胞完全培養(yǎng)液的η個(gè)培養(yǎng)皿中，放于37°C、C02體積百分含量為5%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-26h后，棄去DMEM細(xì)胞完全培養(yǎng)液，然后將η個(gè)培養(yǎng)皿隨機(jī)均分成二組，一組加入含有質(zhì)量百分含量為0.03-0.13%的致突變劑的無血清DMEM培養(yǎng)液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)l_3h，做為加藥組；另一組用含 有0.1%-0.5%DMS0的無血清DMEM培養(yǎng)液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)l_3h，做為陰性對(duì)照組；其中，二組無血清DMEM培養(yǎng)液的加入量均為0.2-0.25mL/cm2 ； 步驟五:將步驟四的兩組培養(yǎng)的細(xì)胞用緩沖液分別沖洗2-3次，然后加入DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，放于37°C、C02體積百分含量為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7-9天，每12h或24h進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)，然后以電化學(xué)檢測(cè)時(shí)間為橫坐標(biāo)，以在步驟三中嘌呤堿基電化學(xué)信號(hào)所確認(rèn)的峰位對(duì)應(yīng)的電壓下所測(cè)得的基因突變前和突變過程中細(xì)胞嘌呤核苷酸代謝電流信號(hào)為縱坐標(biāo)，建立HGPRT基因突變電化學(xué)信號(hào)變化規(guī)律圖，即完成一種核糖轉(zhuǎn)移基酶基因突變的電化學(xué)檢測(cè)方法；其中，DMEM細(xì)胞完全培養(yǎng)液加入量為0.2-0.25mL/cm2。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種核糖轉(zhuǎn)移基酶基因突變的電化學(xué)檢測(cè)方法，其特征在于步驟一中所述的碳納米管與離子液體的質(zhì)量體積比為lmg:20y L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種核糖轉(zhuǎn)移基酶基因突變的電化學(xué)檢測(cè)方法，其特征在于步驟二中所述的原位裂解細(xì)胞加入的PBS緩沖溶液的加入量為24μ L/cm2，pH=7.4，裂解溫度為50°C，時(shí)間為30min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種核糖轉(zhuǎn)移基酶基因突變的電化學(xué)檢測(cè)方法，其特征在于步驟三中所述的嘌呤堿基單體濃度均為8 X 10_6M，各嘌呤堿基單體在混合液中的終濃度均為 8Χ10-6Μ。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種核糖轉(zhuǎn)移基酶基因突變的電化學(xué)檢測(cè)方法，其特征在于步驟四中所述的致突變劑為ENU或EMS，質(zhì)量百分含量均為0.06%, DMSO質(zhì)量百分含量為.0.1%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種核糖轉(zhuǎn)移基酶基因突變的電化學(xué)檢測(cè)方法，其特征在于步驟二和步驟四中所述的模型細(xì)胞為中國(guó)倉(cāng)鼠肺V79細(xì)胞或中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢CHO細(xì)胞為模型細(xì)胞系。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種核糖轉(zhuǎn)移基酶基因突變的電化學(xué)檢測(cè)方法，其特征在于步驟四中所述的模型細(xì)胞在DMEM細(xì)胞完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)時(shí)間為24h，加藥組和陰性對(duì)照組培養(yǎng)時(shí)間均為3h。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種核糖轉(zhuǎn)移基酶基因突變的電化學(xué)檢測(cè)方法，其特征在于步驟五中所述的培養(yǎng)時(shí)間為8天，每隔24h進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種核糖轉(zhuǎn)移基酶基因突變的電化學(xué)檢測(cè)方法，其特征在于步驟五中所述的緩沖液為D-Hanks液或PBS緩沖溶液。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種核糖轉(zhuǎn)移基酶基因突變的電化學(xué)檢測(cè)方法，其特征在于步驟二、步驟四和步驟五中所述的接種量均為5X IO4個(gè)/cm2，步驟四中所述的二組無血清DMEM培養(yǎng)液的加入量均為0.23mL/cm2,步驟二和步驟五中所述的DMEM完全培養(yǎng)液加入量均為 0.23mL/cm 2。
【文檔編號(hào)】G01N27/26GK103540661SQ201310487581
【公開日】2014年1月29日 申請(qǐng)日期:2013年10月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月17日
【發(fā)明者】李錦蓮, 武冬梅, 藺潤(rùn)先, 劉繼光, 王景濤, 朱金玲, 高廣剛 申請(qǐng)人:佳木斯大學(xué)