一種用于檢測溴氰菊酯的試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于檢測農(nóng)藥溴氰菊酯的試劑盒，所述的試劑盒由試劑組和包被板組成，所述試劑組包括濃縮PBS緩沖液、顯色底物、濃縮洗滌液、終止液、溴氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)溶液、溴氰菊酯酶標(biāo)抗原，溴氰菊酯半抗原與辣根過氧化物酶的偶聯(lián)物，使用時(shí)用PBS緩沖液稀釋10萬倍。本發(fā)明克服了傳統(tǒng)的理化分析方法繁瑣復(fù)雜，成本較高，分析速度較慢的問題，提供了簡潔，快速，靈敏，準(zhǔn)確的免疫分析技術(shù)。
【專利說明】一種用于檢測溴氰菊酯的試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于免疫學(xué)分析【技術(shù)領(lǐng)域】的一種定量檢測農(nóng)藥溴氰菊酯含量的試劑盒及其使用方法，涉及到有機(jī)化學(xué)合成、免疫化學(xué)、生物化學(xué)等技術(shù)，尤其適用于蔬菜、茶葉中溴氰菊酯殘留的快速檢測。
【背景技術(shù)】
[0002]擬除蟲菊酯(Pyrethroids)是一類重要的仿生性殺蟲劑,是國家提倡推廣的農(nóng)藥產(chǎn)品，據(jù)專家預(yù)測，仿生農(nóng)藥仍將是21世紀(jì)新農(nóng)藥開發(fā)的熱點(diǎn)。我國從20世紀(jì)70年代就開始對這類殺蟲劑進(jìn)行研制，它的合成和應(yīng)用是繼有機(jī)氯殺蟲劑、有機(jī)磷殺蟲劑、氨基甲酸酯殺蟲劑之后的一個(gè)新突破，也是殺蟲劑史上的第三個(gè)重要的里程碑。它是目前使用面積廣、用量大的農(nóng)用及衛(wèi)生殺蟲劑，占?xì)⑾x劑總產(chǎn)量的20%，占整個(gè)殺蟲劑使用面積的25%。隨著其使用量和品種的不斷增加，這類農(nóng)藥的抗性和殘留問題已引起人們的廣泛關(guān)注。為此，對農(nóng)藥溴氰菊酯的殘留限制也越來越嚴(yán)格。我國對于溴氰菊酯在農(nóng)產(chǎn)品中的殘留，有較嚴(yán)格的檢測標(biāo)準(zhǔn)
[0003]目前對于溴氰菊酯農(nóng)藥檢測的方法主要為氣相色譜法，正相高效液相色譜法和微型層析柱凈化毛細(xì)管氣相色譜法。但這些方法都存在檢測時(shí)間長，前處理復(fù)雜，消耗大量溶齊U，需昂貴儀器等缺點(diǎn)，并且不能進(jìn)行現(xiàn)場在線檢測或跟蹤監(jiān)測。因此，迫切需要發(fā)明一種簡便，快速，靈敏的檢測方法。
[0004]酶聯(lián)免疫吸附分析，即ELISA法。它利用酶標(biāo)記物同抗原抗體復(fù)合物的免疫反應(yīng)與酶的催化放大作用相結(jié)合，即保持了酶催化反應(yīng)的敏感性，又保持了抗原抗體的特異性，因而極大的提高了靈敏度。同時(shí)它又是一種非均相免疫分析，即在反應(yīng)中的每一步都有洗滌過程，因而除去了未反映物質(zhì)和干擾物質(zhì)。
[0005]半抗原是指，能與對應(yīng)抗體結(jié)合出現(xiàn)抗原-抗體反應(yīng)、又不能單獨(dú)激發(fā)人或動(dòng)物體產(chǎn)生抗體的抗原。它只有反應(yīng)原性，不具免疫原性，又稱不完全抗原。大多數(shù)多糖和所有的類脂都屬于半抗原。
[0006]通常，具有免疫原性的物質(zhì)分子量應(yīng)大于10000,而農(nóng)藥的分子量一般均小于1000, 一般不能刺激機(jī)體產(chǎn)生針對農(nóng)藥抗原決定簇的特異性抗體，因此必須與大分子載體偶聯(lián)后才具有免疫原性，這也是小分子免疫分析的基本模式。半抗原的結(jié)構(gòu)對抗體的選擇性至關(guān)重要，半抗原分子的設(shè)計(jì)與合成是小分子免疫分析技術(shù)的關(guān)鍵所在。半抗原分子的設(shè)計(jì)應(yīng)以農(nóng)藥親體以及有毒理學(xué)意義的代謝產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)為目標(biāo)化合物，針對被測定對象是單一農(nóng)藥或某一類農(nóng)藥，設(shè)計(jì)中應(yīng)相應(yīng)地突出特定農(nóng)藥的分子結(jié)構(gòu)或一類農(nóng)藥中共有的基本分子構(gòu)架(即母核)，合成相應(yīng)的單一特異性抗體和簇特異性抗體。對不具備活性基團(tuán)的農(nóng)藥分子通常以直接衍生化或者以原料合成，也可用待測農(nóng)藥代謝或降解產(chǎn)物作為半抗原。對于某些分子太小和不穩(wěn)定的農(nóng)藥，可合成其衍生化的半抗原。一般理想的半抗原分子應(yīng)盡量具備與待測物類似的立體化學(xué)特征，以減少免疫交叉反應(yīng)性，提高抗體的特異性；同時(shí)，要保證半抗原與載體的大分子復(fù)合后，半抗原的特征結(jié)構(gòu)能最大限度地被免疫活性細(xì)胞所識(shí)別，以制備出具有預(yù)期選擇性和高親和力的抗體。人工抗原是半抗原與大分子載體蛋白偶聯(lián)得到的完全抗原。使用載體不是簡單地增加半抗原的分子量，更重要的是利用其較強(qiáng)的免疫原性誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，從而使機(jī)體產(chǎn)生針對半抗原及人工抗原的特異性抗體。
[0007]免疫分析技術(shù)的關(guān)鍵是半抗原的分子設(shè)計(jì)，合成和人工全抗原及抗體的制備。因此，目標(biāo)分析物分子免疫學(xué)特性，以及如何通過化學(xué)或生化技術(shù)突出和利用這些特性，是該領(lǐng)域重要的研究內(nèi)容。這一技術(shù)已經(jīng)成為微量分析研究的嶄新領(lǐng)域，可與傳統(tǒng)分析方法并列成為一項(xiàng)新的分析途徑。此類溴氰菊酯人工抗原和特異性抗體以及以此為基礎(chǔ)建立免疫分析方法尚未見報(bào)道。
[0008]專利申請200810153758.3是關(guān)于農(nóng)藥溴氰菊酯人工半抗原及抗體的制備，
[0009]使用了結(jié)構(gòu)式
[0010]
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測溴氰菊酯的試劑盒，其特征在于:所述的試劑盒由試劑組和包被板組成，所述的試劑組包括: (1)濃縮PBS緩沖液:40mM磷酸鹽緩沖液，pH7.4，使用時(shí)用雙蒸水5倍稀釋； (2)顯色底物:四甲基聯(lián)苯胺-雙氧水溶液； (3)濃縮洗滌液:含1%吐溫-20的磷酸鹽緩沖溶液，使用時(shí)用雙蒸水5倍稀釋； (4)終止液:1.25M的硫酸； (5)溴氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)溶液:其溴氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)溶液母液為lmg/mL，使用時(shí)用PBS緩沖溶液稀釋到100yg/mL后，再按1:4稀釋6個(gè)梯度； (6)溴氰菊酯酶標(biāo)抗原:溴氰菊酯半抗原與辣根過氧化物酶的偶聯(lián)物，使用時(shí)用PBS緩沖液稀釋10萬倍； 所述的包被板是將制備好的抗體溶于50mmol,pH9~10的碳酸緩沖液中，配制成IOmg/ml的包被液，酶標(biāo)板每孔加100 μ L包被液，常溫靜置12-16小時(shí)，再將包被好酶標(biāo)板的每孔用吐溫20的磷酸鹽緩沖溶液0.05% (ν/ν)洗滌3次；酶標(biāo)板每孔加入200 μ L，1%的BSA/PBS封閉液，封閉一小時(shí)，再將封閉好的酶標(biāo)板的每孔用吐溫20的磷酸鹽緩沖溶液0.05%(ν/ν)洗液洗滌3次，凍干后真空包裝，于4°C保存； 上述使用的抗體采用如下步驟制得: 免疫:免疫動(dòng)物采用雄性新西蘭大耳白兔，免疫方法采用皮下和肌肉注射法，共進(jìn)行6次免疫，加強(qiáng)免疫分別在初次免疫后第2周，第4周和第6周進(jìn)行三次，以后兩次為一個(gè)月進(jìn)行一次，從第3次免疫后·開·始采血測效價(jià)，采血時(shí)間為免疫后第10天； 初次免疫:取Img人工抗原溶于0.9%的NaCL和弗式完全佐劑等體積配制的溶液中，進(jìn)行動(dòng)物免疫； 加強(qiáng)免疫:取0.5mg人工抗原溶于0.9%的NaCL和弗式不完全佐劑等體積配制的溶液中，進(jìn)行動(dòng)物免疫； 抗體純化:定時(shí)檢測動(dòng)物抗體效價(jià)，當(dāng)抗體對包被抗原達(dá)到適宜效價(jià)時(shí)，采集血液，并離心獲得抗血清，使用G-Sepharose蛋白親和層析柱對抗血清進(jìn)行純化,制備IgG抗體； 上述所述人工抗原采用如下方法制備: (1)合成6-氨基己酸甲酯 反應(yīng)式:
2.—種權(quán)利要求1所述試劑盒用于檢測溴氰菊酯的含量，其特征在于，包括如下步驟:(1)室溫下樣品的前處理； (2)檢測前，將試劑盒打開，所有試劑和標(biāo)本都必須在室溫下平衡1-2小時(shí)； (3)加樣與競爭反應(yīng):將用NaOH處理30分鐘的待測物溶于PBS中并梯度稀釋，溴氰菊酯酶標(biāo)抗原也溶于PBS中，加樣時(shí)酶標(biāo)板每孔加入100 μ L待測物和溴氰菊酯酶標(biāo)準(zhǔn)溶液，競爭反應(yīng)I小時(shí)； (4)顯色:顯色底物使用四甲基聯(lián)苯胺-雙氧水溶液，酶標(biāo)板每孔加150μ L四甲基聯(lián)苯胺-雙氧水溶液，顯色20分鐘后每孔加50 μ L15mol/L的硫酸終止，反應(yīng)液在自動(dòng)酶標(biāo)儀上讀數(shù)。
【文檔編號(hào)】G01N33/543GK103529198SQ201310500092
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月22日
【發(fā)明者】溫雷 申請人:天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司