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      一種基于多巴胺仿生修飾的免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用的制作方法

      文檔序號:6180871閱讀:441來源:國知局
      一種基于多巴胺仿生修飾的免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用的制作方法
      【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于多巴胺仿生修飾的無酶電化學(xué)免疫傳感器電極的制備方法及應(yīng)用,涉及納米科學(xué)、生物免疫技術(shù)、電化學(xué)傳感等領(lǐng)域。本發(fā)明利用多巴胺仿生修飾對電極進(jìn)行功能化,利用聚多巴胺修飾層的還原特性原位合成具有酶催化活性的鉑、銀、鈀等金屬納米顆粒。通過與金屬納米顆粒及聚多巴胺修飾層的相互作用將抗體固定在電極表面?;诮饘偌{米顆粒對H2O2還原反應(yīng)的電催化作用及抗體分子對抗原的識別作用,實(shí)現(xiàn)對腫瘤標(biāo)志物的電化學(xué)免疫分析。該方法不僅步驟簡單,操作容易,成本低廉,而且具有較高的電化學(xué)活性及良好的響應(yīng)性能,解決了常規(guī)方法納米材料合成困難、缺乏簡單而有效的固定方法等問題。該方法可以適用于多種腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器電極的制備,在科研和臨床中具有廣泛的應(yīng)用前景。
      【專利說明】一種基于多巴胺仿生修飾的免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用
      【技術(shù)領(lǐng)域】
      [0001]本發(fā)明涉及納米科學(xué)、生物免疫技術(shù)、電化學(xué)傳感等領(lǐng)域,具體涉及一種基于多巴胺仿生修飾的無酶電化學(xué)免疫傳感器電極的制備方法及應(yīng)用。
      【背景技術(shù)】
      [0002]腫瘤標(biāo)志物檢測是目前唯一無創(chuàng)的早期預(yù)警癌癥的方法,在臨床中對腫瘤的普查、診斷及判斷預(yù)后等具有十分重要的意義。在眾多的腫瘤標(biāo)志物檢測方法中,電化學(xué)免疫分析具有操作簡便、樣品量少、快速靈敏、成本低廉且易于實(shí)現(xiàn)微型化等優(yōu)點(diǎn),在臨床和科研中得到了廣泛應(yīng)用。
      [0003]早期的電化學(xué)免疫傳感器通常通過對抗原或抗體進(jìn)行酶標(biāo)記來檢測信號,但酶標(biāo)操作費(fèi)時(shí),并且酶對環(huán)境要求較高,特別是當(dāng)酶結(jié)合到固體載體表面后容易失活。因此基于具有酶催化活性的納米材料構(gòu)建的無酶電化學(xué)免疫傳感器引起了人們極大的研究興趣。而其中無標(biāo)記型電化學(xué)免疫傳感器又具有步驟簡單、方便快速、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn),具有良好的應(yīng)用前景。但依然存在納米材料合成困難、缺乏簡單而有效的固定方法等問題。
      [0004]對工作電極的修飾及納米材料的制備是構(gòu)建無酶電化學(xué)免疫傳感器的關(guān)鍵。多巴胺仿生修飾是一種非常簡單易行的表面功能化方法,可以對幾乎任何有機(jī)和無機(jī)材料表面進(jìn)行功能化。通過在弱堿性條件下的氧化聚合反應(yīng),在材料表面形成的聚多巴胺修飾層具有兒茶酚的反應(yīng)特性,可以通過Michael加成或希夫堿反應(yīng)與含有巰基或氨基的生物分子反應(yīng),將生物分子固定在材料表面上。同時(shí)聚多巴胺修飾層還具有還原特性,可以將金屬離子還原成納米顆粒,納米顆粒的形貌可以通過改變實(shí)驗(yàn)條件來控制。
      [0005]本發(fā)明首先利用多巴胺仿生修飾對電極進(jìn)行功能化,然后利用聚多巴胺修飾層的還原特性原位合成具有酶催化活性的鉬、銀、鈀等金屬納米顆粒。抗體可以通過與金屬納米顆粒及聚多巴胺修飾層的相互作用很好地固定在電極表面。基于金屬納米顆粒對H2O2還原反應(yīng)的電催化作用及抗體分子對抗原的識別作用,實(shí)現(xiàn)對腫瘤標(biāo)志物的電化學(xué)免疫分析。
      [0006]經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)的檢索發(fā)現(xiàn),CN101975807A公開了一種三維Pt-Pb納米花針式無酶葡萄糖傳感器電極及制備和應(yīng)用。CN102435649A公開了 一種Pt-Ag合金納米顆粒無酶葡萄糖傳感器電極的制備及應(yīng)用。CN102636536A公開了 一種Pt-Cu合金中空納米顆粒無酶葡萄糖傳感器電極的制備和應(yīng)用。CN103257166A公開了一種Pt納米花微型針式無酶葡萄糖傳感器電極及其制備方法。以上技術(shù)文獻(xiàn)均為葡萄糖傳感器,均未涉及免疫反應(yīng),且均未涉及多巴胺仿生修飾。
      [0007]CN103116023A公開了一種用于檢測腫瘤標(biāo)志物的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器及其制備方法和應(yīng)用。CN102262118A公開了一種檢測腫瘤標(biāo)志物的生物電化學(xué)傳感器及其制備方法。CN1614405A公開了一種腫瘤標(biāo)志物的電化學(xué)免疫測定方法及微體積免疫測定芯片。以上技術(shù)文獻(xiàn)均未涉及多巴胺仿生修飾。

      【發(fā)明內(nèi)容】
      [0008]本發(fā)明的目的之一是提供簡單易行的無酶電化學(xué)免疫傳感器電極的制備方法,解決電極修飾步驟復(fù)雜、重現(xiàn)性差等問題。
      [0009]本發(fā)明的目的之二是提供快速、低成本、通用的腫瘤標(biāo)志物檢測方法,為電化學(xué)免疫傳感器在臨床中的應(yīng)用提供技術(shù)基礎(chǔ)。
      [0010]一種基于多巴胺仿生修飾的無酶電化學(xué)免疫傳感器電極的制備方法及應(yīng)用,包括以下步驟:
      (1)多巴胺仿生修飾:用移液槍將3~10ML新配制的濃度為0.1~2.0 mg ? mL—1的鹽酸多巴胺溶液滴涂在處理、活化好的電極表面,室溫晾干;所述的鹽酸多巴胺溶液,PH為
      8.5,溶劑為10 mmol ? ml/1的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖溶液;所述的電極選自下列一種:3 mm玻碳電極、4 mm玻碳電極、5 mm玻碳電極、3 mm金電極、4 mm金電極、5mm金電極;
      (2)納米顆粒原位制備:用超純水多次沖洗步驟(1)制得的電極,然后用移液槍將3~10 ML濃度為0.5~5 mg ? mL—1的金屬納米顆粒的前軀體溶液滴涂在步驟(1)制得的電極表面,室溫晾干;所述的金屬納米顆粒為鉬納米顆粒、銀納米顆粒、鈀納米顆粒、鉬銀納米顆粒、鉬鈀納米顆粒、銀鈀納米顆粒中的一種;所述的前軀體溶液為氯鉬酸溶液、硝酸銀溶液、氯化鈀溶液、氯鉬酸硝酸銀混合溶液、氯鉬酸氯化鈀混合溶液、硝酸銀氯化鈀混合溶液;
      (3)抗體固定:用超純水多次沖洗步驟(2)制得的電極,用移液槍將腫瘤標(biāo)志物抗體溶液滴涂在步驟(2)制得的電極表面,4°C條件下晾干;所述的腫瘤標(biāo)志物為癌胚抗原(CEA)、前列腺特異性抗原(PSA )、糖蛋白抗原(CA 125 )、甲胎蛋白(AFP )乳腺癌易感基因(BRCAl)中的一種;
      (4)非特異性位點(diǎn)封閉:用超純水多次沖洗步驟(3)制得的電極,用移液槍將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的牛血清白蛋白(BSA)溶液滴涂在步驟(3)制得的電極表面,4°C條件下晾干;
      (5)抗原識別:用超純水多次沖洗步驟(4)制得的電極,用移液槍將腫瘤標(biāo)志物標(biāo)準(zhǔn)溶液或未知樣品溶液滴涂在步驟(4)制得的電極表面,4°C條件下晾干;
      (6)電化學(xué)檢測:用超純水多次沖洗步驟(5)制得的電極并作為工作電極,Ag/AgCl電極作為參比電極,Pt電極作為對電極,在pH為7.4的PBS緩沖溶液中加入10 ML濃度為1.0mmol -mr1的H2O2溶液作為底液,在電化學(xué)工作站上以即時(shí)電流模式測定_0.4 v電勢下的電流,實(shí)現(xiàn)對腫瘤標(biāo)志物的檢測。
      [0011]與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn):
      (1)該電極制備方法不僅步驟簡單,操作容易,成本低廉,而且具有較高的電化學(xué)活性及良好的響應(yīng)性能,解決了常規(guī)方法納米材料合成困難、缺乏簡單而有效的固定方法等問題;
      (2)多巴胺仿生修飾及原位制備的金屬納米顆粒便于進(jìn)行抗體的固定,避免了復(fù)雜的抗體固定過程及由此引起的失活問題;
      (3)該方法可以適用于多種腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器電極的制備,在科研和臨床中具有廣泛的應(yīng)用前景。
      【具體實(shí)施方式】
      [0012]下面結(jié)合 具體實(shí)施例,進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解,這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
      [0013]實(shí)施例1
      (1)多巴胺仿生修飾:用移液槍將3ML新配制的濃度為0.5 mg ? mL' pH為8.5的鹽酸多巴胺溶液滴涂在處理、活化好的3 mm玻碳電極表面,室溫晾干;
      (2)納米顆粒原位制備:用超純水多次沖洗步驟(1)制得的電極,然后用移液槍將3ML濃度為0.5 mg ? mL-1的硝酸銀溶液滴涂在步驟(1)制得的電極表面,室溫晾干;
      (3)抗體固定:用超純水多次沖洗步驟(2)制得的電極,用移液槍將癌胚抗原(CEA)抗體溶液滴涂在步驟(2)制得的電極表面,4°C條件下晾干;
      (4)非特異性位點(diǎn)封閉:用超純水多次沖洗步驟(3)制得的電極,用移液槍將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的牛血清白蛋白(BSA)溶液滴涂在步驟(3)制得的電極表面,4°C條件下晾干;
      (5)抗原識別:用超純水多次沖洗步驟(4)制得的電極,用移液槍將癌胚抗原(CEA)標(biāo)準(zhǔn)溶液或未知樣品溶液滴涂在步驟(4)制得的電極表面,4°C條件下晾干; (6)電化學(xué)檢測:用超純水多次沖洗步驟(5)制得的電極并作為工作電極,Ag/AgCl電極作為參比電極,Pt電極作為對電極,在pH為7.4的PBS緩沖溶液中加入10 ML濃度為1.0mmol -mr1的H2O2溶液作為底液,在電化學(xué)工作站上以即時(shí)電流模式測定_0.4 v電勢下的電流,實(shí)現(xiàn)對癌胚抗原(CEA)的檢測。
      [0014]實(shí)施例2
      (1)多巴胺仿生修飾:用移液槍將5ML新配制的0.3 mg ? mL' pH為8.5的鹽酸多巴胺溶液滴涂在處理、活化好的4 _玻碳電極表面,室溫晾干;
      (2)納米顆粒原位制備:用超純水多次沖洗步驟(1)制得的電極,然后用移液槍將5ML濃度為1.0 mg ? mL-1的氯鉬酸溶液滴涂在步驟(1)制得的電極表面,室溫晾干;
      (3)抗體固定:用超純水多次沖洗步驟(2)制得的電極,用移液槍將前列腺特異性抗原(PSA)抗體溶液滴涂在步驟(2)制得的電極表面,4°C條件下晾干;
      (4)非特異性位點(diǎn)封閉:用超純水多次沖洗步驟(3)制得的電極,用移液槍將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的牛血清白蛋白(BSA)溶液滴涂在步驟(3)制得的電極表面,4°C條件下晾干;
      (5)抗原識別:用超純水多次沖洗步驟(4)制得的電極,用移液槍將前列腺特異性抗原(PSA)標(biāo)準(zhǔn)溶液或未知樣品溶液滴涂在步驟(4)制得的電極表面,4°C條件下晾干;
      (6)電化學(xué)檢測:用超純水多次沖洗步驟(5)制得的電極并作為工作電極,Ag/AgCl電極作為參比電極,Pt電極作為對電極,在pH為7.4的PBS緩沖溶液中加入10 ML濃度為1.0mmol -mr1的H2O2溶液作為底液,在電化學(xué)工作站上以即時(shí)電流模式測定_0.4 v電勢下的電流,實(shí)現(xiàn)對前列腺特異性抗原(PSA)的檢測。
      [0015]實(shí)施例3
      (1)多巴胺仿生修飾:用移液槍將10ML新配制的濃度為0.1 mg *mr\pH為8.5的鹽酸多巴胺溶液滴涂在處理、活化好的5 mm金電極表面,室溫晾干;
      (2)納米顆粒原位制備:用超純水多次沖洗步驟(1)制得的電極,然后用移液槍將10ML濃度為3.0 mg ? mL—1的氯化鈀溶液滴涂在步驟(1)制得的電極表面,室溫晾干;
      (3)抗體固定:用超純水多次沖洗步驟(2)制得的電極,用移液槍將甲胎蛋白(AFP)抗體溶液滴涂在步驟(2)制得的電極表面,4°C條件下晾干;
      (4)非特異性位點(diǎn)封閉:用超純水多次沖洗步驟(3)制得的電極,用移液槍將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的牛血清白蛋白(BSA)溶液滴涂在步驟(3)制得的電極表面,4°C條件下晾干;
      (5)抗原識別:用超純水多次沖洗步驟(4)制得的電極,用移液槍將甲胎蛋白(AFP)標(biāo)準(zhǔn)溶液或未知樣品溶液滴涂在步驟(4)制得的電極表面,4°C條件下晾干;
      (6)電化學(xué)檢測:用超純水多次沖洗步驟(5)制得的電極并作為工作電極,Ag/AgCl電極作為參比電極,Pt電極作為對電極,在pH為7.4的PBS緩沖溶液中加入10 ML濃度為1.0mmol -mr1的H2O2溶液作為底液,在電化學(xué)工作站上以即時(shí)電流模式測定_0.4 v電勢下的電流,實(shí)現(xiàn)對甲胎蛋白(AFP)的檢測。
      [0016] 實(shí)施例4
      (1)多巴胺仿生修飾:用移液槍將6ML新配制的濃度為2.0 mg ? mL' pH為8.5的鹽酸多巴胺溶液滴涂在處理、活化好的4 mm玻碳電極表面,室溫晾干;
      (2)納米顆粒原位制備:用超純水多次沖洗步驟(1)制得的電極,然后用移液槍將5ML濃度為2.0 mg ? mL-1的硝酸銀溶液滴涂在步驟(1)制得的電極表面,室溫晾干;
      (3)抗體固定:用超純水多次沖洗步驟(2)制得的電極,用移液槍將乳腺癌易感基因(BRCAl)抗體溶液滴涂在步驟(2)制得的電極表面,4°C條件下晾干;
      (4)非特異性位點(diǎn)封閉:用超純水多次沖洗步驟(3)制得的電極,用移液槍將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的牛血清白蛋白(BSA)溶液滴涂 在步驟(3)制得的電極表面,4°C條件下晾干;
      (5)抗原識別:用超純水多次沖洗步驟(4)制得的電極,用移液槍將乳腺癌易感基因(BRCAl)標(biāo)準(zhǔn)溶液或未知樣品溶液滴涂在步驟(4)制得的電極表面,4°C條件下晾干;
      (6)電化學(xué)檢測:用超純水多次沖洗步驟(5)制得的電極并作為工作電極,Ag/AgCl電極作為參比電極,Pt電極作為對電極,在pH為7.4的PBS緩沖溶液中加入10 ML濃度為1.0mmol -mr1的H2O2溶液作為底液,在電化學(xué)工作站上以即時(shí)電流模式測定_0.4 v電勢下的電流,實(shí)現(xiàn)對乳腺癌易感基因(BRCAl)的檢測。
      【權(quán)利要求】
      1.一種基于多巴胺仿生修飾的免疫傳感器的制備方法,其特征在于,包括以下步驟: (1)多巴胺仿生修飾:用移液槍將3~10ML新配制的濃度為0.1~2.0 mg ? ml/1的鹽酸多巴胺溶液滴涂在處理、活化好的電極表面,室溫晾干; (2)納米顆粒原位制備:用超純水多次沖洗步驟(1)制得的電極,然后用移液槍將3~10 ML濃度為0.5~5 mg ? mL—1的金屬納米顆粒的前軀體溶液滴涂在步驟(1)制得的電極表面,室溫晾干; (3)抗體固定:用超純水多次沖洗步驟(2)制得的電極,用移液槍將腫瘤標(biāo)志物抗體溶液滴涂在步驟(2)制得的電極表面,4°C條件下晾干; (4)非特異性位點(diǎn)封閉:用超純水多次沖洗步驟(3)制得的電極,用移液槍將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的牛血清白蛋白(BSA)溶液滴涂在步驟(3)制得的電極表面,4°C條件下晾干; (5)抗原識別:用超純水多次沖洗步驟(4)制得的電極,用移液槍將腫瘤標(biāo)志物標(biāo)準(zhǔn)溶液或未知樣品溶液滴涂在步驟(4)制得的電極 表面,4°C條件下晾干,即制得一種多巴胺仿生修飾的免疫傳感器。
      2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于多巴胺仿生修飾的免疫傳感器的制備方法,其特征在于,步驟(1)中,所述的鹽酸多巴胺溶液,PH為8.5,溶劑為10 mmol ? m^1的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖溶液。
      3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于多巴胺仿生修飾的免疫傳感器的制備方法,其特征在于,步驟(1)中,所述的電極選自下列一種:3 mm玻碳電極、4 mm玻碳電極、5 mm玻碳電極、3 mm金電極、4 mm金電極、5 mm金電極。
      4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于多巴胺仿生修飾的免疫傳感器的制備方法,其特征在于,步驟(2)中,所述的金屬納米顆粒為鉬納米顆粒、銀納米顆粒、鈀納米顆粒、鉬銀納米顆粒、鉬鈀納米顆粒、銀鈀納米顆粒中的一種;所述的前軀體溶液為氯鉬酸溶液、硝酸銀溶液、氯化鈀溶液、氯鉬酸硝酸銀混合溶液、氯鉬酸氯化鈀混合溶液、硝酸銀氯化鈀混合溶液。
      5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于多巴胺仿生修飾的免疫傳感器的制備方法,其特征在于,步驟(3 )中,所述的腫瘤標(biāo)志物為癌胚抗原(CEA)、前列腺特異性抗原(PSA)、糖蛋白抗原(CA125)、甲胎蛋白(AFP)、乳腺癌易感基因(BRCAl)中的一種。
      6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于多巴胺仿生修飾的免疫傳感器的制備方法,制備的免疫傳感器用于檢測,其特征在于,步驟如下:用超純水多次沖洗步驟(5)制得的電極并作為工作電極,Ag/AgCl電極作為參比電極,Pt電極作為對電極,在pH為7.4的PBS緩沖溶液中加入10 ML濃度為1.0 mmol ? mL—1的H2O2溶液作為底液,在電化學(xué)工作站上以即時(shí)電流模式測定-0.4 V電勢下的電流,實(shí)現(xiàn)對腫瘤標(biāo)志物的檢測。
      【文檔編號】G01N33/531GK103575874SQ201310508295
      【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年10月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月25日
      【發(fā)明者】馬洪敏, 魏琴, 楊焱明, 高丕成, 張勇, 吳丹, 范大偉 申請人:濟(jì)南大學(xué)
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