用于農(nóng)藥殘留速測(cè)的免疫阻抗生物傳感器檢測(cè)方法和檢測(cè)裝置制造方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種準(zhǔn)確度好，靈敏度高的用于液體中農(nóng)藥殘留檢測(cè)的免疫阻抗生物傳感器的檢測(cè)方法和裝置，該方法是把抗體交聯(lián)在工作電極上；測(cè)定固定抗體與不同濃度標(biāo)準(zhǔn)農(nóng)藥作用后阻抗值，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，再測(cè)量待測(cè)農(nóng)藥與固定抗體作用后阻抗值，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較而得出待測(cè)農(nóng)藥中的農(nóng)藥含量。該裝置包括注射泵、轉(zhuǎn)盤、電解槽、排出泵、工作電極、對(duì)電極和參比電極；轉(zhuǎn)盤內(nèi)有電解液通道、磷酸鹽緩沖液通道、待測(cè)樣本通道、電極清洗通道、電極預(yù)處理通道、抗體注入通道；各通道入口和出口分別位于轉(zhuǎn)盤同一圓周上；轉(zhuǎn)盤繞中心轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)，一通道入口和出口同時(shí)分別與注射泵出口、電解槽入口相通；電解槽出口與排出泵入口相通。該裝置可反復(fù)使用，重復(fù)性好，能保證檢測(cè)的一致性。
【專利說(shuō)明】用于農(nóng)藥殘留速測(cè)的免疫阻抗生物傳感器檢測(cè)方法和檢測(cè)裝置
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種對(duì)農(nóng)藥殘留速測(cè)的免疫阻抗生物傳感器檢測(cè)方法和檢測(cè)裝置。
【背景技術(shù)】
[0002]各國(guó)政府不斷加強(qiáng)農(nóng)藥殘留量的監(jiān)測(cè)工作，制定的標(biāo)準(zhǔn)越來(lái)越嚴(yán)格。農(nóng)藥殘留檢測(cè)和定量分析的常規(guī)方法是色譜、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等。這些方法的測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，是當(dāng)前農(nóng)殘分析的主流技術(shù)。但這些方法也存在儀器較昂貴，前處理時(shí)間長(zhǎng)、過(guò)程煩瑣等不足，只適合于在專業(yè)實(shí)驗(yàn)室中使用。目前，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上的農(nóng)藥速測(cè)方法以酶抑制法應(yīng)用較多，它是利用農(nóng)藥對(duì)某些特定酶，特別是膽堿酯酶的抑制作用，通過(guò)對(duì)比檢測(cè)水解后的底物或水解產(chǎn)物，以比色或分光光度分析的方法判定酶是否被抑制，從而測(cè)定農(nóng)藥殘留。這種方法快速、簡(jiǎn)單、方便，但也存在如下不足:
1、只能檢測(cè)農(nóng)藥的總殘留量，不能夠區(qū)分具體農(nóng)藥的種類；
2、顯色不穩(wěn)定，容易受周圍環(huán)境、溫度等影響，給判斷帶來(lái)誤差；
3、檢測(cè)精密度不高，易出現(xiàn)假陽(yáng)性、假陰性結(jié)果；
4、酶反應(yīng)條件苛刻,對(duì)操作要求高；
中國(guó)專利ZL 01253887.6公開(kāi)了探測(cè)農(nóng)藥殘留用的量熱式生物傳感器，它是通過(guò)測(cè)量流經(jīng)固定化酶柱的待測(cè)液體的溫度變化來(lái)檢測(cè)待測(cè)液體中的農(nóng)藥含量。其不足之處在于:結(jié)構(gòu)復(fù)雜，所用的固定化酶柱要求高。國(guó)際上研究快速檢測(cè)農(nóng)藥的生物傳感器論文在也有發(fā)表，主要還是基于酶生物傳感器，未見(jiàn)有用于檢測(cè)農(nóng)藥的免疫阻抗生物傳感器。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種用于液體中農(nóng)藥殘留檢測(cè)的免疫阻抗生物傳感器的檢測(cè)方法，它可以快速測(cè)定目標(biāo)農(nóng)藥在樣品中的殘留量，準(zhǔn)確度好，靈敏度高。
[0004]本發(fā)明的用于農(nóng)藥殘留速測(cè)的免疫阻抗生物傳感器檢測(cè)方法，使用免疫阻抗生物傳感器檢測(cè)裝置，免疫阻抗生物傳感器檢測(cè)裝置包括與阻抗分析儀電連接的工作電極、對(duì)電極和參比電極伸入到電解槽內(nèi)；阻抗分析儀與計(jì)算機(jī)相連；該檢測(cè)方法包括下述步驟:
a.電極清洗
以清洗物質(zhì)對(duì)工作電極、對(duì)電極和參比電極進(jìn)行清洗；
b.電極預(yù)處理
以硅烷溶液對(duì)電極處理；再以甲醇和水清洗電極去除非特異性吸附；
c.抗體固定
把農(nóng)藥抗體溶液注入電解槽內(nèi)，使抗體通過(guò)交聯(lián)固定在工作電極上；以磷酸鹽緩沖液和去離子水，對(duì)電極進(jìn)行清洗；
d.阻抗測(cè)試
把待測(cè)液體樣本注入電解槽，使得待測(cè)液體樣本與電極上的固定抗體發(fā)生特異性反應(yīng)；然后以磷酸鹽緩沖液通清洗電極，再把含有[Fe (CN) 6] 3_或者[Fe (CN) 6] 4_的電解液注入電解槽內(nèi)，然后以阻抗分析儀和計(jì)算機(jī)檢測(cè)并計(jì)算出電解液的法拉第阻抗；
e.數(shù)據(jù)分析
對(duì)不同濃度的農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別按照上述a-d步驟，得到與各濃度的農(nóng)藥相應(yīng)的法拉第阻抗，制定農(nóng)藥濃度與拉第阻抗的標(biāo)準(zhǔn)曲線；將待測(cè)液體樣本按照上述a-d步驟得到的法拉第阻抗，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線判斷待測(cè)液體樣本中的農(nóng)藥濃度。
[0005]上述的檢測(cè)方法，步驟a中，對(duì)電極清洗時(shí)，分別以丙酮、乙醇和去離子水進(jìn)行清洗，再以1:1:5 (ν/ν) Η202/ΝΗ40Η/Η20溶液清洗，10分鐘后，再以去離子水沖洗，后通入氮?dú)飧稍铮?br> 步驟b中，硅烷溶液為3-氨丙基三乙氧基硅烷；
步驟c中，含牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液中含有體積比為1%的牛血清白蛋白，磷酸鹽緩沖液的PH值為7.4;
步驟d中，電解液中，[Fe(CN)6] 3_與[?6(0的6] 4_的濃度比1:1;法拉第阻抗測(cè)試頻率IHz -1OOkHz，振幅為 ±5mV0
[0006]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明的檢測(cè)方法是以流動(dòng)注射的方式，將農(nóng)藥抗體固定在工作電極上，作為生物傳感器的敏感元件。固定抗體與溶液中的農(nóng)藥抗原發(fā)生特異性結(jié)合后，在電極表面形成“抗原一抗體”的復(fù)合物，改變雙電層的電荷轉(zhuǎn)移和表面層的電阻。通過(guò)測(cè)定固定抗體與不同濃度標(biāo)準(zhǔn)農(nóng)藥作用后系統(tǒng)的阻抗值的變化，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，再測(cè)量待測(cè)農(nóng)藥與固定抗體作用后的阻抗值，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，從而得出待測(cè)農(nóng)藥中的目標(biāo)農(nóng)藥的含量。本發(fā)明的檢測(cè)方法快速、簡(jiǎn)單、方便，同時(shí)準(zhǔn)確度高，靈敏度高，重復(fù)性好。
[0007]本發(fā)明同時(shí)提供一種為在上述檢測(cè)方法中使用的免疫阻抗生物傳感器檢測(cè)裝置，它結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、制作方便、成本低廉，可以反復(fù)使用，重復(fù)性好，能夠保證檢測(cè)的一致性。
[0008]本發(fā)明的在上述檢測(cè)方法中使用的免疫阻抗生物傳感器檢測(cè)裝置，包括注射泵、轉(zhuǎn)盤、電解槽、排出泵；與阻抗分析儀電連接的工作電極、對(duì)電極和參比電極伸入到電解槽內(nèi)；阻抗分析儀與計(jì)算機(jī)相連；轉(zhuǎn)盤內(nèi)具有沿著徑向延伸的6條通道:電解液通道、磷酸鹽緩沖液通道、待測(cè)樣本通道、電極清洗通道、電極預(yù)處理通道、抗體注入通道；6條通道的入口和出口分別位于轉(zhuǎn)盤的同一圓周上；當(dāng)轉(zhuǎn)盤繞中心轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)，一通道的入口和出口同時(shí)分別與注射泵的出口、電解槽的入口相通；電解槽的出口與排出泵的入口相通。
[0009]所述的免疫阻抗生物傳感器檢測(cè)裝置，還包括與排出泵的出口相通的廢液池。
[0010]所述的免疫阻抗生物傳感器檢測(cè)裝置，工作電極為盤陣微電極或叉指式帶列微電極。
[0011]本免疫阻抗生物傳感器檢測(cè)裝置的有益效果:使用時(shí)，均使用注射泵泵入各種物質(zhì)；而且通過(guò)轉(zhuǎn)盤的轉(zhuǎn)動(dòng)，能夠使得不同的通道分別與注射泵和電解槽相通，以通過(guò)不同的通道注入不同的物質(zhì)，保證檢測(cè)步驟的一致性和重復(fù)性，使用檢測(cè)的結(jié)果準(zhǔn)確性高。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0012]圖1是免疫阻抗生物傳感器檢測(cè)裝置的示意圖；
圖2是免疫阻抗生物傳感器檢測(cè)裝置的原理框圖。
[0013]圖3是電解槽的等效電路圖。[0014]圖4是對(duì)硫磷農(nóng)藥濃度一阻抗標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0015]參見(jiàn)圖1、2所示的用于農(nóng)藥殘留速測(cè)的免疫阻抗生物傳感器檢測(cè)裝置，由驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、反應(yīng)系統(tǒng)、檢測(cè)系統(tǒng)、控制系統(tǒng)組成。驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)由注射泵1，排出泵10組成，進(jìn)樣系統(tǒng)由轉(zhuǎn)盤2、導(dǎo)管3組成，電解槽4的反應(yīng)系統(tǒng)，檢測(cè)系統(tǒng)由工作電極5，對(duì)電極6，參比電極7組成，控制系統(tǒng)由阻抗分析儀8，計(jì)算機(jī)9組成，從電解槽的出口流出的廢液經(jīng)排出泵10排入廢液池11。工作電極可以為叉指式帶列微電極或者盤陣微電極(圓盤電極)，對(duì)電極為鉬電極，參比電極為Ag/AgCl電極。
[0016]與阻抗分析儀電連接的工作電極5、對(duì)電極6和參比電極7伸入到電解槽內(nèi)；阻抗分析儀與計(jì)算機(jī)相連。轉(zhuǎn)盤2內(nèi)具有沿著徑向延伸的6條通道:電解液通道A、磷酸鹽緩沖液通道B、待測(cè)樣本通道C、電極清洗通道D、電極預(yù)處理通道E、抗體注入通道F ；6條通道的入口位于靠近轉(zhuǎn)盤中心部的同一內(nèi)圓的圓周上；注射泵的出口與所述6條通道入口所在內(nèi)圓的圓周密封接觸。6條通道的出口位于轉(zhuǎn)盤外周的同一圓周上。導(dǎo)管的進(jìn)口與所述6條通道出口所在外圓的圓周密封接觸。導(dǎo)管的出口與電解槽的入口相通；電解槽的出口通過(guò)排液泵與廢液池相通?？诋?dāng)轉(zhuǎn)盤繞中心轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)，6條通道中任一通道的入口和出口可以同時(shí)分別與注射泵的出口、導(dǎo)管的入口相通。
[0017]對(duì)農(nóng)藥殘留速測(cè)的免疫阻抗生物傳感器檢測(cè)方法，是對(duì)電極經(jīng)過(guò)預(yù)處理后，固定農(nóng)藥抗體，加樣檢測(cè)得到交流阻抗譜，進(jìn)行等效電路擬合，通過(guò)比較不同濃度農(nóng)藥作用的電荷轉(zhuǎn)移電阻Ret值，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線；測(cè)得待測(cè)農(nóng)藥作用下的電荷轉(zhuǎn)移電阻Ret值，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，判定待測(cè)物中的目標(biāo)農(nóng)藥殘留濃度。其具體方法如下:
1、建立對(duì)硫磷農(nóng)藥的濃度一阻抗標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0018]a.電極清洗
以注射泵在2mL/min的速度下分別把4 mL丙酮、乙醇和去離子水通過(guò)電極清洗通道D注入電解槽內(nèi)并通過(guò)排出泵排出，再以注射泵把4mL的1: 1:5 (v/v) H2O2 /ΝΗ40Η/Η20混合溶液通過(guò)電極清洗通道D注入電解槽內(nèi)并排出，10分鐘后，再以注射泵注入去離子水徹底沖洗并排出，后通入氮?dú)飧稍?；?duì)工作電極、對(duì)電極和參比電極進(jìn)行清洗并干燥。
[0019]b.電極預(yù)處理
以注射泵把4mL 2% 3-氨丙基三乙氧基硅烷溶液通過(guò)電極預(yù)處理通道E注入電解槽內(nèi)并排出，處理電極工作；再以注射泵分別把甲醇和水清洗通過(guò)電極清洗通道注入電解槽內(nèi)并排出，清洗電極，去除非特異性吸附；
c.抗體固定
以注射泵把lmg/mL濃度的對(duì)硫磷多克隆抗體溶液4mL,在0.5mL/min的速度下,通過(guò)抗體注入通道注入電解槽內(nèi)并排出，使抗體通過(guò)交聯(lián)固定在工作電極上；20分鐘后以注射泵把含1%血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液(PH值為7.4)通過(guò)磷酸鹽緩沖液通道注入電解槽內(nèi)并排出，以注射泵把去離子水通過(guò)電極清洗通道注入電解槽內(nèi)并排出，對(duì)電極進(jìn)行清洗，去除未綁定的抗體。
[0020]d.阻抗測(cè)試
以注射泵把不同濃度的農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液通過(guò)待測(cè)樣本通道注入電解槽并排出，使得農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液與電極上的固定抗體發(fā)生特異性反應(yīng)；30分鐘后以注射泵把磷酸鹽緩沖液通過(guò)磷酸鹽緩沖液通道注入電解槽內(nèi)并排出，再以注射泵把0.01 mol/L的[Fe (CN)6]3_/4_ (1:1)磷酸鹽電解液通過(guò)電解液通道A泵入電解槽內(nèi)，然后以阻抗分析儀和計(jì)算機(jī)檢測(cè)電解液的交流阻抗譜，阻抗分析儀的采樣頻率范圍lHz-100 kHz，振幅為±5 mV。對(duì)交流阻抗譜采用圖3所示的等效電路擬合，計(jì)算出與農(nóng)藥濃度相應(yīng)的法拉第阻抗。圖3中，Ret表示電荷轉(zhuǎn)移電阻，Rt表示溶液電阻，Cdl表示雙層電容，CPE表示常相位角元件，代表氧化還原探針的屬性。
[0021]e.數(shù)據(jù)分析
根據(jù)得到的與各濃度的農(nóng)藥相應(yīng)的法拉第阻抗，制定農(nóng)藥濃度與拉第阻抗的標(biāo)準(zhǔn)曲線,如圖4所示。圖4中，縱坐標(biāo)表示電荷轉(zhuǎn)移電阻,單位歐姆；橫坐標(biāo)表示對(duì)硫磷農(nóng)藥的濃度，單位納克/毫升。
[0022]2、對(duì)硫磷農(nóng)藥的快速檢測(cè)
步驟a、b、C、d與上述相同，只不過(guò)以待測(cè)對(duì)硫磷農(nóng)藥代替農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液，計(jì)數(shù)出與待測(cè)對(duì)硫磷農(nóng)藥的農(nóng)藥濃度相應(yīng)的法拉第阻抗。然后以把待測(cè)對(duì)硫磷農(nóng)藥的法拉第阻抗與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，計(jì)算待測(cè)對(duì)硫磷農(nóng)藥中的農(nóng)藥濃度。
[0023]為了達(dá)到傳感器重復(fù)使用的目的，測(cè)試完后，在通過(guò)磷酸鹽緩沖液通道泵入磷酸鹽緩沖液沖洗，再通過(guò)電極清洗通道泵入蛋白質(zhì)去垢劑，去除電極表面結(jié)合的抗原抗體復(fù)合物。
[0024]本發(fā)明可以快速測(cè)定目標(biāo)農(nóng)藥在樣品中的殘留量，準(zhǔn)確度好，靈敏度高，可以重復(fù)使用。
[0025]最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。
【權(quán)利要求】
1.用于農(nóng)藥殘留速測(cè)的免疫阻抗生物傳感器檢測(cè)方法，使用免疫阻抗生物傳感器檢測(cè)裝置，免疫阻抗生物傳感器檢測(cè)裝置包括與阻抗分析儀電連接的工作電極、對(duì)電極和參比電極伸入到電解槽內(nèi)；阻抗分析儀與計(jì)算機(jī)相連；其特征在于:該檢測(cè)方法包括下述步驟: 電極清洗 以清洗物質(zhì)對(duì)工作電極、對(duì)電極和參比電極進(jìn)行清洗； 電極預(yù)處理 以硅烷溶液對(duì)電極處理；再以甲醇和水清洗電極去除非特異性吸附； 抗體固定 把農(nóng)藥抗體溶液注入電解槽內(nèi)，使抗體通過(guò)交聯(lián)固定在工作電極上；以磷酸鹽緩沖液和去離子水，對(duì)電極進(jìn)行清洗； 阻抗測(cè)試 把待測(cè)液體樣本注入電解槽，使得待測(cè)液體樣本與電極上的固定抗體發(fā)生特異性反應(yīng)；然后以磷酸鹽緩沖液通清洗電極，再把含有[Fe(CN)6] 3_或者[Fe(CN)6] 4_的電解液注入電解槽內(nèi)，然后以阻抗分析儀和計(jì)算機(jī)檢測(cè)并計(jì)算出電解液的法拉第阻抗； 數(shù)據(jù)分析 對(duì)不同濃度的農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別按照上述a-d步驟，得到與各濃度的農(nóng)藥相應(yīng)的法拉第阻抗，制定農(nóng)藥濃度與拉第阻抗的標(biāo)準(zhǔn)曲線；將待測(cè)液體樣本按照上述a-d步驟得到的法拉第阻抗，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲 線判斷待測(cè)液體樣本中的農(nóng)藥濃度。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于: 步驟a中，對(duì)電極清洗時(shí)，分別以丙酮、乙醇和去離子水進(jìn)行清洗，再以1: 1:5 (v/v)H2O2 /ΝΗ40Η/Η20溶液清洗，10分鐘后，再以去離子水沖洗，后通入氮?dú)飧稍铮? 步驟b中，硅烷溶液為3-氨丙基三乙氧基硅烷； 步驟c中，含牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液中含有體積比為1%牛血清白蛋白，磷酸鹽緩沖液的PH值為7.4; 步驟d中，電解液中，[Fe(CN)6] 3_與[?6(0的6] 4_的濃度比1:1;法拉第阻抗測(cè)試頻率IHz-1OOkHz，振幅為 ±5mV0
3.在權(quán)利要求1或2的檢測(cè)方法中使用的免疫阻抗生物傳感器檢測(cè)裝置，其特征在于:它包括注射泵、轉(zhuǎn)盤、電解槽、排出泵；與阻抗分析儀電連接的工作電極、對(duì)電極和參比電極伸入到電解槽內(nèi)；阻抗分析儀與計(jì)算機(jī)相連；轉(zhuǎn)盤內(nèi)具有沿著徑向延伸的6條通道:電解液通道、磷酸鹽緩沖液通道、待測(cè)樣本通道、電極清洗通道、電極預(yù)處理通道、抗體注入通道；6條通道的入口和出口分別位于轉(zhuǎn)盤的同一圓周上；當(dāng)轉(zhuǎn)盤繞中心轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)，一通道的入口和出口同時(shí)分別與注射泵的出口、電解槽的入口相通；電解槽的出口與排出泵的入口相通。
4.如權(quán)利要求3所述的免疫阻抗生物傳感器檢測(cè)裝置，其特征在于:它還包括與排出泵的出口相通的廢液池。
5.如權(quán)利要求3所述的免疫阻抗生物傳感器檢測(cè)裝置，其特征在于:工作電極為盤陣微電極或叉指式帶列微電極。
【文檔編號(hào)】G01N33/543GK103543180SQ201310520942
【公開(kāi)日】2014年1月29日 申請(qǐng)日期:2013年10月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月30日
【發(fā)明者】蔣雪松, 周宏平, 許林云, 茹煜 申請(qǐng)人:南京林業(yè)大學(xué)