一種檢測痕量酚類環(huán)境雌激素的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測痕量酚類環(huán)境雌激素的方法，屬于生物樣品和環(huán)境檢（監(jiān)）測【技術(shù)領(lǐng)域】。該方法中提取包括以下步驟：調(diào)節(jié)待測溶液的pH值為2.5～3.5，加入表面活性劑和萃取劑，超聲混勻，再低溫離心，棄去上層，采用高效液相色譜法定量檢測即可。本發(fā)明采用超聲輔助表面活性劑乳化微萃取技術(shù)，用低毒的表面活性劑替代丙酮、甲醇、乙腈等毒性分散劑，再結(jié)合高效液相色譜法（HPLC）定量檢測，具有高效、低毒、操作簡便、費用低等優(yōu)點，富集倍數(shù)達到200倍以上，檢測范圍為0.01～0.10μg/L，可廣泛用于螺旋藻生物樣品、環(huán)境、食品和藥品的中酚類環(huán)境雌激素的檢（監(jiān)）測分析。
【專利說明】一種檢測痕量酚類環(huán)境雌激素的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明具體涉及一種檢測痕量酚類環(huán)境雌激素的方法，屬于生物樣品和環(huán)境檢 (監(jiān))測【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]酚類環(huán)境雌激素是環(huán)境中最常見的一類具有雌激素活性的污染物。大量環(huán)境調(diào)查 結(jié)果和實驗室研究表明酚類環(huán)境雌激素如雙酚A、五氯酚和雌二醇等對近年來男性睪丸癌 和前列腺癌發(fā)病率的上升、精子數(shù)量的減少、女性乳腺癌、子宮癌發(fā)病率的增加、雄性動物 的雌性化和免疫功能的改變等均具有不容忽視的作用。故酚類環(huán)境雌激素(PEs)已成為近 年來重點研究和監(jiān)測的熱點污染物。目前，美國、日本和歐洲等國家已對水體中部分酚類環(huán) 境雌激素的最大殘留限量作了規(guī)定，一般在0.1y g/L甚至更低的水平。然而，目前的研究 結(jié)果表明:該類污染物在更低的水平下，仍然能夠?qū)ι锂a(chǎn)生雌激素效應。因此，建立該類 化合物在生物體內(nèi)的劑量一響應曲線，并確定其表現(xiàn)雌激素活性的閾值至關(guān)重要。為此，必 須盡快建立具有極高靈敏度和選擇性的定性和定量分析方法。
[0003]目前已有的萃取技術(shù)絕大多數(shù)還是依賴于液液萃取或固相萃取進行分離和富集， 操作過程比較繁瑣，有機溶劑揮發(fā)污染嚴重，檢測費用較高。且現(xiàn)有的微萃取技術(shù)所使用的 萃取劑和分散劑仍存在一定的毒性和污染問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種檢測痕量酚類環(huán)境雌激素的方法。
[0005]為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:
[0006]一種檢測痕量酚類環(huán)境雌激素的方法，主要包括提取和檢測兩個步驟，所述的提 取包括以下步驟:調(diào)節(jié)待測溶液的PH值為2.5?3.5 (以利于提高微萃取回收率)，加入表 面活性劑和萃取劑，超聲混勻，再低溫離心，棄去上層即可。
[0007]所述的酚類環(huán)境雌激素為雙酚A (BPA)、17 a-雌二醇(17 a-Estradiol )、4_叔丁 基酚(4-BP )、4溴雙酚A (4-Br-BPA )和/或4-叔辛基酚(4_t_0P )。
[0008]所述的表面活性劑為十二烷基硫酸鈉(SDS)、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)或吐 溫，如吐溫20。優(yōu)選十二烷基硫酸鈉。
[0009]所述的萃取劑為氯苯(C6H5Cl )、四氯甲烷(CCl4)或三氯甲烷(CHCl3X優(yōu)選三氯甲燒。
[0010]所述超聲的功率為350?450W，開關(guān)間隔為5s: 3s (即開5s關(guān)3s)，共計40?60 次。優(yōu)選50次。
[0011]所述低溫離心的溫度為0?4°C,轉(zhuǎn)速為4000?6000rpm,時間為2?5min。優(yōu)選 的，低溫超速離心的溫度為4°C,轉(zhuǎn)速為5000rpm,時間為2min。
[0012]所述的檢測包括如下步驟:將提取得到的溶液用高效液相色譜儀進行定量檢測， 流動相為乙腈和去離子水，梯度洗脫條件為:0?6min,乙腈:水=45:55 ；6?20min,乙腈:水=70:30 ;柱溫為25°C，紫外波長為270nm，流速為0.8mL/min，進樣量為20y L。
[0013]一般的，在提取步驟之前，針對不同的樣品其前處理步驟存在差異，比如生物樣 品、環(huán)境樣品、食品或藥品等。
[0014]當檢測對象為生物樣品(如螺旋藻細胞)中酚類環(huán)境雌激素殘留時，需要對生物 樣品進行清洗、破碎和凈化處理，具體包括如下步驟:(I)清洗生物樣品去除培養(yǎng)基及部分 代謝產(chǎn)物，超聲破碎；(2)在超聲破碎后的樣品中加入濃硫酸凈化，靜置，離心，取上清液備 用。即采用濃硫酸磺化法凈化螺旋藻破碎細胞中如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等大分子物質(zhì)，超聲破碎后 樣品與濃硫酸的體積比為100:3。該上清液即為待測溶液。
[0015]所述步驟(I)中采用離心法清洗生物樣品，即將生物樣品離心取沉淀(生物樣品加 水后離心或生物樣品本身即為懸浮液)，在沉淀中加水再次離心，重復上述步驟，最后棄去 上清液即可。
[0016]所述步驟(I)中超聲破碎之前先在沉淀中加入適量的水，混勻后備用。對于螺旋 藻細胞懸浮液，優(yōu)選的，超聲破碎的功率為350?450W，開關(guān)間隔為5s:3s，開關(guān)間隔次數(shù)為 30次，共計50?60次。
[0017]所述步驟(2)靜置的時間為2?5min，優(yōu)選2min。超速離心的轉(zhuǎn)速為4000? 6000rpm,時間為2?5min,優(yōu)選轉(zhuǎn)速為5000rpm,時間為2min。
[0018]當檢測對象為環(huán)境樣品(如水樣)中痕量的酚類環(huán)境雌激素時,需要對水樣進行過 濾除雜操作(如過0.22 的濾膜除雜)，濾液即為待測溶液；或者在濾液中加入濃硫酸凈 化，靜置，離心，取上清液備用，該上清液即為待測溶液。
[0019]當檢測對象為食品或藥品(如螺旋藻片劑、顆粒劑等)中酚類環(huán)境雌激素殘留時， 需要對食品或藥品進行研碎、消化和磺化處理，具體包括如下步驟:將食品或藥品研碎，力口 A HNO3-HClO4 (4:1，V/V)的混合酸進行消化，加熱至溶液變?yōu)榍辶辽橛邪谉?，繼續(xù)加熱 至消化完全，加水離心或直接離心，在上清液中加入過量的濃硫酸，靜置，離心，取上清液備 用。最后一步得到的上清液即為待測溶液。
[0020]本發(fā)明的有益效果:
[0021]本發(fā)明采用超聲輔助表面活性劑乳化微萃取技術(shù)，與常規(guī)的分散液液微萃取技術(shù) 相比，替代了丙酮、甲醇和乙腈等毒性分散劑，以低毒的表面活性劑取而代之，具有高效、低 毒、操作簡便和低費用等優(yōu)點，可應用于復雜生物基質(zhì)樣品的痕量多殘留提取。
[0022]當檢測對象為生物、環(huán)境樣品或食品、藥品等中酚類環(huán)境雌激素殘留時，先采用濃 硫酸磺化法凈化樣品中如脂肪、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，創(chuàng)造一個有利于微萃取的良好基質(zhì) 條件，再結(jié)合超聲輔助表面活性劑乳化微萃取技術(shù)，即可用于復雜生物基質(zhì)樣品的分析，是 一種操作簡便、快速、成本低、富集效率高且對環(huán)境友好的樣品前處理新技術(shù)。該技術(shù)集采 萃取、濃縮和凈化于一體，結(jié)合高效液相色譜法(HPLC)可以快速檢測樣品中痕量酚類環(huán)境 雌激素，且富集倍數(shù)高(> 200倍)，高效、靈敏，檢測范圍達到0.01?0.10iig/L，可廣泛應 用于螺旋藻生物樣品、環(huán)境、食品和藥品的中酚類環(huán)境雌激素的檢(監(jiān))測分析。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1為萃取劑對酚類環(huán)境雌激素提取效率的影響效應圖；
[0024]圖2為萃取劑體積對酚類環(huán)境雌激素提取效率的影響效應圖；[0025]圖3為表面活性劑對酚類環(huán)境雌激素提取效率的影響效應圖；
[0026]圖4為超聲萃取時間對酚類環(huán)境雌激素提取效率的影響效應圖；
[0027]圖5為pH值對酚類環(huán)境雌激素提取效率的影響效應圖；
[0028]圖6為水樣和螺旋藻樣品中酚類環(huán)境雌激素的色譜圖。
【具體實施方式】
[0029]下述實施例僅對本發(fā)明作進一步詳細說明，但不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限制。
[0030]實施例1
[0031]自來水中酚類環(huán)境雌激素的檢測:
[0032]取自來水15mL，過0.22 y m的濾膜；取IOmL過濾后的自來水于15mL離心管中，力口 0.3mL濃硫酸調(diào)節(jié)溶液pH值為3，再加入500 u L SDS和50 y L CHCl3,將混合液震蕩搖勻， 超聲混勻，超聲功率為400W，開關(guān)間隔5s: 3s，共計50次，在5000rpm轉(zhuǎn)速下離心2min，底部 形成小液滴；用微量進樣器吸取底部小液滴40 ii L，采用優(yōu)化的高效液相色譜條件定量檢 測酚類環(huán)境雌激素的含量，流動相為乙腈和去離子水，梯度洗脫條件為:0?6min，乙腈:水 =45:55 ；6?20min,乙腈:水=70:30 ;柱溫為25°C，紫外波長為270nm，流速為0.8mL/min, 進樣量為20iiL。
[0033]實施例2
[0034]螺旋藻-350 (ASP-350)中酚類環(huán)境雌激素的檢測:
[0035]取IOmL處于對數(shù)生長期的螺旋藻ASP-350水樣，置于15mL離心管中，加去離子水 至15mL,離心2min,去上清液；將管底沉淀的ASP-350加去離子水至IOmL,離心2min,再將 沉淀ASP-350細胞加水至IOmL ;超聲破碎，功率為400W，開關(guān)間隔為5s:3s，開關(guān)間隔次數(shù) 為50次，總破碎處理時間為400s ;加0.3mL濃硫酸于離心管放置2min，在5000rpm的條件 下離心2min ;取上清液調(diào)節(jié)pH值為3，加入500 u L表面活性劑SDS和50 y L萃取劑CHCl3, 超聲混勻，超聲功率為400W，開關(guān)間隔5s: 3s，共計50次，高速低溫離心，轉(zhuǎn)速為5000rpm，溫 度為4°C，離心時間為2min ;用微量進樣針取離心管底的小液滴40 y L，采用優(yōu)化的高效液 相色譜條件定量檢測酚類環(huán)境雌激素的含量，流動相為乙腈和去離子水，梯度洗脫條件為: 0?6min，乙腈:水=45:55 ;6?20min，乙腈:水=70:30 ;柱溫為25°C，紫外波長為270nm, 流速為0.8mL/min,進樣量為20 u L。
[0036]實施例3
[0037]螺旋藻-834 (ASP-834)中酚類環(huán)境雌激素的檢測:
[0038]取IOmL處于對數(shù)生長期的螺旋藻ASP-834水樣，置于15mL離心管中，加去離子水 至15mL,離心2min,去上清液；將管底沉淀的ASP-834加去離子水至IOmL,離心2min,再將 沉淀ASP-834細胞加水至IOmL ;超聲破碎，功率為400W，開關(guān)間隔為5s:3s，開關(guān)間隔次數(shù) 為50次，總破碎處理時間為400s ;加0.3mL濃硫酸于離心管放置2min，在5000rpm的條件 下離心2min ;取上清液調(diào)節(jié)pH值為3，加入500 u L表面活性劑SDS和50 y L萃取劑CHCl3, 超聲混勻，超聲功率為400W，開關(guān)間隔5s: 3s，共計50次，高速低溫離心，轉(zhuǎn)速為5000rpm，溫 度為4°C，離心時間為2min ;用微量進樣針取離心管底的小液滴35 y L，采用優(yōu)化的高效液 相色譜條件定量檢測酚類環(huán)境雌激素的含量，流動相為乙腈和去離子水，梯度洗脫條件為: 0?6min，乙腈:水=45:55 ;6?20min，乙腈:水=70:30 ;柱溫為25°C，紫外波長為270nm,流速為0.8mL/min,進樣量為20 u L。
[0039]實施例4
[0040]螺旋藻片中酚類環(huán)境雌激素的檢測:
[0041]準確稱取螺旋藻片(南寧富萊欣生物牌，螺旋藻咀嚼片)樣品2.0g，研碎置于50mL 錐形瓶中；加入15mLHN03-HC104 (4:1, V/V)的混合酸消化，于電熱板上加熱，當溶液變?yōu)榍?亮無色并伴有白煙時，再繼續(xù)加熱(趕酸)至剩余體積約為2mL ;將消化液轉(zhuǎn)移到15mL離心 管中，加純水定容至15mL,加入0.3mL濃硫酸磺化,靜置2min,在5000rpm轉(zhuǎn)速下離心2min ； 取上清液10mL，再加500 u LSDS和50 y L CHCl3,混合液超聲混合，超聲功率為400W，開關(guān)間 隔5s:3s,共計50次,再在5000rpm條件下離心2min ;用用微量進樣針取離心管底的小液滴 35 y L，采用優(yōu)化的高效液相色譜條件定量檢測酚類環(huán)境雌激素的含量，流動相為乙腈和去 離子水，梯度洗脫條件為:0?6min,乙腈:水=45:55 ；6?20min,乙腈:水=70:30 ;柱溫 為25V ’紫外波長為270nm，流速為0.8mL/min,進樣量為20 u L。
[0042]試驗例
[0043]1、超聲輔助表面活性劑乳化微萃取條件的優(yōu)化
[0044](I)不同萃取劑對酚類環(huán)境雌激素提取效率的影響
[0045]試驗方法:采用相同的待測樣品，萃取劑分別采用氯苯(C6H5C1)、四氯甲烷(CCl4) 和三氯甲烷(CHCl3),體積為50 iiL，表面活性劑采用500 ii L SDS，超聲混勻的功率為 400W，開關(guān)間隔5s:3s，共計50次，采用高效液相色譜檢測雙酚A (BPA)、17 a -雌二醇 (17 a -Estradiol),4-叔丁基酚(4_BP)、4 溴雙酚 A (4-Br-BPA)和 4-叔辛基酚(4_t_0P) 的含量，測定結(jié)果如圖1所示。
[0046]從圖1可以看出，萃取劑為三氯甲烷時微萃取效果最佳。
[0047](2)不同萃取劑體積對酚類環(huán)境雌激素提取效率的影響
[0048]試驗方法:采用相同的待測樣品，萃取劑采用三氯甲烷，體積分別為20UL、 30 u L、40 u L、50 y和60 y L，表面活性劑采用500 u L SDS，超聲混勻的功率為400W,開關(guān)間 隔5s:3s，共計50次，采用高效液相色譜檢測5種酚類環(huán)境雌激素的含量，測定結(jié)果如圖2 所示。
[0049]從圖2可以看出，萃取劑體積為50li L時微萃取效果最佳。
[0050](3)不同表面活性劑對酚類環(huán)境雌激素提取效率的影響
[0051]試驗方法:表面活性劑分別采用十二烷基硫酸鈉(SDS)、十六烷基三甲基溴化銨 (CTAB)和吐溫20 (Tween-20)，其他試驗條件同上述。5種酚類環(huán)境雌激素的含量，測定結(jié) 果如圖3所示。
[0052]從圖3可以看出，表面活性劑為SDS時萃取效果最佳。
[0053](4)超聲萃取時間對酚類環(huán)境雌激素提取效率的影響
[0054]試驗方法:米用相同的待測樣品，超聲萃取時間如圖4橫坐標所不，萃取劑米用二 氯甲烷(CHCl3),體積為50 ii L，表面活性劑采用500 ii L SDS，超聲混勻的功率為400W，開關(guān) 間隔5s:3s，共計50次，采用高效液相色譜檢測5種酚類環(huán)境雌激素的含量，測定結(jié)果如圖 4所示。
[0055](5) pH值對酚類環(huán)境雌激素提取效率的影響
[0056]試驗方法:采用相同的待測樣品，pH值分別為2、3、4、5、6、7，萃取劑采用三氯甲烷(CHCl3),體積為50 ii L，表面活性劑采用500 ii L SDS，超聲混勻的功率為400W，開關(guān)間隔 5s:3s，共計50次，采用高效液相色譜檢測5種酚類環(huán)境雌激素的含量，測定結(jié)果如圖5所
/Jn o
[0057](6)不同樣品中酚類環(huán)境雌激素的色譜圖
[0058]試驗方法:分別取去離子水、溫瑞塘水樣以及螺旋藻-350、螺旋藻-793、螺旋藻-834水樣，前處理后采用超聲輔助表面活性劑乳化微萃取技術(shù)提取樣品中的酚類環(huán)境雌激素，萃取劑采用三氯甲烷(CHCl3),體積為50 ii L，表面活性劑采用500 ii L SDS，超聲混勻的功率為400W，開關(guān)間隔5s:3s，共計50次，采用高效液相色譜法檢測，色譜圖如圖6所
示
[0059]2、超聲輔助表面活性劑乳化微萃取的分析技術(shù)參數(shù)的測定
[0060]試驗條件:試驗樣品為螺旋藻-834，體積IOmL ;濃硫酸用量0.3mL ；50 u L 01(:13萃取劑；500 ii L SDS表面活性劑；超聲功率為400W，開關(guān)間隔5s:3s，共計50次。分析技術(shù)參數(shù)結(jié)果如下表1所示。
[0061]表1分析技術(shù)參數(shù)結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種檢測痕量酚類環(huán)境雌激素的方法，其特征在于:主要包括提取和檢測兩個步驟，所述的提取包括以下步驟:調(diào)節(jié)待測溶液的PH值為2.5~3.5，加入表面活性劑和萃取劑，超聲混勻，再低溫離心，棄去上層即可。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測痕量酚類環(huán)境雌激素的方法，其特征在于:所述的酚類環(huán)境雌激素為雙酚A、17 a -雌二醇、4-叔丁基酚、4溴雙酚A和/或4-叔辛基酚。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測痕量酚類環(huán)境雌激素的方法，其特征在于:所述的表面活性劑為十二烷基硫酸鈉、十六烷基三甲基溴化銨或吐溫。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測痕量酚類環(huán)境雌激素的方法，其特征在于:所述的表面活性劑為十二烷基硫酸納。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測痕量酚類環(huán)境雌激素的方法，其特征在于:所述的萃取劑為氯苯、四氯甲烷或三氯甲烷。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測痕量酚類環(huán)境雌激素的方法，其特征在于:所述的萃取劑為三氯甲烷。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測痕量酚類環(huán)境雌激素的方法，其特征在于:所述超聲的功率為350~450W，開關(guān)間隔為5s:3s，共計40~60次。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測痕量酚類環(huán)境雌激素的方法，其特征在于:所述的檢測包括如下步驟:將提取得到的溶液用高效液相色譜儀進行定量檢測，流動相為乙腈和去離子水，梯度洗脫條件為:0~6min,乙腈:水=45:55 ；6~20min,乙腈:水=70:30 ;柱溫為 25 0C，紫外波長為270nm，流速為0.8mL/min,進樣量為20 u L。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測痕量酚類環(huán)境雌激素的方法，其特征在于:當檢測對象為生物樣品中酚類環(huán)境雌激素殘留時，所述的待測溶液主要由以下步驟制備得到:(I)清洗生物樣品，超聲破碎；(2)在超聲破碎后的樣品中加入濃硫Ife，靜直，尚心，取上清液即得。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測痕量酚類環(huán)境雌激素的方法，其特征在于:當檢測對象為食品或藥品中酚類環(huán)境雌激素殘留時，所述的待測溶液主要由以下步驟制備得到:將食品或藥品研碎，加入HNO3-HClO4的混合酸進行消化，消化完全后加水離心或直接離心，在上清液中加入過量的濃硫酸，靜置，離心，取上清液即得。
【文檔編號】G01N30/02GK103558305SQ201310522774
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月28日
【發(fā)明者】王慧利, 王學東, 王永魁 申請人:溫州醫(yī)科大學