新霉素半定量金標快速檢測試劑盒及其檢測方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種新霉素半定量金標快速檢測試劑盒及其檢測方法和應用,屬于免疫學領域,所述試劑盒包括樣品稀釋液,酶標板和新霉素金標快速檢測條,所述檢測條是由樣品墊、金標抗體結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊組成;所述金標結合墊是膠體金標記的新霉素單克隆抗體;所述硝酸纖維素膜中部包被有二條檢測線和一條質控線,通過膠體金免疫層析技術將新霉素抗體和抗原的反應以有色反應顯現出來,檢測過程中可通過兩種檢測線顏色的變化判定乳制品中是否存在新霉素殘留及其殘留量范圍。本發(fā)明的檢測試劑盒能夠實現殘留物的半定量檢測,檢測方法簡單、時間短,檢測成本低,檢測范圍廣,檢測結果精確可靠,可廣泛應用于食品中新霉素半定量檢測。
【專利說明】新霉素半定量金標快速檢測試劑盒及其檢測方法和應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于免疫學領域,涉及快速檢測食品中氨基糖苷類抗生素新霉素殘留的試劑盒和方法。
【背景技術】
[0002]隨著經濟的發(fā)展和人們生活水平的提高,人們對食物的要求已不是簡單的填飽肚子,而是更多的關注食品的營養(yǎng)和安全。由于乳制品中除含有高質量蛋白質、脂肪、碳水化物外,還含有大量維生素和礦物質,被公認為迄今為止的一種比較理想的食品,因此乳和乳制品已成為人們非常喜愛的日常食品之一。
[0003]從大環(huán)境上看,預計在未來三年,中國的城市化速度進一步加強,到2013年,中國的城市人口可能超過農村人口,成為真正的以城市消費帶動全國消費的國家。再加上城鄉(xiāng)人口可支配收入的不斷增加以及三農政策的進一步落實和西部大開發(fā)進入攻堅階段,在客觀環(huán)境上,給中國乳業(yè)的發(fā)展提供了更加良好的平臺。
[0004]然而近幾年來,市場上頻繁出現劣質奶粉、勾兌酸奶、毒奶粉等惡性事件,乳品安全問題由此受到了全民的廣泛關注。自2008年以來乳制品安全問題層出不窮,在全國乃至全世界都造成了巨大的影響,給廣大消費者、乳制品行業(yè)以及眾多的奶牛養(yǎng)殖戶都帶來很大的損失。
[0005]乳制品的安全必須從源頭抓起,通過各種檢測技術對質量進行層層控制。由于乳制品生產涉及的原料數量巨大、來源眾多,因此如何實現原料的快速流通,實現大量原料奶樣品準確快速的篩選,是目前檢測技術急需突破的難點之一。
[0006]新霉素(neomycin, ΝΕ0)屬于氨基糖苷類抗生素(aminoglycosides),是由新霉胺和新霉二糖胺結合而成的,其抗菌譜廣,對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、結核桿菌、抗酸菌等均有良好的抑制作用。新霉素作為一種常用獸藥,常用于抑制畜禽的細菌性胃腸道感染。隨著新霉素在國內外養(yǎng)殖業(yè)中越來越廣泛地應用,其在動物源性食品中的殘留問題也日益突出。當其殘留量超過一定范圍時會對人和動物產生潛在的耳毒性和腎毒性,給人類健康造成了很大威脅。
[0007]我國農業(yè)部235號公告(2002)規(guī)定的新霉素最高殘留限量為:牛奶、羊奶500 μ g/kg,雞蛋SOOyg/kg,牛、羊、豬、雞、火雞、鴨的肌肉、脂肪、肝臟500 μ g/kg,牛、羊、豬、雞、火雞、鴨的腎臟10000 μ g/kg。目前,新霉素的殘留檢測方法主要包括微生物法、高效液相色譜法和免疫學測定法。這幾種方法各有優(yōu)勢,但都不能用于大量樣品的快速篩選檢測。
[0008]免疫層析測試技術是九十年代初發(fā)展起來的一項新技術,因其具有簡便、快速、直觀、敏感、高特異性等特點,在臨床診斷等諸多領域已得到廣泛應用,主要用于快速檢測血清或尿樣中的抗原成分;也可用于檢測樣品中的致病菌和其它有害成分等。目前也已在該方法靈敏度高和特異性強,反應快速,操作簡便,不需任何特殊儀器設備,適用于大量樣品的快速篩查和現場檢測。[0009]中國專利CN102778563A公開了一種膠體金試紙條,該試紙條由吸收墊、硝酸纖維素膜、金標墊、樣品墊依次層疊黏貼在塑料襯板上構成,硝酸纖維素膜上設有檢測線和質控線,金標墊包被有膠體金標記的能識別新霉素,阿米卡星和巴龍霉素的單克隆抗體。該發(fā)明還公開了一種膠體金試紙條的使用方法及其在新霉素殘留檢測中的應用。該發(fā)明可用于對牛奶、雞肉、豬肉、蝦肉、牛肉、羊肉、豬肝等組織樣品進行新霉素殘留快速檢測,最低檢測限為500 μ g/L,但低于農業(yè)部235公告中對新霉素在牛奶中的殘留限量400ng/kg的規(guī)定,且不能夠進行半定量檢測。
[0010]綜上所述,現有免疫層析技術的應用仍然存在無法實現殘留物的半定量檢測、檢測方法繁瑣、檢測耗時長、在實際工作中應用局限性大等缺陷。
【發(fā)明內容】
[0011]本發(fā)明的首要目的是提供一種食品中新霉素半定量快速檢測試劑盒,利用免疫層析技術實現牛奶等樣品中新霉素殘留的半定量檢測,使之具備當前快速檢測產品所有優(yōu)點的同時能夠實現殘留物的半定量檢測,并且檢測方法簡單、時間短,可廣泛應用于實際工作,為新霉素的殘留檢測提供了一種更安全、更簡便的檢測試劑盒及其檢測方法。
[0012]為了達到上述目的,本發(fā)明采用以下技術方案:
[0013]一種新霉素半定量金標快速檢測試劑盒,包括樣品稀釋液、酶標板和試紙條,所述試紙條由樣品墊、金標抗體結合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊順次搭接黏貼在底襯上,樣品墊和金標抗體結合墊上包被有MAX線。
[0014]所述金標抗體結合墊上包被膠體金顆粒標記的新霉素單克隆抗體;
[0015]所述硝酸纖維素膜上包被有兩條檢測線(T線)和一條質控線(C線),靠近金標抗體結合墊一端的為T1線,T1上包被有低濃度的新霉素-蛋白偶聯物,靠近吸水墊一端的為T2線,T2線上包被有高濃度的新霉素-蛋白偶聯物,濃度分別為0.05mg/mL和0.lmg/mL,包被量為I μ L/cm ;
[0016]所述質控線為能特異性認識單克隆抗體的羊抗鼠單克隆抗體,濃度為lmg/mL,包被量為I μ L/cm ;
[0017]所述試紙條的制備方法包括如下步驟:
[0018]一、金標抗體結合墊的制備
[0019]1.空白膠體金的制備:
[0020]采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒為25nm的膠體金溶液,具體方法為:在帶有磁力攪拌子的三角燒瓶中加入97.5ml雙蒸水和Iml 1%氯金酸溶液加熱至沸騰并持續(xù)沸騰3?5min后,加入1.5mLl%的檸檬酸三鈉溶液,繼續(xù)煮沸至液體呈現桔紅色,保持沸騰狀態(tài)IOmin后停止加熱,將燒瓶中的攪拌子取出,溶液置室溫充分冷卻后,冷藏備用;
[0021]2.膠體金標記抗體的制備:
[0022]取空白膠體金溶液100ml,加入濃度為0.lg/L的碳酸鉀溶液400?450 μ L,勻速緩慢攪拌7?IOmin后,在攪拌狀態(tài)下逐滴加入稀釋好的待標記抗體,ImL膠體金顆粒標記新霉素單克隆抗體的量為3ng,繼續(xù)攪拌30min后,離心,吸除上清,沉淀用金標抗體重懸液充分重懸;
[0023]所述金標抗體重懸液由四硼酸鈉、硼酸、蔗糖以及牛血清白等,其主用作用為將經離心后沉淀下來的膠體金標記抗體重新溶解并保證抗體應有的特性及其穩(wěn)定性。
[0024]3.金標抗體結合墊的制備:
[0025]將重懸好的金標抗體用金標抗體重懸液進行對倍稀釋后,按每條2ml的量包被于尺寸為30*lcm玻璃纖維素膜上,37°C干燥過夜,干燥后成金標抗體結合墊,于密封避光干燥處保存,使用時取出。
[0026]二、硝酸纖維素膜上T、C線的包被
[0027]1.新霉素-蛋白偶聯物的制備
[0028]取16mg NEO (新霉素)溶于ImL PBS中,20mg BSA (牛血清白蛋白)溶于ImL PBS中,將NEO溶液加入BSA溶液中放在磁力攪拌器上攪拌,取EDC (水溶性碳化二亞胺)30mg溶于1.5mL PBS中,將EDC液逐滴加入上述反應液中,攪拌反應2h,再將IOmg EDC溶于0.5mLPBS中,逐滴加入,室溫攪拌反應24h.。將反應產物裝入透析袋透析3d,每8h換液一次,透析后分裝于-20°C貯存。
[0029]2.T、C線的包被
[0030]調試好三維噴點平臺,將2種高低不同濃度的新霉素蛋白偶聯物通過劃線的方式按順序包被在硝酸纖維素膜上作為檢測線,同時進行羊抗鼠單克隆抗體的包被作為質控線,每條線間的間隔為5mm±0.1mm,37°C干燥2h,密封避光干燥處保存;
[0031]三、試紙條的組裝
[0032]將樣品墊、金標抗體結合墊、硝酸纖維素膜以及吸水墊按序搭接黏貼在PVC底板上,并在樣品墊和金標抗體結合墊的表面覆上MAX線,最后將貼好的底板在切條機上切割成寬為4mm的試紙條。
[0033]所述稀釋液為常用的磷酸緩沖溶液,內含表面活性劑,主要用于樣品的稀釋,并將樣品的PH值調整到最適狀態(tài);
[0034]所述酶標板為96孔酶標板,其主要用于樣品溶液的混勻并在檢測過程中擔當載體的作用。
[0035]本發(fā)明的另一目的是利用一種新霉素半定量金標快速檢測試劑盒檢測食品中新霉素殘留量的方法,包括以下步驟:
[0036]一、樣本檢測
[0037]1.原料奶樣本的檢測
[0038](I)取所需數量的微孔,置于微孔板上;
[0039](2)向每個微孔中依次加入100 μ L樣品稀釋液和100 μ L待測奶樣,混勻;
[0040](3)向每孔中插入金標檢測條,等待5分鐘觀察結果,30分鐘后結果無效。
[0041]2.奶粉樣本的檢測
[0042](I)稱取1.2g奶粉樣品,加入8.8mL蒸餾水溶解;
[0043](2)取所需數量的微孔,置于微孔板上;
[0044](3)向每個微孔中依次加入100 μ L樣品稀釋液和100 μ L待測奶樣,混勻。
[0045](4)向每孔中插入金標檢測條,等待5分鐘觀察結果,30分鐘后結果無效。
[0046]二、結果判斷
[0047]讀取結果時,檢測條應如圖2所示擺放方式,置于觀察者的正面,請勿從檢測條側面或倒置檢測條進行結果觀察,結果判定如圖2所示:[0048]?陰性:T線(檢測線,靠近樣品溶液的一端)和C線(對照線)均顯色,且無論顯色深淺都判斷為陰性,表示牛奶樣品中新霉素濃度低于200ppb或不含新霉素殘留。
[0049]?陽性:C線顯色,同時T2線顯色而Tl線不顯色,說明牛奶樣品的新霉素的殘留超過200ppb,但不高于400ppb ;當C線顯色,而兩條T線均不顯色時,說明牛奶樣品中的新霉素含量超過400ppb。
[0050]?無效:C線未顯色,無論T線有無顯色,均表明不正確的操作過程或檢測條已失效。
[0051]本發(fā)明試劑盒的技術原理如下:
[0052]根據抗原抗體反應原理,進行抗體膠體金的有效標記,同時在硝酸纖維素膜上劃制兩條不同檢測濃度的新霉素-蛋白偶聯物作為檢測線,該偶聯物能夠與樣本中的新霉素殘留物共同競爭金標記新霉素單克隆抗體形成有效的競爭抑制反應;再劃制一條濃度為lmg/ml羊抗鼠單克隆抗體作為質控線。在層析過程中樣本中的目標物殘留物與金標抗體結合墊上金標復合物發(fā)生反應,當層析到檢測線時,游離的金標抗體與與檢測線上蛋白偶聯物相結合,同時由于抗原抗體的可逆性反應,蛋白偶聯物還競爭已與目標物結合的金標抗體從而被檢測線捕獲顯色。樣本中目標物殘留量越多檢測線顯色就越淺,當樣本中的目標物達到一定濃度時,檢測線由于捕獲不到金標抗體不再顯色;多余的金標復合物繼續(xù)層析,達到質控線時被其上包被的羊抗鼠單克隆抗體捕獲從而顯色。
[0053]本發(fā)明還有一個目的 是一種新霉素半定量金標快速檢測試劑盒在食品中新霉素殘留量測定的應用。
[0054]有益效果:
[0055]該試劑盒主用的技術原理為通過膠體金免疫層析技術將小分子獸藥新霉素殘留檢測以可見的抗原抗體反應呈現出來,又通過兩條檢測線的控制,實現了乳制品中新霉素殘留物的半定量快速檢測。僅需通過對樣本簡單的前處理,在10-20min內即可實現對新霉素的殘留檢測。該試劑盒具有以下特點:
[0056]1.前處理簡單:只需將樣品離心后取下層脫脂奶再進行對倍稀釋后就可實現對乳制品中新霉素的檢測;
[0057]2.檢測時間短:在10-20min內即可實現對新霉素殘留檢測;
[0058]3.可實現半定量檢測:通過兩條檢測線的控制,根據顯色情況的不同,可實現樣品中新霉素殘留的半定量檢測;
[0059]4.單個樣品檢測成本低:相對于儀器和ELISA檢測,單個樣本所需檢測費用更低;
[0060]5.適用范圍廣:由于檢測條對操作環(huán)境要求不高也無需昂貴儀器支持,可實現實驗室、野外以及現場的檢測;
[0061]6.適用于大量樣品的快速篩選:由于具有前處理方法簡單、操作時間短等特點,可用于大量樣品的同時快速篩選檢測;
[0062]7.人員要求低:由于在整個檢測過程中需用的儀器及試劑較少,對實驗人員的專業(yè)要求不高,整個操作過程簡單,檢測結果肉眼就能進行判讀;
[0063]8.安全性較高:試劑盒內無任何有毒有害物質;
[0064]9.本產品與鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素等其他氨基糖苷類抗生素交叉反應率〈0.1%,與β-內酰胺類、四環(huán)素類、氯霉素、磺胺類和喹諾酮類等其他種類藥物交叉反應率〈0.1%。
[0065]本發(fā)明所研究的新霉素半定量金標快速檢測試劑盒,實現了對乳制品中新霉素殘留檢測并可對其殘留量進行半定量,具有檢測時間短,檢測成本低,檢測范圍廣等特點;檢測靈敏度符合國家和歐盟標準。因此,它符合國家對食品安全與出入境檢驗檢疫中檢測技術的發(fā)展要求,有利于提高食品安全與出入境檢驗檢疫工作的效率與準確率,有利于保證食品安全與進出口貿易,從而在公共安全領域發(fā)揮重要作用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0066]圖1為試紙條結構示意圖
[0067]圖中,1-PVC底襯2-吸水墊3-質控線4_Τ2線5_Τ1線6_金標抗體結合墊
[0068]7-樣品墊;
[0069]圖2為結果判定方法示意圖
[0070]圖中,a_陰性b_陽性C-無效;
[0071]圖3為實施例4檢測結果說明圖
【具體實施方式】
[0072]下面通過具體的實施方案敘述本發(fā)明。除非特別說明,本發(fā)明中所用的技術手段均為本領域技術人員所公知的方法。另外,實施方案應理解為說明性的,而非限制本發(fā)明的范圍,本發(fā)明的實質和范圍僅由權利要求書所限定。對于本領域技術人員而言,在不背離本發(fā)明實質和范圍的前提下,對這些實施方案中的物料成分和用量進行的各種改變或改動也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0073]實施例1試劑盒的靈敏度實驗
[0074]對于新霉素農業(yè)部235公告中規(guī)定其在牛奶中的殘留限量為400ng/kg,目前沒有國家標準可參考,僅在GB/T21323-2007 (動物組織中氨基糖苷類藥物殘留量的測定高效液相色譜-質譜質譜法)中有提及,但該方法只適用于動物組織中新霉素的殘留檢測。荷蘭EUR0-PR0XIMA新霉素檢測試劑盒可用于檢測牛奶樣品中該藥物的殘留檢測,檢測靈敏度為18ng/ml,可滿足陰性樣品的篩選要求。
[0075]取5份經荷蘭EUR0-PR0XIMA新霉素檢測試劑盒和經GB/T22969-2008國標方法檢測不含氨基糖苷類抗生素的牛奶樣本,進行不同濃度標準品的添加(表I)。每份樣品重復測定5次,以95%出現陽性結果的最低濃度作為試劑盒的檢測靈敏度。
[0076]5份奶樣不同濃度標準品添加的靈敏度測定結果見表I。結果表明,新霉素半定量金標快速檢測條,當其樣品中新霉素添加濃度達到200ng/mL時,Tl線(靠近加樣端一側)在75次檢測中僅有I份為陰性,陽性檢出率為98.7% ;當其添加濃度達到400ng/mL時,Tl和T2線陽性均為100%。因此,該試劑盒的兩條檢測線靈敏度分別為200和400ng/mL。
[0077]表I新霉素靈敏度實驗結果
[0078]
【權利要求】
1.一種新霉素金標快速檢測試劑盒,所述試劑盒包括稀釋液、酶標板和試紙條,所述試紙條包括樣品墊、金標抗體結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊,其特征在于,所述金標抗體結合墊上包被有膠體金標記的新霉素單克隆抗體;所述硝酸纖維素膜中部包被有兩條檢測線和一條質控線,兩條檢測線分別設置有能與金標新霉素單克隆抗體進行特異性結合的不同濃度的新霉素蛋白偶聯抗原,質控線設置有羊抗鼠IgG單克隆抗體。
2.根據權利要求1所述的一種新霉素金標快速檢測試劑盒,其特征在于,所述稀釋液為含有表面活性劑的磷酸緩沖溶液。
3.根據權利要求1所述的一種新霉素金標快速檢測試劑盒,其特征在于,所述金標抗體結合墊上的膠體金標記的新霉素單克隆抗體由新霉素單克隆抗體與25nm的膠體金顆粒以物理的方法結合組成。
4.根據權利要求1所述的一種新霉素金標快速檢測試劑盒,其特征在于,所述硝酸纖維素膜上檢測線包被的新霉素蛋白偶聯抗原,靠近膠體金結合墊端的包被濃度為0.05mg/ml,靠近吸水墊端的包被濃度為0.lmg/ml,包被量均為1μ L/cm。
5.根據權利要求1所述的一種新霉素金標快速檢測試劑盒,其特征在于,所述硝酸纖維素膜上質控線包被羊抗鼠單克隆抗體,濃度為lmg/mL,包被量為1μ L/cm。
6.根據權利要求1所述的一種新霉素金標快速檢測試劑盒,其特征在于,所述樣品墊和金標抗體結合墊上包被有MAX線。
7.根據權利要求1所述的一種多殘留金標快速檢測試劑盒的制備方法,包括如下步驟: (1)金標抗體結合墊的制備 ①.空白膠體金的制備: 采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒為25nm的膠體金溶液,具體方法為:在帶有磁力攪拌子的三角燒瓶中加入97.5ml雙蒸水和Iml 1%氯金酸溶液加熱至沸騰并持續(xù)沸騰3~5min后,加入1.5mLl%的檸檬酸三鈉溶液,繼續(xù)煮沸至液體呈現桔紅色,保持沸騰狀態(tài)IOmin后停止加熱,將燒瓶中的攪拌子取出,溶液置室溫充分冷卻后,冷藏備用; ②.膠體金標記抗體的制備: 取空白膠體金溶液100ml,加入濃度為0.lg/L的碳酸鉀溶液400~450 μ L,勻速緩慢攪拌7~IOmin后,在攪拌狀態(tài)下逐滴加入稀釋好的待標記抗體,1mL膠體金顆粒標記新霉素單克隆抗體的量為3ng,繼續(xù)攪拌30min后,離心,吸除上清,沉淀用金標抗體重懸液充分重懸; ③.金標抗體結合墊的制備: 將重懸好的金標抗體用金標抗體重懸液進行對倍稀釋后,按每條2ml的量包被于尺寸為30*lcm玻璃纖維素膜上,37°C干燥過夜,干燥后成金標抗體結合墊,于密封避光干燥處保存,使用時取出。 (2)硝酸纖維素膜上T、C線的包被 ①.新霉素-蛋白偶聯物的制備 取16mg NEO (新霉素)溶于1mL PBS中,20mg BSA (牛血清白蛋白)溶于1ImLPBS中,將NEO溶液加入BSA溶液中放在磁力攪拌器上攪拌,取EDC (水溶性碳化二亞胺)30mg溶于1.5mL PBS中,將EDC液逐滴加入上述反應液中,攪拌反應2h,再將IOmg EDC溶于0.5mLPBS中,逐滴加入,室溫攪拌反應24h.。將反應產物裝入透析袋透析3d,每8h換液一次,透析后分裝于-20°C貯存。 ②.T、C線的包被 調試好三維噴點平臺,將2種高低不同濃度的新霉素蛋白偶聯物通過劃線的方式按順序包被在硝酸纖維素膜上作為檢測線,同時進行羊抗鼠單克隆抗體的包被作為質控線,每條線間的間隔為5mm±0.1mm,37°C干燥2h,密封避光干燥處保存; (3)試紙條的組裝 將樣品墊、金標抗體結合墊、硝酸纖維素膜以及吸水墊按序搭接黏貼在PVC底板上,并在樣品墊和金標抗體結合墊的表面覆上MAX線,最后將貼好的底板在切條機上切割成寬為4mm的試紙條。
8.根據權利要求7所述的一種新霉素金標快速檢測試劑盒的制備方法,其特征在于,所述金標抗體重懸液包括 四硼酸鈉、硼酸、蔗糖以及牛血清白。
9.根據權利要求1所述的一種新霉素金標快速檢測試劑盒檢測食品中新霉素殘留量的方法,其特征在于,包括以下步驟: 一、樣本檢測 (1)取所需數量的微孔,置于微孔板上; (2)向每個微孔中依次加入100μ L樣品稀釋液和100 μ L待測樣品,混勾; (3)向每孔中插入金標檢測條,等待5分鐘觀察結果,30分鐘后結果無效; 二、結果判斷 陰性:Τ線和C線均顯色,且無論顯色深淺都判斷為陰性,表示樣品中新霉素濃度低于200ppb或不含新霉素殘留; 陽性:C線顯色,同時T2線顯色而Tl線不顯色,說明樣品的新霉素的殘留超過200ppb,但不高于400ppb ;當C線顯色,而兩條T線均不顯色時,說明樣品中的新霉素含量超過400ppb ; 無效:C線未顯色,無論T線有無顯色,均表明不正確的操作過程或檢測條已失效。
10.如權利要求1-6任意一項所述的新霉素金標快速檢測試劑盒在食品檢測中的應用。
【文檔編號】G01N33/577GK103743908SQ201310529332
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年10月31日 優(yōu)先權日:2013年10月31日
【發(fā)明者】王麗哲, 唐慧林, 何艷玲, 趙瑜, 王麗麗, 于重楠, 劉敏, 李瑾 申請人:北京陸橋技術有限責任公司