粗糙肌膚的評(píng)價(jià)方法
【專利摘要】本發(fā)明的課題在于，提供使用不會(huì)給用戶造成負(fù)擔(dān)、又可簡(jiǎn)便且確實(shí)地評(píng)價(jià)是否為粗糙肌膚的生物化學(xué)指標(biāo)的新型評(píng)價(jià)方法。通過(guò)膠帶剝離法等非侵襲式地采集皮膚角質(zhì)層，通過(guò)測(cè)定其中所含有的半乳糖凝集素-7的表達(dá)量來(lái)評(píng)價(jià)粗糙肌膚的程度。
【專利說(shuō)明】粗糙肌膚的評(píng)價(jià)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及粗糙肌膚的評(píng)價(jià)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]人體的皮膚經(jīng)常與外界接觸，會(huì)受到各種各樣的刺激。其代表性刺激為紫外線。即使也有紫外線不使肌膚在外觀上有較大變化的情況，但也會(huì)誘發(fā)皮膚細(xì)胞的DNA裂解、膠原蛋白的變性等而成為皮膚老化的原因。紫外線經(jīng)常不斷地給肌膚施加應(yīng)激。且對(duì)于女性來(lái)說(shuō)，洗臉、化妝等日常的行為也會(huì)給皮膚施加刺激，此種皮膚的外部刺激蓄積時(shí)，會(huì)形成被認(rèn)為是肌膚粗糙的狀態(tài)。肌膚粗糙雖指一時(shí)的癥狀，但該癥狀持續(xù)的狀態(tài)即稱為“粗糙肌膚”。
[0003]“粗糙肌膚”是指干燥、干巴巴的皮膚癥狀持續(xù)的狀態(tài)的總稱，其最顯著的臨床表現(xiàn)為鱗屑。此種粗糙肌膚狀態(tài)和皮膚的屏障功能之間存在密切的關(guān)系，已知粗糙肌膚狀態(tài)越嚴(yán)重，作為屏障功能的客觀指標(biāo)的經(jīng)皮水分喪失量(以下稱為T(mén)EWL)越高，作為由物理?化學(xué)的主要因素而產(chǎn)生的肌膚粗糙狀態(tài)的指標(biāo)，測(cè)定TEWL(非專利文獻(xiàn)1:日皮會(huì)志(日語(yǔ)原名:「日皮會(huì)誌」)、第92卷、第1001頁(yè)-1003頁(yè)、1982年)。
[0004]該粗糙肌膚被認(rèn)為是如前所述的紫外線、化學(xué)物質(zhì)、其他各種各樣的刺激影響皮膚內(nèi)部環(huán)境，從而產(chǎn)生表皮的屏障功能受到抑制的結(jié)果。
[0005]此種狀況呈現(xiàn)在皮膚上時(shí)，會(huì)產(chǎn)生如下變化，皮膚內(nèi)部影響細(xì)胞增殖?分化的前列腺素、細(xì)胞因子的濃度上升(非專利文獻(xiàn)2 J.1nvest.Dermatol、Vol.81、519_523、1983)、核酸(DNA)合成機(jī)能的允進(jìn)(非專利文獻(xiàn)3 Journal of Clinical Investigation、Vol.87、1668-1673,1991),與屏障功能有密切關(guān)系的TEWL上升(非專利文獻(xiàn)4:J.Lipid.Res.、Vol.26,418-427,1985,Vol.30,323-333,1989)等。但是，有關(guān)這些現(xiàn)象的關(guān)聯(lián)性的報(bào)道很少，其詳細(xì)機(jī)理也不明了。因此，粗糙肌膚的指標(biāo)至今為止還依賴于本人的申報(bào)、肉眼直觀的判斷，還不存在明確的指標(biāo)。
[0006]此外還存在潛在的粗糙肌膚狀態(tài)的人，但難于檢測(cè)此種表面未顯現(xiàn)的潛在的粗糙肌膚。該潛在的粗糙肌膚狀態(tài)的膚質(zhì)之一也可稱為是所謂的敏感肌膚。
[0007]配合在化妝品及醫(yī)藥部外品(quasi drug)等的皮膚外用劑中的有效成分的有用性評(píng)價(jià)按照通過(guò)體外(in vitro)試驗(yàn)的I次篩選、通過(guò)使用動(dòng)物的試驗(yàn)的2次篩選、使用人體的使用試驗(yàn)的順序進(jìn)行。但是，在如粗糙肌膚那樣機(jī)理復(fù)雜且無(wú)法特定其主要原因的情況下，實(shí)施著眼于參與各機(jī)理的步驟的生物體外試驗(yàn)非常困難，最終的評(píng)價(jià)只能是在將粗糙肌膚的程度作為指標(biāo)的人體上進(jìn)行試驗(yàn)，此時(shí)的指標(biāo)無(wú)論如何也不過(guò)是以感官評(píng)價(jià)和肉眼、顯微觀察(顯微鏡觀察)等非定量的方法為主流。
[0008]近年來(lái)，為解決上述課題提出了一些方案。專利文獻(xiàn)I (日本特開(kāi)平11-76168號(hào)公報(bào))中提出了使皮膚與二苯基苦基苯肼(DPPH)的醇溶液接觸，測(cè)量著色的程度的方法。專利文獻(xiàn)2 (國(guó)際公開(kāi)第2006 / 098523號(hào))中公開(kāi)了以皮膚角質(zhì)層的鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)抗原為指標(biāo)的方法。此外，專利文獻(xiàn)3 (國(guó)際公開(kāi)第98 / 40045號(hào))中公開(kāi)了以真皮膠原纖維束的有序度的變化量為指標(biāo)的方法。進(jìn)而還在專利文獻(xiàn)4 (日本特開(kāi)2010-71917號(hào)公報(bào))中提出了用水從皮膚中提取吡咯烷酮羧酸，用其提取量來(lái)評(píng)價(jià)的方法。
[0009]本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了以往完全未注意到的半乳糖凝集素_7的新功能，并且是首次利用該功能的提案。半乳糖凝集素是指識(shí)別結(jié)合半乳糖(β -半乳糖苷結(jié)構(gòu))或交聯(lián)糖鏈之間的蛋白質(zhì)的總稱。闡明了其參與發(fā)生、分化、形態(tài)形成、腫瘤轉(zhuǎn)移、細(xì)胞凋亡(細(xì)胞死亡)等的生命現(xiàn)象?，F(xiàn)在，已知作為哺乳類的半乳糖凝集素有半乳糖凝集素-1~-15的15種。為人體的情況下，不存在相當(dāng)于_5，-6，-14，-15的半乳糖凝集素，目前有10種，今后有進(jìn)一步增加的可能性。半乳糖凝集素從其形態(tài)上大致分為3個(gè)亞型。第I亞型具有I個(gè)與糖鏈結(jié)合的部分(糖鏈結(jié)合結(jié)構(gòu)域2:糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域(carbohydrate recognition domain, CRD)的雛型(proto-type),第2亞型是在I個(gè)糖鏈結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有不與糖鏈結(jié)合而與其他結(jié)構(gòu)域鏈接的結(jié)構(gòu)的嵌合型(chimera-type),第3類型為由2個(gè)糖鏈結(jié)合結(jié)構(gòu)域形成的銜接型(tandem-repeat-type)? 雛型(proto-type)和嵌合型(chimera-type)只具有 I 個(gè)糖鏈結(jié)合結(jié)構(gòu)域，但通過(guò)2個(gè)分子結(jié)合(形成二聚體)，而實(shí)質(zhì)上與銜接型(tandem-repeat-type)相同為與2個(gè)糖鏈結(jié)合。
[0010]從哺乳動(dòng)物復(fù)層上皮中檢測(cè)出半乳糖凝集素-7，在角質(zhì)形成細(xì)胞中從基底層到角質(zhì)層均檢測(cè)出半乳糖凝集素_7。復(fù)層上皮分布于表皮、食道上皮、鱗狀化的氣管上皮、外宮頸上皮、下咽部~喉頭上皮、肛門(mén)上皮等。由于角質(zhì)形成細(xì)胞中的半乳糖凝集素-7的表達(dá)不受Ca2+濃度的影響，因而可知其也不受角質(zhì)化程度的控制(非專利文獻(xiàn)5:Differetiation、1998、63、159-168)。另一方面，未確認(rèn)出在成纖維細(xì)胞中的表達(dá)。此外，還可知半乳糖凝集素-7通過(guò)維甲酸微弱減少(非專利文獻(xiàn)6 developmental Biologyl68、259-271(1995))ο
[0011]有報(bào)道指出半乳糖凝集素-7被p53 (癌抑制基因)誘導(dǎo)，被指定為PIGl(P53-誘導(dǎo)基因(induced genel)) ，參與細(xì)胞凋亡。引起半乳糖凝集素_7的表達(dá)被強(qiáng)化的胱天蛋白酶-3的活化和多聚(ADP-核糖)聚合酶的裂解(非專利文獻(xiàn)7 J BiolChem.2002Febl;277(5): 3487-97.Epub2001Nov8.)。已知用 UVB 照射角質(zhì)形成細(xì)胞時(shí)，半乳糖凝集素_7的表達(dá)劇增，經(jīng)過(guò)JNK-BaX途徑，而引起角質(zhì)形成細(xì)胞的細(xì)胞凋亡(非專利文獻(xiàn)8:Proc Natl Acad Sci USA.1999S印28;96(20):11329-34)。
[0012]此外，在專利文獻(xiàn)5 (日本特開(kāi)2006-182744號(hào)公報(bào))中，公開(kāi)了半乳糖凝集素_7表達(dá)促進(jìn)物質(zhì)的篩選方法及通過(guò)涂抹配合半乳糖凝集素_7成分的組合物的保濕作用和皮膚癥狀改善作用。而且，在專利文獻(xiàn)6 (日本特開(kāi)平9-216833號(hào)公報(bào))中公開(kāi)了含有I種或2種以上半乳糖凝集素的外用劑具有預(yù)防、改善皮膚的皺紋、彈性降低等的老化癥狀及創(chuàng)傷治愈效果。
[0013]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0014]專利文獻(xiàn)
[0015]專利文獻(xiàn)I日本特開(kāi)平11-76168號(hào)公報(bào)
[0016]專利文獻(xiàn)2國(guó)際公開(kāi)第2006 / 098523號(hào)公報(bào)
[0017]專利文獻(xiàn)3國(guó)際公開(kāi)第98 / 40045號(hào)公報(bào)
[0018]專利文獻(xiàn)4日本特開(kāi)2010-71917號(hào)公報(bào)
[0019]專利文獻(xiàn)5日本特開(kāi)2006-182744號(hào)公報(bào)[0020]專利文獻(xiàn)6日本特開(kāi)平9-216833號(hào)公報(bào)
[0021]非專利文獻(xiàn)
[0022]非專利文獻(xiàn)I日皮會(huì)志、第92卷、第1001頁(yè)-1003頁(yè)、1982年
[0023]非專利文獻(xiàn)2J.1nvest.Dermatol、Vol.81、519_523、1983
[0024]非專利文獻(xiàn)3Journal of Clinical Investigation、Vol.87、1668-1673、1991
[0025]非專利文獻(xiàn)4J.Lipid.Res.,Vol.26、418_427、1985、Vol.30,323-333,1989
[0026]非專利文獻(xiàn)OTifferetiation、1998,63,159-168
[0027]非專利文獻(xiàn)6Developmental Biologyl68、259_271 (1995)
[0028]非專利文獻(xiàn)7J Biol Chem.2002Febl; 277 (5): 3487-97.Epub2001Nov8.[0029]非專利文獻(xiàn)8Proc Natl Acad Sci U S A.1999S印28; 96 (20): 11329-34

【發(fā)明內(nèi)容】

[0030]如上所述，期待有評(píng)價(jià)粗糙肌膚程度的客觀評(píng)價(jià)方法。本發(fā)明為非外科式地摘取皮膚，不給皮膚施加刺激的方法，本發(fā)明的課題在于提供使用可簡(jiǎn)便且確實(shí)地評(píng)價(jià)是否為粗糙肌膚的生物化學(xué)指標(biāo)的新型評(píng)價(jià)方法。
[0031]本發(fā)明如下構(gòu)成。
[0032](1) 一種粗糙肌膚的程度的評(píng)價(jià)方法，其特征在于，測(cè)定皮膚角質(zhì)層的半乳糖凝集素-7的表達(dá)量。
[0033](2)—種粗糙肌膚的程度的評(píng)價(jià)方法，其特征在于，將皮膚角質(zhì)層的半乳糖凝集素_7的表達(dá)量與預(yù)先或同時(shí)測(cè)定的正常部位的皮膚的半乳糖凝集素_7的表達(dá)量進(jìn)行對(duì)比。
[0034](3) 一種敏感肌膚的評(píng)價(jià)方法，其特征在于，將皮膚角質(zhì)層的半乳糖凝集素_7的表達(dá)量與預(yù)先或同時(shí)測(cè)定的正常部位的皮膚的半乳糖凝集素_7的表達(dá)量進(jìn)行對(duì)比。
[0035](4)根據(jù)(I)或(2)所述的評(píng)價(jià)方法，其特征在于，具備采集皮膚角質(zhì)層的采集工序、測(cè)定所述采集工序中所采集的角質(zhì)層細(xì)胞中的半乳糖凝集素_7的表達(dá)量的測(cè)定工序、將所述測(cè)定工序中所測(cè)定的半乳糖凝集素_7的表達(dá)量與健康正常肌膚的皮膚角質(zhì)層中的半乳糖凝集素_7的表達(dá)量進(jìn)行比較的比較工序。
[0036](5)根據(jù)(4)所述的評(píng)價(jià)方法，其特征在于，采集皮膚的角質(zhì)層的工序通過(guò)膠帶剝離法進(jìn)行。
[0037]根據(jù)本發(fā)明的評(píng)價(jià)方法，可通過(guò)測(cè)定角質(zhì)層中的半乳糖凝集素_7的表達(dá)量來(lái)評(píng)價(jià)粗糙肌膚的程度。此外，以該半乳糖凝集素_7表達(dá)量為指標(biāo)，可簡(jiǎn)便地檢測(cè)出潛在的粗糙肌膚。進(jìn)而，因本發(fā)明的評(píng)價(jià)方法用膠帶剝離法等簡(jiǎn)便的操作方法采集評(píng)價(jià)試樣，所以，受試者的負(fù)擔(dān)少，任何人均可簡(jiǎn)單地進(jìn)行評(píng)價(jià)。且因其為生物化學(xué)的試驗(yàn)方法，無(wú)論誰(shuí)測(cè)定均可得到相同的結(jié)果，所以，不需進(jìn)行如以往那樣通過(guò)與專家面談的方式的咨詢。
[0038]此外，還可通過(guò)本發(fā)明的方法客觀評(píng)價(jià)化妝品等的效果。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0039]圖1為測(cè)定人體各部位的半乳糖凝集素_7的表達(dá)量的圖。
[0040]圖2為測(cè)定通過(guò)SDS制作的強(qiáng)制粗糙肌膚模型的半乳糖凝集素_7的表達(dá)量的圖。[0041]圖3為測(cè)定通過(guò)丙酮制作的強(qiáng)制粗糙肌膚模型的半乳糖凝集素_7的表達(dá)量的圖。
[0042]圖4為健康正常肌膚的608名的半乳糖凝集素_7表達(dá)量和表達(dá)頻率的圖表。
[0043]圖5為確認(rèn)半乳糖凝集素_7和TEWL的相關(guān)性的圖。
[0044]圖6為表示保濕性高的乳霜連用14天前后的半乳糖凝集素_7的表達(dá)量的變化圖。
[0045]圖7為表示保濕性高的乳霜連用14天前后的TEWL值、角質(zhì)層水分量值的變化圖。【具體實(shí)施方式】
[0046]以下，詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。
[0047]本發(fā)明的評(píng)價(jià)方法的特征在于，以皮膚角質(zhì)層中的半乳糖凝集素_7的存在量為指標(biāo)。
[0048]本發(fā)明中的粗糙肌膚是指在干燥、干巴巴的狀態(tài)下持續(xù)出現(xiàn)鱗屑的癥狀的膚質(zhì)。此外，敏感肌膚是指雖無(wú)明顯的皮膚病變，但易引起不利、有害的反應(yīng)的肌膚，稱為是潛在的粗糙肌膚的膚質(zhì)。且對(duì)外界刺激的抵抗力比健康正常肌膚低，也可以說(shuō)是容易產(chǎn)生皮膚問(wèn)題的肌膚。另一方面，健康正常肌膚是指不表現(xiàn)如上所述的粗糙肌膚、敏感肌膚的性質(zhì)的健康且正常的肌膚。已知敏感肌膚中TEWL增高，高頻傳導(dǎo)率(角質(zhì)層水分量)有降低等的趨勢(shì)。且被稱為敏感肌膚的膚質(zhì)有時(shí)會(huì)引起皮炎、肌膚粗糙。
[0049]角質(zhì)層為皮膚最外層的組織，具有保護(hù)皮膚不受來(lái)自體外的異物侵害、刺激的作用。
[0050]本發(fā)明中的評(píng)價(jià)對(duì)象部位只要是可得到角質(zhì)層的部位，也可包含任何部位，但作為主要的部位，可列舉面部、頸部、上臂部。根據(jù)以往的方法，可得到來(lái)自上述部位的皮膚的角質(zhì)層。但是，如前所述，因外科式摘取皮膚等的方法會(huì)給用戶造成負(fù)擔(dān)，所以，優(yōu)選膠帶剝離、刮擦等的可簡(jiǎn)便得到角質(zhì)層的方法。
[0051]如此準(zhǔn)備的各試樣中的半乳糖凝集素_7的表達(dá)量可用以往已知的方法測(cè)定。例如，可使用基于針對(duì)半乳糖凝集素_7的抗體的反應(yīng)的酶免疫測(cè)定法、放射免疫測(cè)定法、蛋白質(zhì)印跡法等的方法。此種測(cè)定方法已有市售，作為代表性的半乳糖凝集素_7的酶免疫檢驗(yàn)試劑盒，可例不Abcam公司制的Galectin7Human ELISA Kit、R&D systems公司制的ELISA Kit0
[0052]從各試樣中，將半乳糖凝集素_7經(jīng)由其自身已知的生物化學(xué)的方法、如凍融法、超聲波破碎法、勻漿法等來(lái)制備可溶性組分。且提取后迅速測(cè)定。
[0053]因粗糙肌膚與健康正常肌膚相比角質(zhì)層中的半乳糖凝集素_7的表達(dá)量顯著高，所以，以角質(zhì)層中的半乳糖凝集素_7的表達(dá)量的多少為指標(biāo)，可簡(jiǎn)便地評(píng)價(jià)應(yīng)激的蓄積度或肌膚是否是粗糙肌膚。本發(fā)明中使用的角質(zhì)層可用以下簡(jiǎn)單的方法采集，即如膠帶剝離法的僅將角質(zhì)層的表層部分用角質(zhì)膠帶采集。且本發(fā)明不需給皮膚以紫外線、化學(xué)物質(zhì)等的刺激即可測(cè)定半乳糖凝集素-7的表達(dá)量。因此，不會(huì)給用戶造成負(fù)擔(dān)即可評(píng)價(jià)用戶的肌膚是否為粗糙肌膚。特別是可簡(jiǎn)便地選擇更適合用戶的肌膚的化妝品、化學(xué)煥膚劑，由此可避免皮膚炎癥等的肌膚問(wèn)題、副作用，并進(jìn)一步發(fā)揮化妝品的護(hù)膚效果。
[0054]本發(fā)明的評(píng)價(jià)方法由采集角質(zhì)層的采集工序、測(cè)定所述采集工序中所采集的角質(zhì)層中的半乳糖凝集素_7的表達(dá)量的測(cè)定工序、將所述測(cè)定工序中所測(cè)定的半乳糖凝集素-7的表達(dá)量與健康正常肌膚的角質(zhì)層中的半乳糖凝集素-7的表達(dá)量進(jìn)行比較的比較工序構(gòu)成。以下就該評(píng)價(jià)方法進(jìn)行說(shuō)明。
[0055]首先，將如上所述測(cè)定的半乳糖凝集素_7的表達(dá)量與受試者自身的健康正常肌膚的角質(zhì)層中的半乳糖凝集素-7的表達(dá)量進(jìn)行比較。此外，測(cè)定受試者的某一評(píng)價(jià)對(duì)象部位的角質(zhì)層中的半乳糖凝集素_7的表達(dá)量，將所測(cè)定的半乳糖凝集素_7的表達(dá)量與具有健康正常肌膚的人的同一評(píng)價(jià)對(duì)象部位的角質(zhì)層中的半乳糖凝集素_7的表達(dá)量進(jìn)行比較。具有健康正常肌膚的人的角質(zhì)層的半乳糖凝集素_7的表達(dá)量可通過(guò)使用多個(gè)具有健康正常肌膚的人的數(shù)據(jù)的平均值，進(jìn)行更加客觀的評(píng)價(jià)。更加具體地說(shuō)，可由隨機(jī)提取的受試者的半乳糖凝集素_7的表達(dá)量分布設(shè)定健康正常肌膚的分布。
[0056]如此比較的結(jié)果，在所測(cè)定的半乳糖凝集素_7的表達(dá)量顯著大于健康正常肌膚的半乳糖凝集素_7的表達(dá)量的情況下，評(píng)價(jià)為應(yīng)激的蓄積大，即使未呈現(xiàn)出粗糙肌膚，也可判斷為作為敏感肌膚的可能性大。該健康正常肌膚的試樣可從測(cè)定半乳糖凝集素_7的人的皮膚上采集，也可從與測(cè)定半乳糖凝集素_7的人不同的人的皮膚上采集。
[0057]此外，受試者的某一評(píng)價(jià)對(duì)象部位的角質(zhì)層中的半乳糖凝集素-7的表達(dá)量顯著大于具有健康正常肌膚的人的同一評(píng)價(jià)對(duì)象部位的角質(zhì)層中的半乳糖凝集素_7的表達(dá)量的情況下，也評(píng)價(jià)為應(yīng)激的蓄積大。而且，即使表面上為未呈現(xiàn)出粗糙肌膚的情況，在該數(shù)值顯著高的情況下也評(píng)價(jià)為具有敏感肌膚。
[0058]即評(píng)價(jià)為應(yīng)激蓄積高的情況下，可根據(jù)所測(cè)定的半乳糖凝集素_7的表達(dá)量的程度評(píng)價(jià)應(yīng)激蓄積的程度。所測(cè)定的半乳糖凝集素_7的表達(dá)量與健康正常肌膚的半乳糖凝集素-7的表達(dá)量相比顯著多的情況下，該肌膚評(píng)價(jià)為強(qiáng)烈顯示粗糙肌膚的性質(zhì)。且與健康正常肌膚相比，對(duì)外界刺激的抵抗力顯著低，判斷為極容易產(chǎn)生皮膚問(wèn)題的可能性大。此夕卜，所測(cè)定的半乳糖凝集素_7的表達(dá)量與健康正常肌膚的半乳糖凝集素_7的表達(dá)量相比僅少量增加的情況下，其肌膚比健康正常肌膚更具有應(yīng)激的蓄積，對(duì)外界刺激的抵抗力低，雖產(chǎn)生皮膚問(wèn)題的可能性低，但可評(píng)價(jià)為具有是輕度敏感肌膚的可能性。
[0059]以下就具體的實(shí)施例進(jìn)行說(shuō)明，但本發(fā)明不限于以下的實(shí)施例。
[0060]實(shí)施例
[0061]1.人體各部位的半乳糖凝集素_7表達(dá)量的測(cè)定
[0062]<受試者>
[0063]從35名健康正常肌膚的男性女性(包括以往有特應(yīng)性皮炎(AD)的人)的臉頰、前臂內(nèi)側(cè)部、臀部采集樣品。
[0064]<角質(zhì)層樣品提取方法、蛋白定量>
[0065]在受試者的臉頰、臂、臀部粘貼角質(zhì)層測(cè)試片(ASAHIB10MED公司)，采集角質(zhì)層。從角質(zhì)層測(cè)試片上用玻璃珠法(在容器內(nèi)放入分析物、直徑約2mm的玻璃珠和提取液進(jìn)行振蕩提取的方法)使用500μ1 T-PER提取緩沖液(組織蛋白提取試劑(TissueProtein Extraction Reagent)賽默飛世爾科技有限公司(Thermo Scientific)制(product#78510))進(jìn)行角質(zhì)層蛋白質(zhì)的提取。各樣品的蛋白質(zhì)的量用Pierce BCA proteinAssay Kit (Thermo Scientific#23225)測(cè)定。測(cè)定時(shí),在10 μ I所述角質(zhì)層蛋白質(zhì)提取液中加入200μ I Pierce BCA protein Assay Kit的反應(yīng)試劑液，在60°C下孵育30分鐘后，測(cè)定562nm處的吸光度。同時(shí)用BSA繪出校正曲線，由吸光度的值算出蛋白質(zhì)的量。[0066]<角質(zhì)層中的半乳糖凝集素-7的測(cè)定>
[0067]同樣,將從膠帶上提取的角質(zhì)層蛋白質(zhì)提取液使用R&D systems公司制的ELISA試劑盒(galectin-7:DY1339E)測(cè)定半乳糖凝集素-7的表達(dá)量。首先,在costar公司制的96孔酶標(biāo)板(#3590)中，將成為I次抗體的固相化抗體用試劑盒指定的濃度在20°C下過(guò)夜使之固相化。其次，用1%BSA、37°C下I小時(shí)封閉酶標(biāo)板，用0.01%Tween-PBS將酶標(biāo)板洗滌后，各使用100 μ I成為校正曲線的標(biāo)樣及樣品，在25 °C下孵育2小時(shí)。用0.01%Tween-PBS將酶標(biāo)板洗滌后，將2次抗體用試劑盒指定濃度在25°C下孵育2小時(shí)。進(jìn)而用0.01%Tween-PBS將酶標(biāo)板洗漆后，將Streptavidin-HRP用試劑盒指定濃度，在25°C下孵育30分鐘。最后，用0.01%Tween-PBS將酶標(biāo)板洗滌后，將顯色底物TMB溶液(Promega, G7431)按100 μ I/孔加入，在試劑盒指定時(shí)間后，加入100 μ I終止溶液(0.5Μ硫酸)，測(cè)定450nm處的吸光度以算出表達(dá)量。
[0068]< 結(jié)果 >
[0069]測(cè)定結(jié)果如圖1所示。
[0070]如圖1可表明，可確認(rèn)出日常暴露在外界刺激下的臉頰與所謂的粗糙肌膚通常不出現(xiàn)的臂、臀部(屁股)相比，半乳糖凝集素_7的表達(dá)量顯著高。由該試驗(yàn)結(jié)果表明，作為粗糙肌膚、敏感肌膚的指標(biāo)，半乳糖凝集素_7非常有用。
[0071]2.人工粗糙肌膚模型中的半乳糖凝集素_7表達(dá)量的變化
[0072]<通過(guò)SDS的粗糙肌膚模型制作>
[0073]<受試者>
[0074]將14名健康正常肌膚的女性作為受試者實(shí)施了試驗(yàn)。
[0075]在左前臂內(nèi)側(cè)部用2push表面活性劑(十二烷基硫酸鈉，以下為SDS) 10%溶液，重復(fù)涂抹100次。用熱水(35°C、1L)沖洗，洗去表面活性劑。且作為對(duì)照，對(duì)右前臂內(nèi)側(cè)部也用熱水(35°C、1L)沖洗。在I天4次，每次操作在隔開(kāi)I小時(shí)以上的狀態(tài)下重復(fù)該操作。持續(xù)進(jìn)行2天此過(guò)程，人工制作粗糙肌膚模型。
[0076]〈角質(zhì)采集〉
[0077]在深度方向上各采集4片不進(jìn)行SDS洗滌、進(jìn)行SDS洗滌的各個(gè)部分的角質(zhì)層。采集角質(zhì)層的日期為在洗滌前和洗滌后第4、8、12天進(jìn)行采集。
[0078]<角質(zhì)層樣品提取方法、蛋白定量、半乳糖凝集素-7的測(cè)定>
[0079]與上述1.的方法同樣進(jìn)行測(cè)定。
[0080]< 結(jié)果 >
[0081]受試者的單獨(dú)測(cè)定結(jié)果如圖2所示?？纱_認(rèn)出粗糙肌膚制作處理后第8?12天半乳糖凝集素_7的測(cè)定結(jié)果顯著上升。
[0082]<通過(guò)丙酮的粗糙肌膚模型制作>
[0083]<受試者>
[0084]將3名健康正常肌膚的女性作為受試者實(shí)施試驗(yàn)。
[0085]將上下開(kāi)口的玻璃制漏斗(直徑3cm)用橡皮筋固定，將2ml丙酮(WAK0特級(jí))/二乙醚(WAK0特級(jí))等量混合液用移液管注入漏斗內(nèi)，在振蕩器上放置兩臂處理20分鐘。
[0086]而后，將漏斗內(nèi)的丙酮/ 二乙醚混合液用滴液吸移管除去后，注入自來(lái)水，在振蕩器上放置兩臂處理(脫脂處理)5分鐘。第二天，在同一部分進(jìn)行同樣的操作以再次進(jìn)行脫脂處理，制作干燥皮膚。且將僅用自來(lái)水處理的部位作為對(duì)照。
[0087]〈角質(zhì)采集〉
[0088]在深度方向上分別采集4片丙酮無(wú)處理、丙酮處理部位的角質(zhì)層。采集的日期為丙酮處理前一天、丙酮處理后第1、5、8、12、16、20天采集。
[0089]<角質(zhì)層樣品提取方法、蛋白定量、半乳糖凝集素_7的測(cè)定>
[0090]與上述1.的試驗(yàn)方法同樣進(jìn)行操作。
[0091]< 結(jié)果 >
[0092]受試者的單獨(dú)測(cè)定結(jié)果如圖3所示?？纱_認(rèn)出粗糙肌膚制作處理后第8~12天半乳糖凝集素_7的測(cè)定結(jié)果顯著上升。
[0093]從以上的粗糙肌膚模型制作試驗(yàn)的結(jié)果可確認(rèn)出，隨著粗糙肌膚的產(chǎn)生，半乳糖凝集素_7上升。
[0094]3.健康正常肌膚的半乳糖凝集素_7的測(cè)定
[0095]<受試者>
[0096]采集608名健康正常肌膚的男性女性(包括以往有特應(yīng)性皮炎的人)的臉頰樣品，確認(rèn)半乳糖凝集素_7的分布。此外，對(duì)于其中35名受試者，測(cè)定作為以往的粗糙肌膚的評(píng)價(jià)指標(biāo)的TEWL，確認(rèn)與半乳糖凝集素-7的測(cè)定結(jié)果有無(wú)相關(guān)性。
[0097]<角質(zhì)層樣品提取方法、蛋白定量>
[0098]與上述1.同樣，在受試者的臉頰上粘貼角質(zhì)層測(cè)試片(ASAHIB10MED公司制)，采
集角質(zhì)層。
[0099]<角質(zhì)層中的半乳糖凝集素_7的測(cè)定>
[0100]與上述1.同樣，將從膠帶上提取的角質(zhì)層蛋白質(zhì)提取液使用R&Dsystems公司制的ELISA試劑盒(galectin-7:DY1339E,)測(cè)定半乳糖凝集素_7的表達(dá)量。
[0101]<TEWI^>
[0102]TEffL使用keystone公司制的Delfin,將2次分別測(cè)定的平均值用于分析。
[0103]< 結(jié)果 > [0104]608名的半乳糖凝集素-7測(cè)定結(jié)果如表1及圖4所示。
[0105]表1
【權(quán)利要求】
1.一種粗糙肌膚的程度的評(píng)價(jià)方法，其特征在于，測(cè)定皮膚角質(zhì)層的半乳糖凝集素-7的表達(dá)量。
2.一種粗糙肌膚的程度的評(píng)價(jià)方法，其特征在于，將皮膚角質(zhì)層的半乳糖凝集素_7的表達(dá)量與預(yù)先或同時(shí)測(cè)定的正常部位的皮膚的半乳糖凝集素_7的表達(dá)量進(jìn)行對(duì)比。
3.一種敏感肌膚的評(píng)價(jià)方法，其特征在于，將皮膚角質(zhì)層的半乳糖凝集素_7的表達(dá)量與預(yù)先或同時(shí)測(cè)定的正常部位的皮膚的半乳糖凝集素_7的表達(dá)量進(jìn)行對(duì)比。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或根據(jù)權(quán)利要求2所述的評(píng)價(jià)方法，其特征在于，具備采集皮膚角質(zhì)層的采集工序、測(cè)定所述采集工序中所采集的角質(zhì)層細(xì)胞中的半乳糖凝集素_7的表達(dá)量的測(cè)定工序、將所述測(cè)定工序中所測(cè)定的半乳糖凝集素_7的表達(dá)量與健康正常肌膚的皮膚角質(zhì)層中的半乳糖凝集素_7的表達(dá)量進(jìn)行比較的比較工序。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的評(píng)價(jià)方法，其特征在于，采集皮膚的角質(zhì)層的工序通過(guò)膠帶剝離法進(jìn)行。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK103808940SQ201310534745
【公開(kāi)日】2014年5月21日 申請(qǐng)日期:2013年11月1日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月2日
【發(fā)明者】安田知永, 禹幸玉 申請(qǐng)人:株式會(huì)社芳珂