一種肝型脂肪酸結合蛋白含量檢測試劑盒及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種肝型脂肪酸結合蛋白含量檢測試劑盒及其制備方法，屬于肝型脂肪酸結合蛋白含量的檢測【技術領域】。試劑盒由彼此獨立的試劑Ⅰ和試劑Ⅱ組成；其中，試劑Ⅰ的組分包括：緩沖液、防腐劑、表面活性劑和水；所述的試劑Ⅱ的組分包括：包被肝型脂肪酸結合蛋白抗體的膠乳顆粒、緩沖液、助懸劑、防腐劑、表面活性劑和水。采用本發(fā)明的技術制備的肝型脂肪酸結合蛋白含量檢測試劑盒具有操作簡單、定量準確、靈敏度高、特異性好、檢測范圍廣等諸多優(yōu)良的特性，適合于肝型脂肪酸結合蛋白臨床檢測的推廣和應用。
【專利說明】一種肝型脂肪酸結合蛋白含量檢測試劑盒及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于肝型脂肪酸結合蛋白含量的檢測【技術領域】，特別涉及一種肝型脂肪酸結合蛋白含量檢測試劑盒及其制備方法。
【背景技術】
[0002]肝型脂肪酸結合蛋白(liverfatty acid binding protein,L-FABP)是脂肪酸結合蛋白家族的成員，它是在肝臟中表達的脂肪酸結合蛋白，主要介導脂質的吸收和轉運，并在調節(jié)脂肪酸氧化、減少細胞氧化應激和影響細胞生長等方面發(fā)揮重要作用。近年來發(fā)現(xiàn)L-FABP是有肝、腎損傷的標志分子，并與脂肪肝、肥胖的發(fā)生發(fā)展關系密切。隨著研究的深入，對L-FABP的生理功能、基因調控以及與疾病的關系有了更清楚的認識，對有關疾病的診治有了更大的幫助。
[0003]肝型脂肪酸結合蛋白與多種疾病的發(fā)生發(fā)展有著一定的聯(lián)系。它可以作為腎病和肝損傷的標志分子，分子量僅為14.4KD的肝型脂肪酸結合蛋白在人腎臟近端小管也有表達，多種病理生理應激作用于近端小管都能誘導L-FABP的表達，導致尿液中L-FABP含量增多，因此成為慢性腎病標志分子。由于L-FABP在肝細胞高表達，可能成為肝損傷的標志分子，肝移植患者發(fā)生排斥反應的當天，血清L-FABP水平明顯升高，并且早于急性排斥反應。后來進一步研究，L-FABP對評估肝缺血損傷程度以及評估肝切除術中導致肝損害的關鍵因素等，都具有較高的敏感性和特異性。
[0004]有文獻報道:尿L-FABP水平診斷急性腎損傷敏感度為74.5%，特異性為77.6% ;預測需要透析，敏感度69.1%，特異性42.7% ;預測死亡率，敏感度93.2%，特異性78.8%。
[0005]鑒于L-FABP的檢測可以作為腎損傷的診斷標志物，開發(fā)該指標的檢測試劑盒有利于該指標檢測的臨床應用。目前，關于L-FABP的專利技術多集中于該物質作為疾病診斷標志物的應用及研究方面。在檢測產品方面，現(xiàn)有的L-FABP診斷試劑產品多采用的是酶聯(lián)免疫分析技術。酶聯(lián)免疫分析技術具有檢測精確度高、靈敏度好等諸多優(yōu)良的特性，但該檢測方法操作繁瑣、檢測耗時長，不利于樣本的及時檢測，同時該檢測方法只能批量檢測樣本，不能實現(xiàn)樣本的隨到隨測，此外，酶聯(lián)免疫檢測方法具有自動化程度低，受人工操作影響較大等方面的不利因素，使得其在未來的檢測技術中必然處于被替代的技術。由于L-FABP有著良好的診斷意義，開發(fā)一種新型、高效便捷的檢測方法及檢測產品將為該指標的臨床應用提供良好的前提條件。
【發(fā)明內容】
[0006]本發(fā)明的目的是為解決上述問題而提供了一種穩(wěn)定性好、靈敏度高、特異性強、操作簡單和線性范圍寬的肝型脂肪酸結合蛋白含量檢測試劑盒及其制備方法。
[0007]本發(fā)明所采用的技術方案是:
[0008]一種肝型脂肪酸結合蛋白含量檢測試劑盒，所述試劑盒由試劑I和試劑II組成，所述試劑I的組分包括:緩沖液、防腐劑、表面活性劑和水；所述的試劑II的組分包括:包被肝型脂肪酸結合蛋白抗體的膠乳顆粒、緩沖液、助懸劑、防腐劑、表面活性劑和水。
[0009]優(yōu)選地，所述包被肝型脂肪酸結合蛋白抗體的膠乳顆粒的粒徑為180?220nm，所述肝型脂肪酸結合蛋白抗體為單克隆抗體或多克隆抗體。
[0010]試劑II中膠乳微球顆粒的粒徑的選擇對試劑盒的穩(wěn)定性、靈敏度以及檢測結果的準確性等有著非常顯著的影響，當本發(fā)明選用的膠乳顆粒的粒徑為180?220nm時，制備出的檢測試劑盒的穩(wěn)定性、靈敏度以及檢測線性范圍等特性要明顯優(yōu)于其它粒徑的膠乳顆粒，尤其是當膠乳顆粒的粒徑為200nm時，制備的檢測試劑盒其各項性能最好。
[0011]包被肝型脂肪酸結合蛋白抗體的膠乳微球顆粒，其肝型脂肪酸結合蛋白抗體包被膠乳顆?？梢圆捎梦锢砦椒ê突瘜W交聯(lián)法制備，物理吸附法是利用分子之間的作用力將抗體吸附到膠乳顆粒的表面，化學交聯(lián)法是通過化學鍵將抗體與膠乳微球顆粒表面的基團相結合。本發(fā)明采用化學交聯(lián)法制備的膠乳顆粒，其配制的試劑盒性能更穩(wěn)定，產品的貨架期、開瓶穩(wěn)定性以及熱穩(wěn)定性明顯優(yōu)于物理法制備的檢測試劑盒。本發(fā)明中肝型脂肪酸結合蛋白單克隆抗體或多克隆抗體采用化學交聯(lián)法包被膠乳顆粒，其中肝型脂肪酸結合蛋白單克隆抗體或多克隆抗體能很好的識別樣品中的肝型脂肪酸結合蛋白抗原，從而能很好的提高檢測試劑盒的特異性。
[0012]進一步地，所述化學交聯(lián)法制備包被肝型脂肪酸結合蛋白抗體的膠乳顆粒包括以下步驟:
[0013](I)取0.2?1.0mL膠乳微球顆粒于離心管中，加入4.0?4.8mL磷酸緩沖液，混勻后離心得膠乳微球顆粒，后用3?IOmL磷酸鹽緩沖液重懸膠乳微球顆粒，向重懸的膠乳微球顆粒溶液中加入濃度為0.02mol/L的6-氨基己酸溶液0.5?2mL，再加入I?3mgEDC粉末，攪拌反應20?60min，離心去上清，并用3?IOmL磷酸鹽緩沖液重懸膠乳顆粒，既得羧化改性的聚苯乙烯膠乳微球顆粒。聚苯乙烯膠乳微球顆粒的羧化改性是將氨基己酸基團連接到膠乳微球顆粒表面。
[0014](2)取50?200ug肝型脂肪酸結合蛋白單克隆抗體和多克隆抗體凍干品，用0.05?0.5mL去離子水溶解，后取50?300uL抗體溶液用5mL磷酸鹽緩沖液稀釋，并將稀釋后的溶液加入羧化改性的聚苯乙烯膠乳微球顆粒溶液中，再加入I?5mg的EDC，在4°C攪拌反應6?10小時，加入0.2mL甘氨酸溶液終止反應，離心去上清，并用ImL pH7.0的2- (N-嗎啡啉)乙磺酸緩沖液中分散，既得包被抗體的膠乳微球顆粒溶液。肝型脂肪酸結合蛋白抗體與膠乳微球顆粒的結合，是肝型脂肪酸結合蛋白抗體通過氨基己酸鍵與膠乳微球顆粒連接。
[0015]優(yōu)選地，所述的緩沖液為三羥甲基氨基甲烷-HCl緩沖液、磷酸鹽緩沖液、咪唑緩沖液、甘氨酸緩沖液、巴比妥緩沖液以及2- (N-嗎啡啉)乙磺酸緩沖液中的一種或任意兩種的混合；所述防腐劑為疊氮化鈉、Proclin300、硫柳汞、苯酚以及乙基汞硫代硫酸鈉中的一種或任意幾種的混合；所述表面活性劑為吐溫20、吐溫40、司盤40以及司盤60中的一種或任意幾種的混合；所述助懸劑為乙二醇、丙三醇、海藻酸鈉、乳糖以及麥芽糖中的一種或任意幾種的混合。
[0016]本發(fā)明所述的緩沖劑能夠使反應體系維持一定的pH值，各種能使反應體系維持一定PH值的物質均能作為本發(fā)明的緩沖劑，可選自三羥甲基氨基甲烷-HCl緩沖液、磷酸鹽緩沖液、咪唑緩沖液、甘氨酸緩沖液、巴比妥緩沖液和2- (N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)緩沖液中的一種或任意兩種混合。
[0017]本發(fā)明所述的防腐劑是為了防止細菌滋生，避免細菌滋生導致的產品變質從而對檢測結果造成的不良影響。各種能阻止細菌繁殖的物質均能用作本發(fā)明檢測試劑盒的防腐劑組分，本發(fā)明檢測試劑盒中所用的防腐劑選自疊氮化鈉、Proclin300、硫柳汞、苯酚和乙基汞硫代硫酸鈉中的一種或任意幾種混合。
[0018]本發(fā)明試劑盒中的表面活性劑有利于反應試劑盒的各種組分均勻分散，有利于維持試劑盒各組分儲存過程中的穩(wěn)定性，同時表面活性劑有利于檢測樣本均勻分散于反應體系中，使反應體系處于均一狀態(tài)，可減少樣本濁度對測定結果的不良影響。凡是具有增溶性及表面活性的物質均可作為本發(fā)明檢測試劑盒中的表面活性劑組分，本發(fā)明檢測試劑盒中的表面活性劑選自吐溫20、吐溫40、司盤40或司盤60中的一種或任意幾種的混合。
[0019]本發(fā)明試劑盒試劑II中的助懸劑可以幫助膠乳顆粒維持良好的分散狀態(tài)，防止膠乳顆粒下沉對檢測試劑盒的穩(wěn)定性及檢測結果的可靠性帶來不良影響，各種能增加反應體系黏度的物質均能作為本發(fā)明的助懸劑，本發(fā)明中所述的助懸劑選自乙二醇、丙三醇、海藻酸鈉、乳糖和麥芽糖中的一種或任意兩種的混合。
[0020]優(yōu)選地，每I升試劑I中各組分的用量為:緩沖劑5?80g，防腐劑0.1?10g，表面活性劑0.1?5mL，余量為水。
[0021]更優(yōu)選地，每I升試劑I中各組分的用量為:緩沖劑15?30g，防腐劑I?5g，表面活性劑I?3mL，余量為水。
[0022]優(yōu)選地，每I升試劑II中各組分的用量為:包被肝型脂肪酸結合蛋白抗體的膠乳微球顆粒0.5?3.5g，緩沖劑5?80g，助懸劑5?50g,防腐劑0.1?IOg,表面活性劑0.1?5mL,余量為水。
[0023]更優(yōu)選地，每I升試劑II中各組分的用量為:包被肝型脂肪酸結合蛋白抗體的膠乳微球顆粒0.8?3g，緩沖劑10?30g,助懸劑10?30g,防腐劑I?5g，表面活性劑I?3mL,余量為水。
[0024]優(yōu)選地，所述試劑I和試劑II的的pH值范圍為6.0?9.0。
[0025]一種肝型脂肪酸結合蛋白含量檢測試劑盒的制備方法，包括以下步驟:
[0026](I)制備試劑1:將各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中，混合均勻，調整pH值，定容得到試劑I;
[0027](2)制備試劑I1:通過化學交聯(lián)法制備包被肝型脂肪酸結合蛋白抗體包被的膠乳微球顆粒，將其余各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中得到混合溶液，將混合溶液于膠乳顆?；靹颍{整pH值，定容得到試劑II。
[0028]本發(fā)明具有以下優(yōu)點:
[0029]本發(fā)明檢測試劑盒采用粒徑為180?220nm的膠乳微球顆粒制備檢測試劑盒，能有效保證試劑盒的穩(wěn)定性、靈敏度以及良好的檢測線性范圍；肝型脂肪酸結合蛋白抗體包被膠乳微球顆粒采用特定的化學交聯(lián)法能保證檢測試劑盒中包被抗體的膠乳微球顆粒的穩(wěn)定性，既而保證了檢測試劑盒品質的穩(wěn)定性；本發(fā)明檢測試劑盒中采用的肝型脂肪酸結合蛋白單克隆抗體和多克隆抗體能特異性識別樣本中的肝型脂肪酸結合蛋白，保證了檢測試劑盒的特異性，從而保證了檢測結果的準確性；另外，本發(fā)明通過優(yōu)選組分和優(yōu)化各種組分的含量，使采用本專利技術制備出來的檢測試劑盒在各方面的性能均處于最佳狀態(tài)，使其能更好的滿足檢測的需要，本發(fā)明試劑盒具有穩(wěn)定性好、靈敏度高、特異性強、操作簡便等優(yōu)點，適合于推廣和應用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0030]圖1為實施例1-5制備的肝型脂肪酸結合蛋白含量檢測試劑盒標準工作曲線圖；
[0031]圖2為本發(fā)明實施例1與對比實施例1-5制備的肝型脂肪酸結合蛋白含量檢測試劑盒標準工作曲線的比對圖；
[0032]圖3為實施例1制備出的肝型脂肪酸結合蛋白含量檢測試劑盒與R&D公司的酶聯(lián)免疫試劑盒測定尿液樣本中肝型脂肪酸結合蛋白的含量的結果比較圖。
【具體實施方式】
[0033]下面結合附圖和實施方式對本發(fā)明做進一步詳細的說明。
[0034]實施例1
[0035]包被肝型脂肪酸結合蛋白抗體的膠乳顆粒溶液的制備:
[0036]( I)羧化改性聚苯乙烯膠乳溶液的制備
[0037]取0.5mL粒徑為200nm的10%濃度的聚苯乙烯膠乳顆粒(購自PolyMicrospheres公司)于50mL離心管中，向離心管中加入4.5mL0.12mol/L ρΗ7.4的磷酸鹽(PBS)緩沖液，離心得膠乳微球顆粒，用去離子水重復洗滌兩次膠乳微球顆粒，后用5mL濃度為0.12mol/L pH7.4的磷酸鹽(PBS)緩沖液重懸膠乳微球顆粒；向膠乳微球顆粒溶液中加入1.0mL的0.02mol/L的6-氨基己酸溶液，再加入2mgl-乙基-3- (3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺(EDC)，在室溫下攪拌反應30分鐘，離心并傾去上清液，制成接有氨基乙酸基團的羧化聚苯乙烯膠乳微球顆粒，并用5mL濃度為0.12mol/L pH7.4的磷酸鹽(PBS)緩沖液重懸膠乳微球顆粒，得到羧化改性的聚苯乙烯膠乳微球顆粒溶液。
[0038](2)肝型脂肪酸結合蛋白抗體與膠乳微球顆粒的結合
[0039]將IOOug兔抗人肝型脂肪酸結合蛋白多克隆抗體(購自Fitzgerald IndustriesInternational)凍干品，加入0.2mL去離子水溶解,取IOOuL溶液,用5mL濃度為0.12mol/L pH7.4的磷酸鹽(PBS)緩沖液稀釋后，加入(I)步所得的膠乳微球顆粒溶液中，再加入2mgEDC，在4°C攪拌反應7小時，加入0.2mL0.lmol/L的甘氨酸緩沖液(pH8.0)攪拌反應30min后終止反應，離心棄去上清，用20mL pH7.0的MES緩沖液洗滌I次，后用ImL pH7.0的MES緩沖液分散成乳白色混懸液，使致敏的抗體膠乳顆粒濃度為50g/L。
[0040]檢測試劑盒的制備
[0041]1、試劑I的制備:
[0042]按所述用量取各組分:
[0043]2- (N-嗎啡啉)乙磺酸20g
[0044]疊氮化鈉3g
[0045]吐溫202mL
[0046]將上述各組分溶解于900mL雙蒸水中，用lmol/L氫氧化鈉溶液調節(jié)溶液pH至7.0，后用蒸餾水定容至1L，密封4°C保存，備用。
[0047]2、試劑II的制備:[0048]按所述用量量取各組分:
[0049]
【權利要求】
1.一種肝型脂肪酸結合蛋白含量檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒由試劑I和試劑II組成，所述試劑I的組分包括:緩沖液、防腐劑、表面活性劑和水；所述的試劑II的組分包括:包被肝型脂肪酸結合蛋白抗體的膠乳顆粒、緩沖液、助懸劑、防腐劑、表面活性劑和水。
2.根據(jù)權利要求1所述的肝型脂肪酸結合蛋白含量檢測試劑盒，其特征在于，所述包被肝型脂肪酸結合蛋白抗體的膠乳顆粒的粒徑為180~220nm，所述肝型脂肪酸結合蛋白抗體為單克隆抗體或多克隆抗體。
3.根據(jù)權利要求2所述的肝型脂肪酸結合蛋白含量檢測試劑盒，其特征在于，所述包被肝型脂肪酸結合蛋白抗體的膠乳顆粒采用化學交聯(lián)法制備得到，所述化學交聯(lián)法制備包被肝型脂肪酸結合蛋白抗體的膠乳顆粒包括以下步驟: (1)取0.2~1.0mL膠乳微球顆粒于離心管中，加入4.0~4.8mL磷酸緩沖液，混勻后離心得膠乳微球顆粒，后用3~IOmL磷酸鹽緩沖液重懸膠乳微球顆粒，向重懸的膠乳微球顆粒溶液中加入濃度為0.02mol/L的6-氨基己酸溶液0.5~2mL，再加入I~3mgEDC粉末，攪拌反應20~60min，離心去上清，并用3~IOmL磷酸鹽緩沖液重懸膠乳顆粒，既得羧化改性的聚苯乙烯膠乳微球顆粒； (2)取50~200ug肝型脂肪酸結合蛋白單克隆抗體和多克隆抗體凍干品，用0.05~0.5mL去離子水溶解，后取50~300uL抗體溶液用5mL磷酸鹽緩沖液稀釋，并將稀釋后的溶液加入羧化改性的聚苯乙烯膠乳微球顆粒溶液中，再加入I~5mg的EDC，在4°C攪拌反應6~10小時，加入0.2mL甘氨酸溶液終止反應，離心去上清，并用ImL pH7.0的2_(N_嗎啡啉)乙磺酸緩沖液中分散，既得包被抗體的膠乳微球顆粒溶液。
4.根據(jù)權利要求1所述的肝型脂肪酸結合蛋白含量檢測試劑盒，其特征在于，所述的緩沖液為三羥甲基氨基甲烷-HCl緩沖液、磷酸鹽緩沖液、咪唑緩沖液、甘氨酸緩沖液、巴比妥緩沖液以及2- (N-嗎啡啉)乙磺酸緩沖液中的一種或任意兩種的混合；所述防腐劑為疊氮化鈉、Proclin300、硫柳萊、苯酹以及乙基萊硫代硫酸鈉中的一種或任意幾種的混合；所述表面活性劑為吐溫20、吐溫40、司盤40以及司盤60的一種或任意幾種的混合；所述助懸劑為乙二醇、丙三醇、海藻酸鈉、乳糖以及麥芽糖中的一種或任意兩種的混合。
5.根據(jù)權利要求1所述的肝型脂肪酸結合蛋白含量檢測試劑盒，其特征在于，每I升試劑I中各組分的用量為:緩沖劑5~80g，防腐劑0.1~10g，表面活性劑0.1~5mL，余量為水。
6.根據(jù)權利要求5所述的肝型脂肪酸結合蛋白含量檢測試劑盒，其特征在于，每I升試劑I中各組分的用量為:緩沖劑15~30g，防腐劑I~5g，表面活性劑I~3mL，余量為水。
7.根據(jù)權利要求1所述的肝型脂肪酸結合蛋白含量檢測試劑盒，其特征在于，每I升試劑II中各組分的用量為:包被肝型脂肪酸結合蛋白抗體的膠乳微球顆粒0.5~3.5g，緩沖劑5~80g，助懸劑5~50g，防腐劑0.1~10g，表面活性劑0.1~5mL，余量為水。
8.根據(jù)權利要求7所述的肝型脂肪酸結合蛋白含量檢測試劑盒，其特征在于，每I升試劑II中各組分的用量為:包被肝型脂肪酸結合蛋白抗體的膠乳微球顆粒0.8~3g，緩沖劑10~30g，助懸劑10~30g，防腐劑I~5g，表面活性劑I~3mL，余量為水。
9.根據(jù)權利要求1所述的肝型脂肪酸結合蛋白含量檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑I和試劑II的的PH值范圍為6.0~9.0。
10.一種權利要求1至9任一項所述的肝型脂肪酸結合蛋白含量檢測試劑盒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)制備試劑1:將各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中，混合均勻，調整pH值，定容得到試劑I ; (2)制備試劑I1:通過化學交聯(lián)法制備包被肝型脂肪酸結合蛋白抗體包被的膠乳微球顆粒，將其余各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中得到混合溶液，將混合溶液于膠乳顆粒混勻，調整PH值，定容得 到試劑II。
【文檔編號】G01N33/531GK103529225SQ201310539830
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年11月4日 優(yōu)先權日:2013年11月4日
【發(fā)明者】華權高, 來祥兵, 許可, 沈鶴霄, 舒芹 申請人:武漢華美生物工程有限公司