一種腸出血性大腸桿菌o157:h7 elisa抗體檢測試劑盒及其使用方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種腸出血性大腸桿菌O157:H7ELISA抗體檢測試劑盒及其使用方法，包括：a）包被板、b）10×濃縮洗滌液、c）稀釋液、d）酶標(biāo)二抗、e）底物A液、底物B液、底物緩沖液、f）陰、陽性對照血清、g）終止液，所述的包被板為包被抗原的96孔板，其包括包被純化的intimin蛋白和包被液。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點：1、能夠簡便快速的檢測血清中大腸桿菌O157：H7特異性抗體；2、特異性好，包被板包被抗原為大腸桿菌O157：H7特異性蛋白intimin，和大腸桿菌其它血清型以及雞白痢等血清不發(fā)生交叉反應(yīng)；3、靈敏度高。
【專利說明】—種腸出血性大腸桿菌0157:H7 ELISA抗體檢測試劑盒及 其使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種腸出血性大腸桿菌0157:H7ELISA抗體檢測試劑盒及其使用方 法，屬于抗體檢測領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]腸出血性大腸桿菌(EnterohemorrhagicEscherichia coli, EHEC)等食源性病原 微生物是當(dāng)今世界上不斷增多的食品安全和突發(fā)性公共衛(wèi)生事件的主要誘因。在食源性病 原微生物中，EHEC占有重要地位，主要包括0157:H7、026:HlI和0111,0157:H7是出血性腸 炎的主要致病菌。0157:H7感染具有暴發(fā)流行趨勢、強(qiáng)烈的致病性與致死性以及抗生素治療 可能會加劇病情等特點。1982年，0157:H7首先在美國發(fā)現(xiàn)，此后在世界各地散發(fā)或地方流 行，已成為全球性的公共衛(wèi)生和食品安全問題。
[0003]目前，國內(nèi)外已報道的檢測方法大多對抗原進(jìn)行檢測，而缺乏對抗體檢測方法的 研究，因而有必要建立快速、簡便、特異的抗體檢測方法。
[0004]0157:H7LEE毒力島上的eae基因編碼的94kDa的外膜蛋白即緊密素(intimin)是 EHEC重要的外膜蛋白，其介導(dǎo)細(xì)菌與上皮細(xì)胞的緊密黏附，是最重要的黏附因子，可產(chǎn)生 A/E病變。0157:H7主要依靠緊密素及其受體黏附于腸上皮細(xì)胞，緊密素的特異性抗體可阻 斷細(xì)菌的黏附而使其喪失致病力，具有較強(qiáng)的免疫原性和免疫保護(hù)性，是理想的疫苗備選 抗原。Intimin蛋白為包被抗原的ELISA抗體檢測試劑盒對大腸桿菌0157:H7的流行病學(xué) 調(diào)查以及疫苗效果評估有重要作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種腸出血性大腸桿菌0157:H7ELISA抗體檢測試劑盒，該 試劑盒選擇腸出血性大腸桿菌0157:H7LEE毒力島上的eae基因的表達(dá)產(chǎn)物intimin包被 酶標(biāo)板及其應(yīng)用方法，其可快速檢測血清中大腸桿菌0157:H7特異性抗體，了解雞體抗體 水平或感染狀況，對于該病的流行病學(xué)調(diào)查有著重要作用。
[0006]本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題而采取的技術(shù)方案為:一種腸出血性大腸桿菌 0157:H7ELISA抗體檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒包括:a)包被板、b) 10 X濃縮洗滌液、 c)稀釋液、d)酶標(biāo)二抗、e)底物A液、底物B液、底物緩沖液、f)陰、陽性對照血清、g)終 止液，所述的包被板為包被抗原的96孔板，其包括包被純化的intimin蛋白和包被液，包被 濃度為0.88 u g/mL,所述的intimin蛋白是腸出血性大腸桿菌0157:H7LEE毒力島上的eae 基因原核表達(dá)產(chǎn)物，eae基因的上游引物為5 ‘-GGGAATTCCATATGATTACTCATGGITGTTAT-3’， 下游引物為 5 ‘-CCGTCTCGAGTTCTACACAAACCGCATAG-3’。
[0007]按上述方案，所述的包被液為0.05mol/L碳酸鹽緩沖液，pH值為9.6，按如下配方 進(jìn)行配制:Na2C03l.59g, NaHC032.93g，加 ddH20 定容至 1000ml。
[0008]按上述方案，所述的IOX濃縮洗滌液為含5%Tween_20的10XPBST，pH值為1.4，按如下配方進(jìn)行配制:10 XPBSlOOOml，Tween-205ml。
[0009]按上述方案，所述的10XPBS濃度為0.lmol/L，pH值為7.4，按如下配方進(jìn)行配制=Na2HPO4.12H2058g, KH2P044g, NaCl 160g, KC14g，溶于 980ml ddH20 中，調(diào) pH 至 7.4，定容至 1000ml0
[0010]按上述方案，所述的稀釋液為含1%MILK的PBST，按如下配方進(jìn)行配制:取用 CldH2OlO倍稀釋的濃縮洗滌液100ml，MILK1.0g，混合。
[0011]按上述方案，所述的酶標(biāo)二抗為兔抗雞lgY-HRP。
[0012]按上述方案，所述的底物緩沖液9.5ml,底物A液32ul，底物B液0.5ml,混勻， 其中所述的底物A液配制方法為H2O20.75ml、三蒸水100ml，混合，4°C避光保存；所述的底物B液配制方法為TMB0.lg、無水乙醇50ml，混合，4°C避光保存；所述的底物緩沖液:檸檬酸? H204.91g, Na2HPO4.12H2019.38g，加 ddH20 定容至 1000ml。
[0013]按上述方案，所述的陰性對照血清為采集健康的SPF雞血，離心取上清，保存?zhèn)溆茫凰龅年栃詫φ昭鍨椴杉?157:H7的SPF雞血，離心取上清，保存?zhèn)溆谩?br> [0014]按上述方案，所述的終止液為2mol/L H2SO4，按如下配方進(jìn)行配制:取濃 H2S0455.5ml，緩慢滴加到ddH20中，冷卻后定容至500ml。
[0015]腸出血性大腸桿菌0157:H7ELISA抗體檢測試劑盒的使用方法，其特征在于包括有以下步驟:
[0016]I)取包被抗原的96孔板，其包括包被純化的intimin蛋白和包被液，包被濃度為
0.88 V- g/mL,所述的intimin蛋白是腸出血性大腸桿菌0157:H7LEE毒力島上的eae基因原核表達(dá)產(chǎn)物，eae基因的上游引物為5 ‘-GGGAATTCCATATGATTACTCATGGITGTTA`T-3’，下游引物為5 ‘-CCGTCTCGAGTTCTACACAAACCGCATAG-3 ’，用稀釋液將待檢樣品1:200倍稀釋后加入板孔中，IOOuL/孔，用同樣的方法1:200倍稀釋陰、陽性對照血清，陰、陽性對照血清各設(shè)2 孔，IOOuL/孔，另設(shè)一空白對照孔，空白對照孔加IOOul待檢樣品稀釋液，輕輕振勻孔中樣品，37 °C溫育Ih ；
[0017]2)甩凈孔中用稀釋液稀釋的待檢樣品和陰、陽性對照血清以及待檢樣品稀釋液， 用CldH2OlO倍稀釋的濃縮洗滌液洗滌5次，200uL/孔，每次5min，然后甩凈10倍稀釋的濃縮洗洚液，拍干；
[0018]3)將加了待檢樣品和陰、陽性對照血清的所有孔以及空白對照孔加入用稀釋液 1:5000倍稀釋的酶標(biāo)二抗IOOul，37°C溫育Ih ；
[0019]4)洗滌，方法同步驟2);
[0020]5)將加了待檢樣品和陰、陽性對照血清的所有孔以及空白對照孔加入底物A液、 底物B液、底物緩沖液配成的顯色液IOOul，混勻，室溫避光顯色10分鐘。
[0021]6)將加了待檢樣品和陰、陽性對照血清的所有孔以及空白對照孔加入終止液 50ul，在酶標(biāo)儀上測定0D45Q。
[0022]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點:
[0023]1、能夠簡便快速的檢測血清中大腸桿菌0157:H7特異性抗體，了解雞體抗體水平或感染狀況，對于該病的流行病學(xué)調(diào)查有著重要作用；
[0024]2、特異性好，包被板包被抗原為大腸桿菌0157:H7特異性蛋白intimin，和大腸桿菌其它血清型以及雞白痢等血清不發(fā)生交叉反應(yīng)；[0025]3、靈敏度高，血清稀釋1:1600倍時仍能檢測到0157:H7intimin特異性抗體。 【具體實施方式】
[0026]一種腸出血性大腸桿菌0157:H7ELISA抗體檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒包括:a)包被板、b) IOX濃縮洗滌液、c)稀釋液、d)酶標(biāo)二抗、e)底物A液、底物B液、底物緩沖液、f)陰、陽性對照血清、g)終止液，所述的包被板為包被抗原的96孔板，其包括包被純化的intimin蛋白和包被液,包被濃度為0.88 u g/mL,所述的intimin蛋白是腸出血性大腸桿菌0157: H7LEE毒力島上的eae基因原核表達(dá)產(chǎn)物，eae基因的上游引物為5 ‘ -GGGAATT CCATATGATTACTCATGGTTGTTAT-3 ’，下游引物為 5 ‘ -CCGTCTCGAGTTCTACACAAACCGCATAG-3 ’。
[0027]所述的包被液為0.05mol/L碳酸鹽緩沖液，pH值為9.6，按如下配方進(jìn)行配制: Na2CO3L 59g, NaHC032.93g，加 ddH20 定容至 1000ml。
[0028]所述的IOX濃縮洗滌液為含5%Tween_20的10XPBST，pH值為1.4，按如下配方進(jìn)行配制:10 XPBSlOOOml，Tween-205ml O
[0029]所述的10XPBS濃度為0.lmol/L, pH值為7.4，按如下配方進(jìn)行配制: Na2HPO4.12H2058g, KH2P044g, NaCl 160g, KC14g,溶于 980ml ddH20 中，調(diào) pH 至 7.4，定容至 1000ml0
[0030]所述的稀釋液為含1%MILK的PBST，按如下配方進(jìn)行配制:取用ddH2010倍稀釋的濃縮洗滌液100ml，MILK1.0g，混合。
[0031]所述的酶標(biāo)二抗為兔抗雞lgY-HRP。
[0032]所述的底物緩沖液9.5ml，底物A液32ul，底物B液0.5ml，混勻，其中所述的底物A液配制方法為H2O20.75ml、三蒸水100ml，混合，4°C避光保存；所述的底物B液配制方法為TMB0.lg、無水乙醇50ml，混合，4°C避光保存；所述的底物緩沖液:檸檬酸.H204.91g， Na2HPO4.12H2019.38g，加 ddH20 定容至 1000ml。
[0033]所述的陰性對照血清為采集健康的SPF雞血，離心取上清，保存?zhèn)溆?；所述的陽性對照血清為采集?157: H7的SPF雞血，離心取上清，保存?zhèn)溆?。`
[0034]所述的終止液為2mol/L H2SO4,按如下配方進(jìn)行配制:取濃H2S0455.5ml，緩慢滴加到ddH20中，冷卻后定容至500ml。
[0035]腸出血性大腸桿菌0157:H7ELISA抗體檢測試劑盒的使用方法，其特征在于包括有以下步驟:
[0036]I)取包被抗原的96孔板，其包括包被純化的intimin蛋白和包被液，包被濃度為
0.88 V- g/mL,所述的intimin蛋白是腸出血性大腸桿菌0157:H7LEE毒力島上的eae基因原核表達(dá)產(chǎn)物，eae基因的上游引物為5 ‘-GGGAATTCCATATGATTACTCATGGITGTTAT-3’，下游引物為5 ‘-CCGTCTCGAGTTCTACACAAACCGCATAG-3 ’，用稀釋液將待檢樣品1:200倍稀釋后加入板孔中，IOOuL/孔，用同樣的方法1:200倍稀釋陰、陽性對照血清，陰、陽性對照血清各設(shè)2 ?L, IOOuL/孔，另設(shè)一空白對照孔，空白對照孔加IOOul待檢樣品稀釋液，輕輕振勻孔中樣品，37 °C溫育Ih ；
[0037]2)甩凈孔中用稀釋液稀釋的待檢樣品和陰、陽性對照血清以及待檢樣品稀釋液， 用CldH2OlO倍稀釋的濃縮洗滌液洗滌5次，200uL/孔，每次5min，然后甩凈10倍稀釋的濃縮洗滌液，拍干；[0038]3)將加了待檢樣品和陰、陽性對照血清的所有孔以及空白對照孔加入用稀釋液 1:5000倍稀釋的酶標(biāo)二抗IOOul，37°C溫育Ih ；
[0039]4)洗滌，方法同步驟2);
[0040]5)將加了待檢樣品和陰、陽性對照血清的所有孔以及空白對照孔加入底物A液、 底物B液、底物緩沖液配成的顯色液IOOul，混勻，室溫避光顯色10分鐘。
[0041]6)將加了待檢樣品和陰、陽性對照血清的所有孔以及空白對照孔加入終止液 50ul，在酶標(biāo)儀上測定0D45Q。
[0042]下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，這些實例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
[0043]腸出血性大腸桿菌0157:H7ELISA抗體檢測試劑盒組成與配制
[0044]1、試劑組成
[0045]引物由上海生物工程公司合成，兔抗雞IgY-HRP購自于Thermo公司，MILK購自BD 公司，酶標(biāo)板購自深圳金燦華公司，Tween-20購自AMRESC0公司，大腸桿菌其它血清型01、
02、011、018、035、045、078、086、088、0147、雞白痢以及新城疫等標(biāo)準(zhǔn)血清購自中國獸藥監(jiān)察所。
[0046]2、試劑配制
[0047]A) IOX 濃縮洗滌液(PBST PH7.4): 10XPBSlOOOml，Tween_205ml
[0048]B)包被液(0.05mol/L 碳酸鹽緩沖液 PH9.6) =Na2CO3L 59g, NaHC032.93g，加 ddH20 定容至1000ml
[0049]C)封閉液(含 5.0%MILK):I XPBSTlOOml, BSA5.0g
[0050]D)顯色液(底物液):
[0051]底物A液:H2020.75ml，三蒸水100ml，4°C避光保存。
[0052]底物B液:TMB0.lg，無水乙醇50ml，4°C避光保存。
[0053]底物緩沖液:檸檬酸?H204.91g，Na2HPO4.12H2019.38g，加 ddH20 定容至 1000ml。
[0054]使用方法:底物緩沖液9.5ml，底物A液32ul，底物B液0.5ml，混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。
[0055]E) 10XPBS (0.lmol/L PH7.4) =Na2HPO4.12H2058g, KH2P044g, NaCl 160g, KC14g，溶于 980ml ddH20 中，調(diào) PH 至 7.4，定容至 1000ml。
[0056]F)終止液(2mol/L H2SO4):取濃H2S0455.5ml，緩慢滴加到ddH20中，冷卻后定容至 500ml。
[0057]G)稀釋液(含 1%MILK 的 PBST):I XPBSTlOOml, MILK1.0g
[0058]H)制備試劑:雙蒸水
[0059]腸出血性大腸桿菌0157:H7ELISA抗體檢測試劑盒的使用方法
[0060]1、樣品的處理:被檢樣品為血清,用稀釋液稀釋200倍后編號備檢。
[0061]2、被檢樣品的檢測:①將備檢樣品加入包被抗原的96孔板，IOOuL/孔。用同樣的方法1:200倍稀釋陰、陽性對照血清，陰、陽性對照各設(shè)2孔，IOOuL/孔。另設(shè)一空白對照孔，空白對照孔加IOOul樣品稀釋液，輕輕振勻孔中樣品，37°C溫育lh。②甩凈孔中溶液，用 CldH2OlO倍稀釋的濃縮洗滌液洗滌5次，200uL/孔，每次5min，然后甩凈洗滌液，拍干。③每孔加入用稀釋液1:5000倍稀釋的酶標(biāo)二抗(抗雞lgY-HRP)100ul，37°C溫育lh。④洗滌，方法同2。⑤每孔加入顯色液lOOul，混勻，室溫避光顯色10分鐘。⑥每孔加入終止液50ul，10分鐘內(nèi)在酶標(biāo)儀上測定od45(i。
[0062]3、結(jié)果判定
[0063]以空白孔調(diào)零，在酶標(biāo)儀上測定各孔OD450，試驗成立條件是陽性對照孔平均OD45tl 值應(yīng)大于或等于0.600,陰性對照孔平均OD45tl值低于0.200。
[0064]樣品孔OD45tl值大于0.300判為陽性，小于0.300判為陰性。
[0065]腸出血性大腸桿菌0157:H7ELISA抗體檢測試劑盒的初步應(yīng)用
[0066]1、靈敏性試驗:將陽性血清系列稀釋(1:50、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、 1:3200)，用腸出血性大腸桿菌0157:H7ELISA抗體檢測試劑盒進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果表明血清稀釋1:1600倍時仍能檢測到0157:H7intimin特異性抗體(試驗結(jié)果如表1)。
[0067]表1靈敏性試驗結(jié)果
[0068]
【權(quán)利要求】
1.一種腸出血性大腸桿菌0157:H7ELISA抗體檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒包括:a)包被板、b) IOX濃縮洗滌液、c)稀釋液、d)酶標(biāo)二抗、e)底物A液、底物B液、底物緩沖液、f)陰、陽性對照血清、g)終止液，所述的包被板為包被抗原的96孔板，其包括包被純化的intimin蛋白和包被液,包被濃度為0.88 u g/mL,所述的intimin蛋白是腸出血性大腸桿菌0157:H7LEE毒力島上的eae基因原核表達(dá)產(chǎn)物，eae基因的上游引物為5 ‘-GGGAATTCCA TATGATTACTCATGGTTGTTAT-3 ’，下游引物為 5 ‘ -CCGTCTCGAGTTCTACACAAACCGCATAG-3 ’。
2.按權(quán)利要求1所述的腸出血性大腸桿菌0157:H7ELISA抗體檢測試劑盒，其特征在于所述的包被液為0.05mol/L碳酸鹽緩沖液，pH值為9.6，按如下配方進(jìn)行配制=Na2CO3L 59g， NaHC032.93g，加 ddH20 定容至 1000ml。
3.按權(quán)利要求1所述的腸出血性大腸桿菌0157:H7ELISA抗體檢測試劑盒，其特征在于所述的IOX濃縮洗滌液為含5%Tween-20的10XPBST，pH值為7.4，按如下配方進(jìn)行配制: 10XPBSlOOOml，Tween-205mlo
4.按權(quán)利要求1所述的腸出血性大腸桿菌0157:H7ELISA抗體檢測試劑盒，其特征在于所述的10XPBS濃度為0.lmol/L，pH值為1.4，按如下配方進(jìn)行配制:Na2HP04.12H2058g, KH2P044g, NaCl 160g, KCl 4g,溶于 980ml ddH20 中，調(diào) pH 至 7.4，定容至 1000ml。
5.按權(quán)利要求1所述的腸出血性大腸桿菌0157:H7ELISA抗體檢測試劑盒，其特征在于所述的稀釋液為含1%MILK的PBST，按如下配方進(jìn)行配制:取用CldH2OlO倍稀釋的濃縮洗滌液 100ml, MILK1.0g，混合。
6.按權(quán)利要求1所述的腸出血性大腸桿菌0157:H7ELISA抗體檢測試劑盒，其特征在于所述的酶標(biāo)二抗為兔抗雞lgY-HRP。
7.按權(quán)利要求1所述的腸出血性大腸桿菌0157:H7ELISA抗體檢測試劑盒，其特征在于所述的底物緩沖液9.5ml，底物A液32ul，底物B液0.5ml，混勻，其中所述的底物A 液配制方法為H2O20.75ml、三蒸水100ml，混合，4°C避光保存；所述的底物B液配制方法為TMB0.lg、無水乙醇50ml，混合，4°C避光保存；所述的底物緩沖液:檸檬酸.H204.91g， Na2HPO4.12H2019.38g，加 ddH20 定容至 1000ml。
8.按權(quán)利要求1所述的腸出血性大腸桿菌0157:H7ELISA抗體檢測試劑盒，其特征在于所述的陰性對照血清為采集健康的SPF雞血，離心取上清，保存?zhèn)溆?；所述的陽性對照血清為采集?157:H7的SPF雞血，離心取上清，保存?zhèn)溆谩?br> 9.按權(quán)利要求1所述的腸出血性大腸桿菌0157:H7ELISA抗體檢測試劑盒，其特征在于，所述的終止液為2mol/L H2SO4，按如下配方進(jìn)行配制:取濃H2S0455.5ml，緩慢滴加到 ddH20中，冷卻后定容至500ml。
10.腸出血性大腸桿菌0157:H7ELISA抗體檢測試劑盒的使用方法，其特征在于包括有以下步驟:I)取包被抗原的96孔板，其包括包被純化的intimin蛋白和包被液，包被濃度為0.88 V- g/mL,所述的intimin蛋白是腸出血性大腸桿菌0157:H7LEE毒力島上的eae基因原核表達(dá)產(chǎn)物，eae基因的上游引物為5 ‘-GGGAATTCCATATGATTACTCATGGITGTTAT-3’，下游引物為5 ‘-CCGTCTCGAGTTCTACACAAACCGCATAG-3’，用稀釋液將待檢樣品1:200倍稀釋后加入板孔中，IOOuL/孔，用同樣的方法1:200倍稀釋陰、陽性對照血清，陰、陽性對照血清各設(shè)2 孔，IOOuL/孔，另設(shè)一空白對照孔，空白對照孔加IOOul待檢樣品稀釋液，輕輕振勻孔中樣品，37 °C溫育Ih ；2)甩凈孔中用稀釋液稀釋的待檢樣品和陰、陽性對照血清以及待檢樣品稀釋液，用 CldH2OlO倍稀釋的濃縮洗滌液洗滌5次，200uL/孔，每次5min，然后甩凈10倍稀釋的濃縮洗洚液，拍干；3)將加了待檢樣品和陰、陽性對照血清的所有孔以及空白對照孔加入用稀釋液1:5000 倍稀釋的酶標(biāo)二抗IOOul，37°C溫育Ih ；4)洗滌，方法同步驟2)；5)將加了待檢樣品和陰、陽性對照血清的所有孔以及空白對照孔加入底物A液、底物B 液、底物緩沖液配成的顯色液IOOul，混勻，室溫避光顯色10分鐘。6)將加了待檢樣品和陰、陽性對 照血清的所有孔以及空白對照孔加入終止液50ul，在酶標(biāo)儀上測定OD45tl。
【文檔編號】G01N33/569GK103558377SQ201310545709
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月6日
【發(fā)明者】羅玲, 邵華斌, 羅青平, 溫國元, 艾地云, 王紅琳, 茍妙 申請人:湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所