超分辨共聚焦光學(xué)顯微鏡與二次離子質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種超分辨共聚焦光學(xué)顯微鏡與二次離子質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)。激光器a輸出的激光經(jīng)二向色性濾光片a濾光后匯聚至顯微物鏡，激光器b輸出的激光依次經(jīng)位相板和二向色性濾光片b濾光后匯聚至所述顯微物鏡；經(jīng)顯微物鏡匯聚的激光照射至樣品臺，得到待測樣品的熒光信號又經(jīng)所述顯微物鏡匯聚后經(jīng)收集透鏡a收集后入射至光電探測器，光電探測器輸出的光電信號輸入至光學(xué)信號采集器；離子束發(fā)生器轟擊待測樣品得到二次離子，二次離子經(jīng)拉出電極獲得動能后，再經(jīng)離子門篩選后由反射探測器探測，反射探測器輸出的信號輸入至SIMS信號采集器；離子束發(fā)生器和樣品臺均與位移控制器相連接。由超分辨的光學(xué)成像引導(dǎo)SIMS成像和分析，由于超分辨的共聚焦光學(xué)顯微鏡分辨率可接近SIMs的分辨率，可以實現(xiàn)更高精度的靶點定位。
【專利說明】超分辨共聚焦光學(xué)顯微鏡與二次離子質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種超分辨共聚焦光學(xué)顯微鏡與二次離子質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)，屬于掃描顯微成像領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]在材料科學(xué)領(lǐng)域，大量研究結(jié)果表明物質(zhì)在納米尺度的尺寸效應(yīng)、量子效應(yīng)、表面效應(yīng)等使得納米材料與納米器件展現(xiàn)出非常優(yōu)異的性能。只有在納米尺度深入研究納米功能器件中表面與界面的物理化學(xué)過程以及不同表界面分子結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的變化，了解納米功能器件的工作機制，才能實現(xiàn)人工設(shè)計、制備具有特定性能納米器件的科學(xué)目標(biāo)。
[0003]生命科學(xué)中生化反應(yīng)和生物分子結(jié)構(gòu)與性能的研究更是如此，由于生物分子結(jié)構(gòu)(如構(gòu)象)的多樣性、生化反應(yīng)的非同步性和所處環(huán)境的非均一性，在納米尺度實現(xiàn)生理條件下蛋白質(zhì)、核酸等單個生物分子成像表征，對揭示生命的奧秘、提高疾病的預(yù)防、診斷、治療水平具有重要意義。
[0004]光學(xué)成像是最常用的成像表征技術(shù)，但是由于光學(xué)衍射原理的限制，傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡只能達到波長量級的空間分辨率(一般在200nm?500nm)，限制了它在納米尺度對分子結(jié)構(gòu)和功能研究中的應(yīng)用。2006年以來各國研究人員提出了光活化定位顯微鏡(PALM)、隨機光學(xué)重構(gòu)顯微鏡(STORM)、受:激福射耗盡(Stimulated emission depletion-STED)顯微鏡等幾種突破衍射極限的熒光成像新原理，其中STED顯微鏡以其時間分辨的優(yōu)勢在對動態(tài)過程的成像應(yīng)用中具有很大的前景。
[0005]STED顯微鏡作為一種超分辨的共聚焦光學(xué)顯微鏡,是一種掃描成像技術(shù)，它是在傳統(tǒng)共聚焦顯微鏡的基礎(chǔ)上，添加一路STED光束，通過調(diào)制STED光束波前在物鏡焦平面上形成空殼形狀焦斑，將激發(fā)光衍射光斑周圍的熒光分子轉(zhuǎn)換為非輻射態(tài)，實現(xiàn)了好于50納米的空間分辨率。目前超分辨的共聚焦光學(xué)顯微鏡的研究還處于起步階段，與其他成像技術(shù)的聯(lián)用尚未開展。
[0006]質(zhì)譜分析是將樣品轉(zhuǎn)化為運動的帶電離子碎片，通過測量其核質(zhì)比來進行化學(xué)組分分析的一種分析方法。而質(zhì)譜成像可以對樣品不同位置的化學(xué)組分進行質(zhì)譜分析，是一種新的分子成像技術(shù)，利用該技術(shù)可在分子水平上實現(xiàn)對表界面材料、生物組織、甚至細胞內(nèi)的分子“直接”掃描和信號采集，獲得分子的定位、定性和定量的信息。
[0007]采用一次離子束轟擊的二次離子質(zhì)譜SIMS最大的特點是具有高空間分辨率，并且樣品處理簡單，不需要添加基質(zhì)，還能對納米材料、生物醫(yī)學(xué)材料進行納米尺度的三維成像分析。
[0008]現(xiàn)有的飛行時間二次離子質(zhì)譜儀系統(tǒng)中整合有光學(xué)顯微鏡，用于整體觀測樣品形貌。但是，所整合的光學(xué)顯微鏡的分辨率在微米級，與二次離子質(zhì)譜的分辨率(〈lOOnm)不匹配，無法同步觀察材料表面形貌和化學(xué)組成的關(guān)系，特別是進行二次離子質(zhì)譜(SIMS)三維深度成像分析時，經(jīng)過一次離子的逐層轟擊剝離，樣品形貌在發(fā)生著細微的變化，用商品化二次離子質(zhì)譜儀是無法觀測此過程的。[0009]因為熒光成像可以定位特定的靶分子，將熒光成像技術(shù)與SIMS技術(shù)聯(lián)用，通過熒光成像引導(dǎo)SIMS離子束在樣品表面特定位置進行轟擊，既可以獲得單分子的光學(xué)信號和形貌圖像，又可以獲得單分子質(zhì)譜信息。但是由于光學(xué)衍射極限的限制，現(xiàn)有的激光共聚焦顯微鏡空間分辨率只能達到250nm?300nm，難以實現(xiàn)復(fù)雜體系中納米級光學(xué)成像，對SMS離子束引導(dǎo)定位也不夠精確。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明的目的是提供一種超分辨共聚焦光學(xué)顯微鏡與二次離子質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)，通過在共聚焦光學(xué)顯微鏡中加入第二路調(diào)制光，實現(xiàn)超分辨的共聚焦光學(xué)顯微成像，突破傳統(tǒng)的光學(xué)衍射極限的限制；本發(fā)明通過將SIMS與超分辨的共聚焦光學(xué)顯微系統(tǒng)結(jié)合，由于超分辨的共聚焦光學(xué)顯微鏡分辨率可接近SIMS的分辨率，在獲得單分子的光學(xué)信號和形貌圖像的同時，可以獲得分子質(zhì)譜信息，實現(xiàn)在納米尺度和分子水平對復(fù)雜體系多參量成像和分析，還可以首先進行超分辨的光學(xué)顯微成像，然后利用該高分辨的光學(xué)顯微圖像對SIMS離子束進行納米級精確引導(dǎo)定位，實現(xiàn)特定靶點的SIMS分析。
[0011]本發(fā)明所提供的一種超分辨共聚焦光學(xué)顯微鏡與二次離子質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)，激光器a輸出的激光經(jīng)二向色性濾光片a濾光后匯聚至顯微物鏡，激光器b輸出的激光依次經(jīng)位相板和二向色性濾光片b濾光后匯聚至所述顯微物鏡；經(jīng)所述顯微物鏡匯聚的激光照射至樣品臺，得到待測樣品的熒光信號又經(jīng)所述顯微物鏡匯聚后經(jīng)收集透鏡a收集后入射至光電探測器，所述光電探測器輸出的光電信號輸入至光學(xué)信號采集器；
[0012]離子束發(fā)生器轟擊待測樣品得到二次離子，所述二次離子經(jīng)拉出電極獲得動能后，再經(jīng)離子門篩選后由反射探測器探測，所述反射探測器輸出的信號輸入至SIMS信號采集器；
[0013]所述離子束發(fā)生器和樣品臺均與一位移控制器相連接。
[0014]上述的聯(lián)用系統(tǒng)中，所述激光器a輸出激光與所述激光器b輸出的激光在匯聚至所述顯微物鏡之前均經(jīng)一反射鏡，以調(diào)整光路對準(zhǔn)
[0015]上述的聯(lián)用系統(tǒng)中，所述待測樣品的熒光信號在入射至所述收集透鏡a之前經(jīng)過一反射鏡，用于對準(zhǔn)光路；所述待測樣品的熒光信號在入射至所述收集透鏡a之前經(jīng)過一濾波片，用于濾除激發(fā)光。
[0016]上述的聯(lián)用系統(tǒng)中，所述二次離子經(jīng)所述離子門篩選后再經(jīng)一彎曲反射場反射后由所述反射探測器探測。
[0017]本發(fā)明的聯(lián)用系統(tǒng)中，所述光學(xué)信號采集器和SIMS信號采集器均由同一數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)采集和處理。
[0018]本發(fā)明提供的超分辨共聚焦光學(xué)顯微鏡與二次離子質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)具有以下有益效果:
[0019]1、在一套成像平臺上同時實現(xiàn)光學(xué)成像與SMS成像，在獲得單分子的光學(xué)信號和形貌圖像的同時，可以獲得單分子化學(xué)組分的等其它參量信息。
[0020]2、同時成像克服了二次成像帶來的定位不準(zhǔn)和信息變化的缺點。
[0021]3、由超分辨的光學(xué)成像引導(dǎo)SIMS成像和分析，由于超分辨的共聚焦光學(xué)顯微鏡分辨率可接近SIMs的分辨率，可以實現(xiàn)更高精度的靶點定位?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0022]圖1為本發(fā)明提供的聯(lián)用系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0023]圖2為使用本發(fā)明提供的聯(lián)用系統(tǒng)對熒光標(biāo)記的硅球的超分辨共聚焦顯微圖像(左圖)和SMS質(zhì)譜成像(右圖)。
[0024]圖中各標(biāo)記如下:1激光器a、2 二向色性濾光片a、3,9反射鏡、4顯微物鏡、5激光器b、6位相板、7 二向色性濾光片b、8樣品臺、10濾波片、11收集透鏡a、12光電探測器、13光學(xué)信號采集器、14拉出電極、15離子門、16彎曲反射場、17反射探測器、18SIMS信號采集器、19位移控制器、20離子束發(fā)生器。
【具體實施方式】
[0025]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步說明，但本發(fā)明并不局限于以下實施例。
[0026]如圖1所示，本發(fā)明提供的超分辨共聚焦光學(xué)顯微鏡與二次離子質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)，激光器al輸出的激光經(jīng)二向色性濾光片a2濾光后經(jīng)反射鏡3反射后經(jīng)顯微物鏡4匯聚，激光器b5輸出的激光依次經(jīng)位相板6和二向色性濾光片b7濾光后經(jīng)反射鏡3反射后經(jīng)顯微物鏡4匯聚；經(jīng)過顯微物鏡4匯聚的激光照射至樣品臺8上，待測樣品的熒光信號又經(jīng)顯微物鏡4匯聚后經(jīng)反射鏡3、二向色性濾光片a2、二向色性濾光片b7、反射鏡9、濾波片10和收集透鏡all收集后入射至光電探測器12,光電探測器12輸出的光電信號輸入至光學(xué)信號米集器13。
[0027]離子束發(fā)生器20轟擊待測樣品得到樣品碎片，其中包括一次離子和二次離子，，帶有正電或者負電，在拉出電極14的作用下，二次離子獲得飛行動能，然后經(jīng)離子門15篩選后，再經(jīng)過彎曲反射場16反射后由反射探測器17探測，最后反射探測器17輸出的信號由SIMS信號采集器18采集。本發(fā)明提供的聯(lián)用系統(tǒng)中，超分辨成像和SIMS探測使用同一個樣品臺。
[0028]本發(fā)明提供的聯(lián)用系統(tǒng)中，激發(fā)用激光器al經(jīng)過二向色性濾光片a2、反射鏡3反射入顯微物鏡4，經(jīng)顯微物鏡4匯聚后，激發(fā)樣品發(fā)射熒光；退激發(fā)用激光器b5，經(jīng)過位相板6調(diào)整光束波前，經(jīng)二向色性濾光片b7和反射鏡3反射后，經(jīng)顯微物鏡4匯聚后形成空殼型焦斑，將激發(fā)光激發(fā)的熒光斑周圍熒光分子退激發(fā)，最后只有小體積的熒光分子自發(fā)輻射熒光，實現(xiàn)超分辨光學(xué)成像；樣品臺8在位移控制器19的控制下對樣品進行掃描，獲得不同位置的光學(xué)信號。熒光信號經(jīng)顯微物鏡4收集后，經(jīng)反射鏡3和反射鏡9反射后，由濾波片10濾除熒光以外的其它光，經(jīng)收集透鏡all匯聚后，由光電探測器12轉(zhuǎn)換為電信號；由光電探測器12獲得的光電信號，經(jīng)過光學(xué)信號采集器13采集后，由計算機進行重構(gòu)和處理獲得超分辨熒光顯微圖像。
[0029]樣品臺8在位移控制器19的控制下，實現(xiàn)樣品的SMS激發(fā)和探測，二次離子經(jīng)過拉出電極14獲得飛行動能，經(jīng)過離子門15篩選，經(jīng)過反射電場16反射后由反射探測器17探測，反射探測器產(chǎn)生的信號由SMS信號采集器18采集后，由計算機進行重構(gòu)和處理獲得SIMS質(zhì)譜成像。
[0030]離子束發(fā)生器20由位移控制器19控制實現(xiàn)激發(fā)離子束和光學(xué)焦斑的對準(zhǔn)，然后位移控制器19控制樣品臺8掃描樣品，實現(xiàn)超分辨光學(xué)成像和SIMS的同步成像。光學(xué)信號采集器13和SIMS信號采集器18由位移控制器19觸發(fā)，實現(xiàn)同步采集。
[0031]使用上述聯(lián)用系統(tǒng)和專門研制的共定位樣品板，準(zhǔn)確定位B32區(qū)域中的兩個HeLa腫瘤細胞，實現(xiàn)了超分辨光學(xué)和二次離子質(zhì)譜的聯(lián)用成像。紅色圓圈內(nèi)為光學(xué)和質(zhì)譜成像觀測到的細胞膜絨毛的精細結(jié)構(gòu)。
【權(quán)利要求】
1.一種超分辨共聚焦光學(xué)顯微鏡與二次離子質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)，其特征在于: 激光器a輸出的激光經(jīng)二向色性濾光片a濾光后匯聚至顯微物鏡,激光器b輸出的激光依次經(jīng)位相板和二向色性濾光片b濾光后匯聚至所述顯微物鏡；經(jīng)所述顯微物鏡匯聚的激光照射至樣品臺，得到待測樣品的熒光信號又經(jīng)所述顯微物鏡匯聚后經(jīng)收集透鏡a收集后入射至光電探測器，所述光電探測器輸出的光電信號輸入至光學(xué)信號采集器； 離子束發(fā)生器轟擊待測樣品得到二次離子，所述二次離子經(jīng)拉出電極獲得動能后，再經(jīng)離子門篩選后由反射探測器探測，所述反射探測器輸出的信號輸入至SIMS信號采集器； 所述離子束發(fā)生器和樣品臺均與一位移控制器相連接。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聯(lián)用系統(tǒng)，其特征在于:所述激光器a輸出激光與所述激光器b輸出的激光在匯聚至所述顯微物鏡之前均經(jīng)一反射鏡。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的聯(lián)用系統(tǒng)，其特征在于:所述待測樣品的熒光信號在入射至所述收集透鏡a之前經(jīng)過一反射鏡和一濾波片。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的聯(lián)用系統(tǒng)，其特征在于:所述二次離子經(jīng)所述離子門篩選后再經(jīng)一彎曲反射場反射后由所述反射探測器探測。
【文檔編號】G01N21/64GK103616355SQ201310576457
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月18日
【發(fā)明者】袁景和, 于建強, 趙立波, 吳魁, 方曉紅, 汪福意, 萬立駿 申請人:中國科學(xué)院化學(xué)研究所