一種定量檢測絲氨酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種定量檢測絲氨酸的方法。絲氨酸樣品經(jīng)過胱硫醚裂解酶（CBL）作用后生成丙酮酸、氨和硫代半胱氨酸，通過測定生成丙酮酸的含量，定量得到樣品中絲氨酸的含量。丙酮酸的含量的測定方法為乳酸脫氫酶法，丙酮酸和NADH在LD，pH7.4，作用下生成乳酸和NAD+，通過測定340nm波長處NADH下降速率，得到丙酮酸含量。本發(fā)明所提出的工藝操作簡便、快速，有較為精密和準確的分析性能、抗干擾能力強，能適應(yīng)絕大多數(shù)自動生化分析儀，易于實現(xiàn)自動化，是目前測定絲氨酸的優(yōu)選方法。
【專利說明】一種定量檢測絲氨酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于氨基酸檢測領(lǐng)域，涉及胱硫醚裂解酶法對絲氨酸的定量分析，是試劑檢測領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]絲氨酸是一種不帶電荷的極性氨基酸，白色結(jié)晶體或結(jié)晶性粉末，呈六角形片或柱狀晶，易溶于水和甲酸，難溶于乙醇。絲氨酸是一種非必需氨基酸，它在脂肪和脂肪酸的新陳代謝及肌肉的生長中發(fā)揮著作用，并且它有助于免疫血球素和抗體的產(chǎn)生，所以絲氨酸在維持健康的免疫系統(tǒng)方面扮演者重要的角色。絲氨酸是合成嘌呤、胸腺嘧啶、膽堿的前體，可用于生化研究。絲氨酸廣泛用于配置第三代復(fù)方氨基酸輸液和營養(yǎng)增補劑，并用于合成多種絲氨酸衍生物，如心血管、抗癌、艾滋病新藥及基因工程用保護氨基酸等。此外，絲氨酸具有穩(wěn)定滴眼液PH值的作用，且滴眼后無刺激性。在化妝品行業(yè)中，絲氨酸是一種重要的自然保濕因子(NMF)之一，它能有效保持皮膚角質(zhì)層的水分，因此是很多高級化妝品中的關(guān)鍵添加劑。2012年12月，英國Beatson癌癥研究所的研究人員在一項新研究中證實，絲氨酸是癌細胞相關(guān)的一種關(guān)鍵氨基酸，可顯著削弱癌細胞的生長和增殖能力。
[0003]目前，國內(nèi)外用來檢測氨基酸含量的方法，通常有高效液相色譜法、氨基酸自動分析儀法和紙層析-茚三酮顯色法。前兩種方法或者儀器設(shè)備要求高或者衍生步驟繁瑣，操作很不方便，而且對于樣品多、工作量大的絲氨酸分離提取以及絲氨酸產(chǎn)生菌的篩選來說并不適用。紙層析-茚三酮顯色法雖然操作方便、所用儀器較簡單，但在氨基酸種類復(fù)雜的環(huán)境中，對絲氨酸的層析分離和定量分析不夠準確。
[0004]絲氨酸在胱硫醚裂解酶(CBL)的作用下可以生成丙酮酸，丙酮酸測定的反應(yīng)是乳酸測定的逆反應(yīng)。在PH7.4條件下，平衡常數(shù)非常有利于逆反應(yīng)(生成乳酸的方向)。通過測定340nm波長處NADH的下降速率，定量丙酮酸含量。此方法優(yōu)點較多:順向反應(yīng)中以NAD+、乳酸為底物都比較穩(wěn)定，過量乳酸對乳酸脫氫酶(LD)的抑制作用小于過量丙酮酸；逆向反應(yīng)NADH的用量只有正向反應(yīng)NAD+的3%，酶促反應(yīng)速率快于正向反應(yīng)，所以應(yīng)用樣品量少且可在短時間內(nèi)完成測定。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種定量檢測絲氨酸的方法。
[0006]定量檢測絲氨酸的方法，絲氨酸樣品經(jīng)過胱硫醚裂解酶(CBL)作用后生成丙酮酸、氨和硫代半胱氨酸，通過測定生成丙酮酸的含量，定量得到樣品中絲氨酸的含量。
[0007]優(yōu)選地，所述的丙酮酸的含量的測定方法為乳酸脫氫酶法，丙酮酸和NADH在LD，PH7.4，作用下生成乳酸和NAD+，通過測定340nm波長處NADH下降速率，得到丙酮酸含量。
[0008]優(yōu)選地，，具體步驟如下:
I)、配置相關(guān)試劑:
A、0.5mmol/L絲氨酸標準應(yīng)用液，B、R1:20mmol/L HEPES 緩沖液，33 KU/L LD,8.9KU/L CBL, pH 7.4，
C、R2:50mmol/L Tris,0.416 mmol/L NADH, pH 7.4 ；
2)、根據(jù)自動化分析儀的型號、性能設(shè)定參數(shù)，溫度:37°C ;波長:340nm ;樣品和標準品各25 ii L，5s后加R1IOO u L，IOs后加R250 u L，每隔28s檢測OD34tl,分別測定樣品管和標準管吸光度的下降速率；
3 )、計算樣品中絲氨酸含量
【權(quán)利要求】
1.一種定量檢測絲氨酸的方法，其特征在于，絲氨酸樣品經(jīng)過胱硫醚裂解酶(CBL)作用后生成丙酮酸、氨和硫代半胱氨酸，通過測定生成丙酮酸的含量，定量得到樣品中絲氨酸的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的丙酮酸的含量的測定方法為乳酸脫氫酶法，丙酮酸和NADH在LD，pH7.4，作用下生成乳酸和NAD+，通過測定340nm波長處NADH下降速率，得到丙酮酸含量。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，具體步驟如下: 1)、配置相關(guān)試劑: A、0.5mmol/L絲氨酸標準應(yīng)用液，
B、R1:20mmol/L HEPES 緩沖液，33 KU/L LD, 8.9KU/L CBL, pH 7.4，
C、R2:50mmol/L Tris,0.416 mmol/L NADH, pH 7.4 ； 2)、根據(jù)自動化分析儀的型號、性能設(shè)定參數(shù)，溫度:37°C;波長:340nm ;樣品和標準品各25 uL，5s后加R11OO u L，1Os后加R250 u L，每隔28s檢測OD34tl,分別測定樣品管和標準管吸光度的下降速率； 3)、計算
【文檔編號】G01N21/33GK103674873SQ201310591734
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年11月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月22日
【發(fā)明者】繆劉, 許首芳, 余琳, 王軼雄 申請人:杭州利安生物科技有限公司