基于熒光發(fā)射抑制機理的隨機定位超分辨顯微方法及裝置制造方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于熒光發(fā)射抑制機理的隨機定位超分辨顯微方法及裝置，該方法包括：將同軸共路的激發(fā)光和抑制光同時聚焦在樣品上，樣品上具有受激熒光發(fā)射特性的位置隨機出射熒光，收集熒光信號，生成稀疏熒光分布圖像，對衍射斑進行單分子定位，將不同的熒光分子定位圖像經(jīng)圖像合成后即得。該裝置包括：第一激光光源、第二激光光源、反射鏡、第一二色鏡、科勒鏡組、第二二色鏡、顯微物鏡、樣品、濾光片、場鏡、目鏡、寬場感光元件以及計算機。本發(fā)明的分辨率精細度高，可以獲取橫向20nm的超分辨圖像；結(jié)構(gòu)簡單，成本低廉；減小了強激光或熒光漂白對于樣品的非可逆損害，增強了樣品的重復(fù)利用率；功能擴展性強。
【專利說明】基于熒光發(fā)射抑制機理的隨機定位超分辨顯微方法及裝置
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物樣品微觀觀測方法及設(shè)備領(lǐng)域，尤其涉及一種基于熒光發(fā)射抑制機理的隨機定位超分辨顯微方法及裝置。
【背景技術(shù)】
[0002]納米技術(shù)與生物技術(shù)是21世紀(jì)發(fā)展最迅速和熱門的科學(xué)領(lǐng)域。納米技術(shù)應(yīng)用廣泛，包括I?IOOnm尺度內(nèi)的成像、測量、加工、操縱等。許多重要的生物體比如葡萄糖、抗體、病毒等都處于這個尺度范圍內(nèi)，研究這些微小物體的需求推動了高分辨率顯微成像技術(shù)的發(fā)展。反過來，超分辨率顯微成像技術(shù)的發(fā)展也推動了整個生命科學(xué)的進步。相比其他的顯微技術(shù)，光學(xué)顯微技術(shù)的一大優(yōu)勢是可以對處于自然狀態(tài)的活細胞進行研究。
[0003]自世界上第一臺光學(xué)顯微鏡問世以來，提高光學(xué)顯微成像系統(tǒng)的分辨能力及測量范圍一直是眾多科學(xué)家致力研究的重要科學(xué)問題，特別是近年來，隨著物理學(xué)、生物醫(yī)學(xué)、微電子學(xué)和材料學(xué)等學(xué)科的迅速發(fā)展，對這一問題的研究變得尤為迫切，主要體現(xiàn)在:物理學(xué)的發(fā)展要求人們能觀測到微觀世界中原子的大?。环肿由飳W(xué)的發(fā)展要求人們能觀測到活體細胞這種高散射物質(zhì)內(nèi)小到納米尺度的單分子；微電子技術(shù)的發(fā)展要求人們能檢測到超大規(guī)模集成電路中窄到數(shù)十納米的線寬尺寸；納米新材料的出現(xiàn)要求人們能觀測到納米尺度大小的納米顆粒等，這些現(xiàn)代科學(xué)的新進展，更加促使人們不斷地去探索高分辨顯微成像的新方法和新技術(shù)。
[0004]由于衍射極限的存在，傳統(tǒng)的寬場光學(xué)顯微鏡橫向和縱向的分辨率分別僅約為230nm和lOOOnm。二十世紀(jì)三十年代發(fā)展起來的電子顯微成像技術(shù)及八十年代初崛起的各類非光學(xué)的探針掃描顯微成像技術(shù)具有納米甚至更高的分辨能力，但它們在不同程度上存在著系統(tǒng)結(jié)構(gòu)復(fù)雜、成像檢測環(huán)境要求苛刻及樣品處理繁瑣等困難，特別是不能獲得樣品重要的光學(xué)信息(如反射率、折射率、偏振態(tài)及光譜等信息)，因而無法完全取代光學(xué)顯微成像的地位。
[0005]隨著現(xiàn)代激光技術(shù)、計算機技術(shù)、精密機械及電子技術(shù)的迅猛發(fā)展，超分辨的光學(xué)顯微成像技術(shù)(Super-resolution Optical Microscopy, SR0M)應(yīng)運而生。在生物學(xué)領(lǐng)域，基于熒光非線性效應(yīng)的生物超分辨光學(xué)顯微成像技術(shù)的發(fā)展尤為迅速。目前，主流的生物超分辨光學(xué)顯微成像技術(shù)主要分為兩大類:一類是以S.ff.Hell等人提出的熒光發(fā)射抑制顯微術(shù)(Stimulated Emission Depletion Microscopy, STED)為代表的目標(biāo)開關(guān)與讀取顯微技術(shù)(Targeted Switching and Read-out Mode);另一類是以E.Betzig等人提出的光敏定位顯微技術(shù)(photoactivated localization microscopy, PALM)、X.Zhuang 等人提出的隨機光學(xué)重構(gòu)顯微技術(shù)(Stochastic Optical Reconstruction Microscopy, STORM)為代表的隨機開關(guān)與讀取顯微技術(shù)(Stochastic Switching and Read-out Mode)。前者以掃描方式成像，通過抑制光壓縮系統(tǒng)的有效點擴散函數(shù)(Point Spread Function, PSF)直接提高系統(tǒng)的分辨能力；后者則是以寬場成像的方式，通過多幅圖像重復(fù)拍攝的方法，對觀察區(qū)域內(nèi)的熒光分子進行隨機定位，最終通過重構(gòu)圖像達到超分辨的目的。雖然上述兩種方法均能夠?qū)崿F(xiàn)超分辨顯微的目的，但是都并不完美，例如:目標(biāo)開關(guān)與讀取顯微技術(shù)需要對樣品施加較強的抑制光(一般為數(shù)百兆W/cm2);而隨機開關(guān)與讀取顯微技術(shù)則需要預(yù)先對觀察區(qū)域內(nèi)的熒光分子進行漂白。這兩種情況都容易造成對觀察樣品不可逆的損害。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明綜合了兩種不同超分辨顯微技術(shù)的基本原理，提供了一種基于熒光發(fā)射抑制機理的隨機定位超分辨顯微方法及裝置，實現(xiàn)了對生物樣品超分辨顯微圖像的獲取。
[0007]—種基于熒光發(fā)射抑制機理的隨機定位超分辨顯微方法，包括以下步驟:
[0008]I)將同軸共路的激發(fā)光和抑制光同時聚焦在樣品上；
[0009]2)在激發(fā)光和抑制光的共同作用下，樣品上具有受激熒光發(fā)射特性的位置隨機出射熒光，產(chǎn)生熒光信號；
[0010]3)收集熒光信號，生成稀疏熒光分布圖像；
[0011]4)對稀疏熒光分布圖像上的衍射斑進行單分子定位，生成熒光分子定位圖像；
[0012]5)重復(fù)步驟3)和4)，得到不同的熒光分子定位圖像，經(jīng)圖像合成后得到樣品的超分辨顯微圖像。
[0013]所述的超分辨顯微，是指利用該方法獲取的圖像分辨率高于傳統(tǒng)顯微成像方法的分辨率，即高于所能分辨最小尺寸小于λ/2ΝΑ，其中λ為工作波長，NA為顯微鏡數(shù)值孔徑。
[0014]為實現(xiàn)對所有熒光分子的觀察，重復(fù)步驟3)隨機得到不同的稀疏熒光分布圖像，每個稀疏熒光分布圖像即為稀疏化單幀圖像，之后重復(fù)步驟4)，對不同的稀疏熒光分布圖像上的衍射斑進行單分子定位，生成不同的熒光分子定位圖像，完成對觀察區(qū)域內(nèi)樣品上不同熒光分子的單分子定位，直至樣品上所有的熒光分子完成單分子定位。將不同的熒光分子定位圖像(即定位圖像序列)經(jīng)圖像合成后，即得到了樣品的超分辨顯微圖像。
[0015]單分子定位，是指得到單個熒光分子受激發(fā)射的衍射斑后，使用曲線擬合算法對衍射斑進行高斯擬合，將擬合峰值位置作為該熒光分子的真實位置并在圖像相應(yīng)位置進行標(biāo)記的數(shù)學(xué)過程。
[0016]圖像合成，是指將所有單張熒光分子定位圖像上的熒光分子定位點，線性映射到一張圖像上的數(shù)學(xué)過程。
[0017]所述的樣品具有受激熒光發(fā)射或類似特性，可以是納米熒光顆?；蛘呓?jīng)過熒光分子染色的生物組織、細胞樣品，或者其它具有熒光發(fā)射特性的納米顆粒、量子點等材料樣品O
[0018]所述的激發(fā)光的波長位于樣品熒光分子的激發(fā)譜內(nèi)。
[0019]所述的抑制光的波長位于樣品熒光分子的發(fā)射譜內(nèi)。
[0020]本發(fā)明的工作原理是:
[0021]對于熒光分子而言，不同的激光入射波長將對其產(chǎn)生不同的影響。當(dāng)入射激光波長位于熒光分子的激發(fā)譜內(nèi)時，即入射激光為激發(fā)光，熒光分子將因為受激幅射作用而激發(fā)出熒光；相應(yīng)地，當(dāng)入射激光波長位于熒光分子的發(fā)射譜內(nèi)時，即入射激光為抑制光，熒光分子的受激幅射現(xiàn)象將受到限制。當(dāng)激發(fā)光和抑制光共同作用在熒光分子上時，則會產(chǎn)生競爭現(xiàn)象。根據(jù)簡化的熒光二能級模型(基態(tài)Stl、激發(fā)態(tài)S1),熒光分子自由電子的能級分布概率密度隨時間變化的關(guān)系可以由如下公式表示:
【權(quán)利要求】
1.一種基于熒光發(fā)射抑制機理的隨機定位超分辨顯微方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)將同軸共路的激發(fā)光和抑制光同時聚焦在樣品上； 2)在激發(fā)光和抑制光的共同作用下，樣品上具有受激熒光發(fā)射特性的位置隨機出射熒光，產(chǎn)生熒光信號； 3)收集熒光信號，生成稀疏熒光分布圖像； 4)對稀疏熒光分布圖像上的衍射斑進行單分子定位，生成熒光分子定位圖像； 5)重復(fù)步驟3)和4)，得到不同的熒光分子定位圖像，經(jīng)圖像合成后得到樣品的超分辨顯微圖像。
2.一種基于熒光發(fā)射抑制機理的隨機定位超分辨顯微裝置，其特征在于，包括: 用于產(chǎn)生激發(fā)光的第一激光光源； 用于產(chǎn)生抑制光的第二激光光源； 用于將激發(fā)光和抑制光合束的第一二色鏡； 用于將所述第一二色鏡的合束光均勻光線的科勒鏡組； 用于聚焦激發(fā)光和抑制光并收集樣品熒光信號的顯微物鏡； 用于將所述科勒鏡組的勻光反射至所述顯微物鏡上并將所述顯微物鏡收集的樣品熒光信號透射的第二二色鏡； 用于對所述第二二色鏡的透射光進行過濾激發(fā)光和抑制光的濾光片； 用于收束所述濾光片的出射光的場鏡； 用于接收所述場鏡的出射光的目鏡； 用于將所述目鏡的出射光進行成像的寬場感光元件； 以及用于對所述寬場感光元件形成的圖像進行處理，并得到最終的樣品超分辨顯微圖像的計算機。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于熒光發(fā)射抑制機理的隨機定位超分辨顯微裝置，其特征在于，所述第一激光光源和第一二色鏡均位于主軸光路上，所述第二激光光源通過反射鏡與所述第一激光光源匯聚在所述第一二色鏡上。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于熒光發(fā)射抑制機理的隨機定位超分辨顯微裝置，其特征在于，所述第一激光光源的激發(fā)光的譜寬小于等于10nm，所述第一激光光源的發(fā)射功率為5~20mW，所述第一激光光源的激發(fā)光的波長位于樣品的熒光吸收譜峰值位置。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于熒光發(fā)射抑制機理的隨機定位超分辨顯微裝置，其特征在于，所述第二激光光源的激發(fā)光的譜寬小于等于10nm，所述第二激光光源的發(fā)射功率為IOOmff~1W，所述第二激光光源的激發(fā)光的波長位于樣品的熒光發(fā)射譜峰值紅移位置。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于熒光發(fā)射抑制機理的隨機定位超分辨顯微裝置，其特征在于，所述第一二色鏡對激發(fā)光表現(xiàn)為98%以上的高透過率、而對抑制光表現(xiàn)為98%~99.9%高反射率。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于熒光發(fā)射抑制機理的隨機定位超分辨顯微裝置，其特征在于，所述的第二二色鏡對激發(fā)光和抑制光需要98%以上高反射率。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于熒光發(fā)射抑制機理的隨機定位超分辨顯微裝置，其特征在于，所述的顯微物鏡為數(shù)值孔徑=1.35~1.49、放大率為50~150倍的浸沒式平場消輔色差生物顯微物鏡鏡頭。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于熒光發(fā)射抑制機理的隨機定位超分辨顯微裝置，其特征在于，所述濾光片的光軸與主光軸的夾角為5°。
【文檔編號】G01N21/64GK103592278SQ201310593816
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年11月21日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月21日
【發(fā)明者】李旸暉, 金尚忠, 袁琨, 金杯洲 申請人:中國計量學(xué)院, 杭州彩譜科技有限公司