水牛卵泡液多肽組的制備和質(zhì)譜分析方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種水牛卵泡液多肽組的制備和質(zhì)譜分析方法，先通過(guò)合理濃度的乙腈沉淀水牛卵泡液中的高豐度蛋白質(zhì)，可有效去除高豐度蛋白質(zhì)對(duì)檢測(cè)的干擾，再通過(guò)不同孔徑的超濾管多次過(guò)濾、截留不同分子量的多肽，能有效富集多肽組樣品；脫鹽處理后，用飛行時(shí)間質(zhì)譜儀分析多肽組指紋圖譜，在質(zhì)譜檢測(cè)時(shí)，通過(guò)合適的質(zhì)譜分析條件，能高通量鑒定卵泡液多肽組信息。本發(fā)明精確、高效、費(fèi)用低，實(shí)現(xiàn)了對(duì)水牛卵泡液中多肽組的高效制備和質(zhì)譜檢測(cè)，其檢測(cè)結(jié)果可用于分析成熟卵泡液和未成熟卵泡液中多肽組組分鑒定和差異分析，發(fā)明人據(jù)此發(fā)現(xiàn)了一批與卵母細(xì)胞成熟微環(huán)境卵泡液的生物標(biāo)志物。
【專利說(shuō)明】水牛卵泡液多肽組的制備和質(zhì)譜分析方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于多肽組學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種水牛卵泡液多肽組的制備和質(zhì)譜分析方法。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，隨著生物學(xué)領(lǐng)域中蛋白質(zhì)組學(xué)研究的深入，研究者們發(fā)現(xiàn)一類由氨基酸組成但又與蛋白質(zhì)不同的物質(zhì)，這類物質(zhì)具有蛋白質(zhì)特性，被稱為多肽。在分類上，10個(gè)氨基酸以下組成的肽鏈稱為寡肽，10個(gè)氨基酸以上稱為多肽，在科研領(lǐng)域中，分子量小于IOKDa的蛋白質(zhì)被劃分為多肽范疇。多肽是生命信息的體現(xiàn)者，各種生理變化和生化反應(yīng)都有多肽參與。體內(nèi)存在有上萬(wàn)種多肽，幾乎所有的細(xì)胞生命周期都受多肽調(diào)節(jié)，涉及激素、神經(jīng)遞質(zhì)、生殖生理等各個(gè)生命研究領(lǐng)域。多肽組學(xué)是研究體液(血液、腦脊液、卵泡液、尿液等)內(nèi)全部多肽的一門學(xué)科，通過(guò)多肽分離和質(zhì)譜鑒定技術(shù)精確地識(shí)別所有多肽信息，對(duì)于明確其前體蛋白質(zhì)和生物來(lái)源具有重要的意義，多肽指紋圖譜也逐漸被稱為醫(yī)療領(lǐng)域內(nèi)病理診斷指標(biāo)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種水牛卵泡液多肽組的制備和質(zhì)譜分析方法。
[0004]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:水牛卵泡液多肽組的制備方法，包括以下步驟:
[0005](I)水牛卵泡液離心去除細(xì)胞碎片其他雜質(zhì)，取上清液400 μ L，按體積比1:4向上清液中添加無(wú)水乙腈，沉淀并離心去除高豐度蛋白質(zhì)；
[0006](2)將步驟(I)所得沉淀并去除高豐度蛋白質(zhì)后的樣品轉(zhuǎn)移至30000道爾頓超濾管上層，低溫離心，取超濾管下層溶液；
[0007](3)將步驟(2)所得下層溶液轉(zhuǎn)移至10000道爾頓超濾管，低溫離心，取超濾管下層溶液。
[0008]步驟(I)中水牛卵泡液離心采用3000Xg離心15min。
[0009]步驟(I)中添加無(wú)水乙腈后室溫25°C靜置30min，離心去除采用8000Xg離心15min。
[0010]步驟(2)和(3)中低溫離心釆用AUOOOXg離心30min。
[0011]上述水牛卵泡液多肽組的質(zhì)譜分析方法，其特征在于包括以下步驟:
[0012](4)將步驟(3)所得下層溶液真空冷凍濃縮至20微升，用微量碳18反相色譜吸附柱脫鹽處理；
[0013](5)將步驟(4)得到的脫鹽樣品點(diǎn)在基質(zhì)輔助激光解離串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀的384樣品孔靶上，待點(diǎn)靶樣品干燥后，覆蓋0.5微升芥子酸飽和溶液，氮?dú)獯蹈桑?br> [0014](6)在質(zhì)譜中設(shè)置合適的參數(shù)采集多肽組指紋圖譜。
[0015]步驟(6)中質(zhì)譜參數(shù)為加速電壓2kV，使用標(biāo)準(zhǔn)品校正儀器質(zhì)量軸和質(zhì)量精確度小于0.3道爾頓；一級(jí)質(zhì)譜激光強(qiáng)度為4200，完成一級(jí)數(shù)據(jù)采集后，動(dòng)態(tài)選取20個(gè)最強(qiáng)的母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，二級(jí)質(zhì)譜激光強(qiáng)度為4500，碰撞方式為源內(nèi)誘導(dǎo)裂解。
[0016]發(fā)明人針對(duì)水牛卵泡液成分復(fù)雜難分析的問(wèn)題，建立了一種水牛卵泡液多肽組的制備和質(zhì)譜分析方法，先通過(guò)合理濃度的乙腈沉淀水牛卵泡液中的高豐度蛋白質(zhì)，可有效去除高豐度蛋白質(zhì)對(duì)檢測(cè)的干擾，再通過(guò)不同孔徑的超濾管多次過(guò)濾、截留不同分子量的多肽，能有效富集多肽組樣品；脫鹽處理后，用飛行時(shí)間質(zhì)譜儀分析多肽組指紋圖譜，在質(zhì)譜檢測(cè)時(shí)，通過(guò)合適的質(zhì)譜分析條件，能高通量鑒定卵泡液多肽組信息。本發(fā)明精確、高效、費(fèi)用低，實(shí)現(xiàn)了對(duì)水牛卵泡液中多肽組的高效制備和質(zhì)譜檢測(cè)，其檢測(cè)結(jié)果可用于分析成熟卵泡液和未成熟卵泡液中多肽組組分鑒定和差異分析，發(fā)明人據(jù)此發(fā)現(xiàn)了一批與卵母細(xì)胞成熟微環(huán)境卵泡液的生物標(biāo)志物。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0017]圖1是應(yīng)用本發(fā)明獲得的成熟卵泡液和未成熟卵泡液中多肽組表達(dá)模式圖，圖中IMFF:未成熟卵泡液;MFF:成熟卵泡液。
【具體實(shí)施方式】
[0018]以下所用的試劑乙腈、芥子酸、水都是色譜純，購(gòu)自Sigma-Aldrich或Fisher試劑公司；30kDa、IOkDa超濾管購(gòu)自Millipore公司；質(zhì)譜儀中離子化方式是基質(zhì)輔助激光解吸附串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(Matrix-assisted Laser desorption ionization, MALDI),質(zhì)譜為應(yīng)用生物系統(tǒng)公司4800型飛行時(shí)間質(zhì)譜儀。
[0019]實(shí)施例1
[0020]從屠宰場(chǎng)獲取的水牛卵巢，將卵巢上卵泡按直徑分為2個(gè)組:1)未成熟卵泡(直徑〈8_);2)成熟卵泡(直徑>8_)。使用注射器抽取水牛卵巢表面卵泡內(nèi)的卵泡液分別收集，并將不同個(gè)體的卵巢內(nèi)相同組別的樣品混合，用于消除個(gè)體誤差。按以下方法分別進(jìn)行檢測(cè)。
[0021](I)水牛卵泡液離心(3000 X g，15min)去除細(xì)胞碎片其他雜質(zhì)，取上清液400 μ L，棄掉下層細(xì)胞碎片，按體積比1:4向上清液中添加無(wú)水乙腈，室溫25°C靜置30min，使大分子量的蛋白質(zhì)沉淀，沉淀并離心(8000Xg, 15min)去除高豐度蛋白質(zhì)；
[0022](2)取301^&超濾管，用50(^1^ Mill1-Q H2O潤(rùn)洗超濾管2次，將步驟(1)所得沉淀并去除高豐度蛋白質(zhì)后的樣品轉(zhuǎn)移至30kDa超濾管上層，低溫離心(4°C，8000 X g，30min),使大于30kDa的蛋白質(zhì)和多肽被截留在上層，超濾至下層的卵泡液分子量均低于30kDa，取超濾管下層溶液；
[0023](3)取IOkDa超濾管，用500 μ L Mill1-Q H2O潤(rùn)洗超濾管2次，將步驟(2)所得下層溶液轉(zhuǎn)移至IOkDa超濾管,低溫離心(4°C,8000Xg,30min),使大于IOkDa的蛋白質(zhì)和多肽被截留在上層，超濾至下層的卵泡液分子量均低于IOkDa,取超濾管下層溶液，得分子量低于IOkDa的水牛卵泡液的全部多肽。
[0024](4)將步驟(3)所得下層溶液真空冷凍濃縮至20微升，用微量碳18反相色譜吸附柱(C18ZipTip, Millipore公司)脫鹽處理，去除多肽混合液的小分子無(wú)機(jī)鹽；
[0025](5)將步驟(4)得到的脫鹽樣品0.5μ L點(diǎn)在基質(zhì)輔助激光解離串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(MALD1-TOF)的384樣品孔靶上，待點(diǎn)靶樣品干燥后，覆蓋0.5微升芥子酸飽和溶液，氮?dú)獯蹈桑?br> [0026](6)在質(zhì)譜中設(shè)置合適的參數(shù)采集多肽組指紋圖譜:加速電壓2kV，使用標(biāo)準(zhǔn)品校正儀器質(zhì)量軸和質(zhì)量精確度小于0.3道爾頓；一級(jí)質(zhì)譜激光強(qiáng)度為4200，完成一級(jí)數(shù)據(jù)采集后，動(dòng)態(tài)選取20個(gè)最強(qiáng)的母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，二級(jí)質(zhì)譜激光強(qiáng)度為4500，碰撞方式為源內(nèi)誘導(dǎo)裂解(CID)。
[0027]最后，使用MASCOT算法將質(zhì)譜采集得到的原始數(shù)據(jù)用于搜庫(kù)分析，使用數(shù)據(jù)庫(kù)為NCBInr蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)。設(shè)置酶切參數(shù)為無(wú)酶切，修飾類型為氧化修飾和烷基化修飾。
[0028]對(duì)測(cè)得的卵泡液多肽譜圖進(jìn)行數(shù)據(jù)檢測(cè)和比較分析，共鑒定249個(gè)多肽，對(duì)應(yīng)68個(gè)蛋白質(zhì)(表1)，其中在成熟卵泡液中特異表達(dá)的28個(gè)，在未成熟卵泡液中特異表達(dá)的18種，在兩類卵泡液中共同表達(dá)的22種(圖1)。
[0029]表1成熟卵泡液和未成熟卵泡液鑒定蛋白質(zhì)種類表
[0030]
【權(quán)利要求】
1.一種水牛卵泡液多肽組的制備方法，其特征在于包括以下步驟: (1)水牛卵泡液離心去除細(xì)胞碎片其他雜質(zhì)，取上清液400yL，按體積比1:4向上清液中添加無(wú)水乙腈，沉淀并離心去除高豐度蛋白質(zhì)； (2)將步驟(I)所得沉淀并去除高豐度蛋白質(zhì)后的樣品轉(zhuǎn)移至30000道爾頓超濾管上層，低溫離心，取超濾管下層溶液； (3)將步驟(2)所得下層溶液轉(zhuǎn)移至10000道爾頓超濾管，低溫離心，取超濾管下層溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水牛卵泡液多肽組的制備方法，其特征在于:步驟(I)中所述水牛卵泡液離心采用3000 Xg離心15min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水牛卵泡液多肽組的制備方法，其特征在于:步驟(I)中所述添加無(wú)水乙腈后室溫25°C靜置30min，所述離心去除采用8000Xg離心15min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水牛卵泡液多肽組的制備方法，其特征在于:步驟(2)和(3)中低溫離心采用4°C、8000Xg離心30min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述水牛卵泡液多肽組的質(zhì)譜分析方法，其特征在于包括以下步驟: (4)將步驟(3)所得下層溶液真空冷凍濃縮至20微升，用微量碳18反相色譜吸附柱脫鹽處理； (5)將步驟(4)得到的脫鹽樣品點(diǎn)在基質(zhì)輔助激光解離串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀的384樣品孔靶上，待點(diǎn)靶樣品干燥后，覆蓋0.5微升芥子酸飽和溶液，氮?dú)獯蹈桑? (6)在質(zhì)譜中設(shè)置合適的參數(shù)采集多肽組指紋圖譜。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述水牛卵泡液多肽組的質(zhì)譜分析方法，其特征在于:步驟(6)中質(zhì)譜參數(shù)為加速電壓2kV，使用標(biāo)準(zhǔn)品校正儀器質(zhì)量軸和質(zhì)量精確度小于0.3道爾頓；一級(jí)質(zhì)譜激光強(qiáng)度為4200，完成一級(jí)數(shù)據(jù)采集后，動(dòng)態(tài)選取20個(gè)最強(qiáng)的母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，二級(jí)質(zhì)譜激光強(qiáng)度為4500，碰撞方式為源內(nèi)誘導(dǎo)裂解。
【文檔編號(hào)】G01N1/34GK103884569SQ201310595339
【公開(kāi)日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2013年11月21日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月21日
【發(fā)明者】張明, 付強(qiáng), 黃愉淋, 黃德倫 申請(qǐng)人:廣西大學(xué)