一種有機(jī)磷農(nóng)藥快速檢測用生物傳感器及其檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種有機(jī)磷農(nóng)藥快速檢測用生物傳感器及其檢測方法，以飽和甘汞電極為參比電極，鉑片電極為對電極，以固定有酪氨酸酶和1,2-萘醌-4-磺酸鈉底物的玻碳電極上作為工作電極，該工作電極用非導(dǎo)電聚合物將酪氨酸酶和1,2-萘醌-4-磺酸鈉底物一起電化學(xué)聚合固定在玻碳電極上，因此利用本發(fā)明的生物傳感器檢測有機(jī)磷農(nóng)藥更可靠、靈敏、快速。本發(fā)明的生物傳感器制備簡單，可重復(fù)使用，利用率高，適合現(xiàn)場操作，利用這種生物傳感器檢測有機(jī)磷農(nóng)藥，不用每次都配置酶和底物溶液，能在較短的時間內(nèi)篩選出大量的超標(biāo)樣品，縮小定量檢測范圍，是復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)室方法的有效補(bǔ)充。
【專利說明】一種有機(jī)磷農(nóng)藥快速檢測用生物傳感器及其檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明涉及食品以及農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，具體涉及一種有機(jī)磷農(nóng)藥快速檢測用生物傳感器及其檢測方法。
【背景技術(shù)】:
[0002]隨著農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展，農(nóng)副產(chǎn)品的生產(chǎn)越來越依賴于農(nóng)藥、激素和抗生素等外源物質(zhì)。我國農(nóng)藥在糧食、水果、蔬菜、茶葉上的用量居高不下，而這些物質(zhì)的不合理使用必將導(dǎo)致農(nóng)副產(chǎn)品中的農(nóng)藥殘留超標(biāo)，影響消費(fèi)者的食用安全。近年來，由于食品安全引發(fā)的問題使得人類健康受到嚴(yán)重的威脅，例如由于過量使用或不符合規(guī)定的使用農(nóng)藥而導(dǎo)致水果蔬菜等中農(nóng)藥殘留，使人們急性或慢性中毒。目前，我國常用的有機(jī)磷、氨基甲酸酯類農(nóng)藥如馬拉硫磷、甲胺磷、樂果、對硫磷等幾十種高毒農(nóng)藥占總農(nóng)藥用量的70%以上。這些有機(jī)磷、氨基甲酸酯類農(nóng)藥都是通過抑制乙酰膽堿酯酶的活性使組織中乙酰膽堿不能分解而過量蓄積，使一系列以乙酰膽堿為傳導(dǎo)介質(zhì)的神經(jīng)處于過度興奮，最后衰竭而引起輕重不等的中毒。且它們易溶于有機(jī)溶劑，在中性和酸性條件下穩(wěn)定，不易水解，在堿性條件下易水解而失效。因此，對食品中農(nóng)藥殘留量的快速檢測一直是食品安全檢測的重要課題。控制農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留量的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一就是對農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留量及時、準(zhǔn)確的分析檢測，以監(jiān)控農(nóng)藥的合理使用，同時杜絕農(nóng)藥殘留超標(biāo)的產(chǎn)品上市銷售。
[0003]對食品中農(nóng)藥殘留量的檢測，傳統(tǒng)采用GC/MS等農(nóng)藥殘留分析技術(shù)，但這些技術(shù)存在檢測成本高、時間長的弊端，這給食品安全監(jiān)管部門對農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)前、產(chǎn)中、產(chǎn)后的監(jiān)督工作帶來了許多不便，因此大量的快速檢測技術(shù)孕育而生。利用有機(jī)磷農(nóng)藥和氨基甲酸酯類農(nóng)藥對乙酰膽堿酯酶的特異性抑制反應(yīng)而發(fā)展的乙酰膽堿酯酶快速分析方法已廣泛應(yīng)用于痕量和微量有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的殘留檢測，然而，乙酰膽堿酯酶常會被農(nóng)殘物不可逆性抑制，重復(fù)使用時需要對酶進(jìn)行激活，而常常遇到酶不能重新激活的情況，因而該方法實(shí)際應(yīng)用因重復(fù)性和靈敏度問題受到一定的限制。因而各國科學(xué)家都在致力于尋找新的、性能更好的酶代替目前的乙酰膽堿酯酶，已有采用一些新的酶(如酪氨酸酶、維生素C氧化酶、葡萄糖氧化酶、堿性和酸性磷酸酯酶、有機(jī)磷水解酶)制成生物傳感器應(yīng)用到農(nóng)藥殘留快速檢測方面的研究報道，比如曲云鶴等(參見文獻(xiàn):曲云鶴，肖飛，程欲曉，施國躍，金利通.Tyr/Glu/Fe304/Nafion/CNT/GCE酪氨酸酶生物傳感器的制備及應(yīng)用于農(nóng)藥檢測的研究[J].化學(xué)學(xué)報，2010，68 (6):535-539.)公開了一種酪氨酸酶生物傳感器的制備及應(yīng)用于農(nóng)藥檢測，用酪氨酸酶制備的生物傳感器的重復(fù)性好，靈敏度高，可以重復(fù)使用，能滿足痕量有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的殘留檢測的要求。但將酶固定在電極上的生物傳感器，每次檢測時需要配 置底物溶液，不利于現(xiàn)場快速的初篩工作。

【發(fā)明內(nèi)容】
:
[0004]本發(fā)明的目的是提供一種有機(jī)磷農(nóng)藥快速檢測用生物傳感器及其檢測方法。
[0005]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)的:[0006]—種固定有酪氨酸酶和1，2-萘醌-4-磺酸鈉(NQS)底物的玻碳電極的制備方法，該方法包括以下步驟:
[0007]a、將玻碳電極用氧化鋁拋光粉打磨光亮，清洗干凈后晾干；
[0008]b、將新配置的10 U L0.05mol/L的1，2_萘醌_4_磺酸鈉(NQS)溶液滴涂在在步驟a得到的裸玻碳電極表面，自然晾干；
[0009]C、將10 u L20mg/mL的酪氨酸酶和5 u L2.5mg/mL的戍二醒溶液一起滴涂在經(jīng)步驟b處理過的玻碳電極上，在4°C通氮?dú)庀铝栏?，得到?jīng)滴涂處理的玻碳電極；
[0010]d、將非導(dǎo)電聚合物單體溶于0.05mol/L PH=6.5的磷酸緩沖液中得到濃度為0.05mol/L的非導(dǎo)電聚合物單體溶液，通N2除氧，然后將步驟c得到的經(jīng)滴涂處理的玻碳電極泡在0.05mol/L的非導(dǎo)電聚合物單體溶液中經(jīng)電化學(xué)方法聚合得到表面上覆蓋有一層非導(dǎo)電聚合物薄膜的玻碳電極，將制作好的目標(biāo)電極貯存在4°C的磷酸緩沖液中24h以上再使用。
[0011]所述非導(dǎo)電聚合物單體優(yōu)選為間苯二胺，所述非導(dǎo)電聚合物優(yōu)選為聚間苯二胺。
[0012]聚合前非導(dǎo)電聚合物單體溶液通N2除氧可以防止聚合反應(yīng)初期氧氣對自由基陽離子的進(jìn)攻。
[0013]所述電化學(xué)方法聚 合是在0.8V電壓下作用30s。
[0014]本發(fā)明還提供一種有機(jī)磷農(nóng)藥快速檢測用生物傳感器，該傳感器以飽和甘汞電極(SCE)為參比電極，鉬片電極為對電極，以上述固定有酪氨酸酶(Tyr)和底物1，2-萘醌-4-磺酸鈉(NQS)的玻碳電極作為工作電極。
[0015]該工作電極用非導(dǎo)電聚合物將酪氨酸酶(Tyr)和底物(NQS)—起經(jīng)電化學(xué)聚合固定在玻碳電極上。
[0016]所述非導(dǎo)電聚合物優(yōu)選為聚間苯二胺。
[0017]所述有機(jī)磷農(nóng)藥選自滅菌磷、碘硫磷、二嗪磷、甲基氯吡硫磷中的任一種。
[0018]一種有機(jī)磷農(nóng)藥快速檢測方法，該方法將前述有機(jī)磷農(nóng)藥快速檢測用生物傳感器放入PH=6.5的磷酸緩沖液溶液中，利用計時電流法在電化學(xué)工作站上用電流-時間方法掃描，研究酪氨酸酶玻碳電極的電化學(xué)行為，包括以下步驟:
[0019]首先在未加有機(jī)磷農(nóng)藥之前測定空白曲線，是在30mL0.05mol/L的磷酸緩沖液(通0215min)中進(jìn)行掃描，在E=+0.1OV下穩(wěn)定90s ;在￡=-0.15V下作用15s ;在￡=+0.1OV下恢復(fù)60s ；
[0020]空白曲線測定好之后，加入5 U L的配置好的有機(jī)磷農(nóng)藥溶液，孵育Imin后進(jìn)行測定，按上述步驟進(jìn)行，記錄不同濃度有機(jī)磷農(nóng)藥對酪氨酸酶抑制的曲線。
[0021]所述有機(jī)磷農(nóng)藥快速檢測用生物傳感器的作用機(jī)理如下:
[0022]被固定在工作電極上的酪氨酸酶的活性隨著脈沖電流的不同而不同。首先吸附在工作電極電極上的是1，2-萘醌-4-磺酸鈉(NQS)，隨著脈沖電流(+0.10V)加載在工作電極上，在沒有酶的催化作用使1，2-萘醌-4-磺酸鈉(NQS)轉(zhuǎn)化為1，2-萘二酚-4-磺酸鈉(H2NQS) ,H2NQS為酶的有效底物。在脈沖電流(-0.150V)加載在工作電極上時，將H2NQS轉(zhuǎn)化為NQS，這就終止了此酶促反應(yīng)。此時酪氨酸酶也由變位態(tài)酪氨酸酶(met-Tyr)轉(zhuǎn)化為脫氧態(tài)酪氨酸酶(deoxy-Tyr)，在氧氣的作用下脫氧態(tài)酪氨酸酶(deoxy-Tyr)轉(zhuǎn)化為氧化態(tài)的酪氨酸酶(oxy-Tyr) ,H2NQS同時也與氧化態(tài)酪氨酸酶(oxy-Tyr)作用自身氧化成NQS的同時，將酪氨酸酶還原成變位態(tài)(met-Tyr)。這樣就完成了一個循環(huán)，NQS和Tyr都能循環(huán)的使用。具體反應(yīng)的機(jī)理如下:
[0023]NQS2H+2eH2NQS (E=+0.1V)
[0024]H2NQSmet-Tyr [Cu2+4] -2e_NQS+deoxy-Tyr [Cu2+2] +2H+
[0025]02+deoxy-Tyr [Cu2+2] oxy-Tyr [Cu2+4/O2-2]
[0026]所述有機(jī)磷農(nóng)藥選自表I所示的序號為I?5、8?9、11?15、17?26有機(jī)磷農(nóng)藥，優(yōu)選為滅菌磷、碘硫磷、二嗪磷、甲基氯吡硫磷等有機(jī)磷農(nóng)藥。
[0027]本發(fā)明具有如下有益效果:
[0028](I)本發(fā)明利用非導(dǎo)電聚合物自身抑制生長的特點(diǎn)在電化學(xué)聚合時得到的膜的厚度在IO-1OOnm,使得小分子擴(kuò)散障礙小，能夠容易到達(dá)酶分子，也就大大減少了修飾物對底物、酶和農(nóng)藥之間相互作用的影響，而且非導(dǎo)電聚合物比導(dǎo)電聚合物具有更好的選擇滲透性，減少了樣品中一些可能的電化學(xué)干擾；因此利用本發(fā)明的生物傳感器檢測有機(jī)磷農(nóng)藥更可靠、靈敏、快速。
[0029](2)由于有機(jī)磷農(nóng)藥與酪氨酸酶之間屬于可逆性的抑制作用，底物的不同狀態(tài)1，2-萘醌-4-磺酸鈉和1，2-萘二酚-4-磺酸鈉可以通過電流相互轉(zhuǎn)化，因此本發(fā)明制備的生物傳感器可重復(fù)使用，利用率高；且這種傳感器制備簡單，適合現(xiàn)場操作，利用這種生物傳感器檢測有機(jī)磷農(nóng)藥，不用每次都配置酶和底物溶液，能在較短的時間內(nèi)篩選出大量的超標(biāo)樣品，縮小定量檢測范圍，是復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)室方法的有效補(bǔ)充。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0030]圖1是裸玻碳電極的SEM表征圖；
[0031 ]圖2是修飾NQS后的玻碳電極的SEM表征圖；
[0032]圖3是修飾NQS和酪氨酸酶后的玻碳電極的SEM表征圖；
[0033]圖4是聚合膜修飾后的玻碳電極的SEM表征圖；
[0034]圖5是實(shí)施例2得到的生物傳感器檢測滅菌磷的計時電流曲線；
[0035]圖6是實(shí)施例2得到的生物傳感器檢測滅菌磷的抑制劑濃度與抑制率的關(guān)系；
[0036]圖7是實(shí)施例2得到的生物傳感器檢測碘硫磷的計時電流曲線；
[0037]圖8是實(shí)施例2得到的生物傳感器檢測碘硫的抑制劑濃度與抑制率的關(guān)系；
[0038]圖9是實(shí)施例2得到的生物傳感器檢測二嗪磷的計時電流曲線；
[0039]圖10是實(shí)施例2得到的生物傳感器檢測二嗪磷的抑制劑濃度與抑制率的關(guān)系；
[0040]圖11是實(shí)施例2得到的生物傳感器檢測甲基氯吡硫磷的計時電流曲線；
[0041]圖12是實(shí)施例2得到的生物傳感器檢測甲基氯吡硫磷的抑制劑濃度與抑制率的關(guān)系;
[0042]圖13-18分別表示滅菌磷、碘硫磷、甲基氯吡硫磷、甲基吡惡磷、二嗪磷、特丁硫磷對酪氨酸酶催化氧化L-DOPA抑制作用的Lineweaver-Burk曲線；
[0043]其中，圖13中0、1、2分別表示滅菌磷的濃度為0，0.046，0.0933mmol/L ；
[0044]圖14中0、1、2分別表示碘硫磷的濃度為0，0.0581，0.1162mmol/L ；
[0045]圖15中0、1、2分別表示甲基氯吡硫磷的濃度為0，0.0619，0.0928mmol/L ；
[0046]圖16中0、1、2分別表示甲基吡惡磷的濃度為0，0.5815，0.9692mmol/L ；[0047]圖17中0、1、2分別表示二嗪磷的濃度為0，0.0361，0.0676mmol/L ；
[0048]圖18中0、1、2分別表示特丁硫磷的濃度為0，0.1597，0.3194mmol/L ；
[0049]圖19是不同滅菌磷濃度下酪氨酸酶活力和酶量的關(guān)系；
[0050]其中圖中的0、1、2、3分別表示滅菌磷的濃度為0，0.0234，0.0467，0.0933mmol/L ；
[0051]圖20是不同甲基氯吡硫磷濃度下酪氨酸酶活力和酶量的關(guān)系；其中圖中0、1、2、3分別表示甲基氯吡硫磷的濃度為0，0.0712, 0.1068, 0.1424mmol/L。
【具體實(shí)施方式】:
[0052]以下是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。
[0053]實(shí)施例1:一種用聚間苯二胺固定酪氨酸酶(Tyr)和底物(1，2_萘醌_4_磺酸鈉)的玻碳電極的制備方法
[0054]一種用聚間苯二胺固定酪氨酸酶(Tyr)和底物(1，2_萘醌_4_磺酸鈉)的玻碳電極的制備方法如下:
[0055]a、將直徑為2mm的玻碳電極(用做工作電極)依次用粒子直徑為I U m、0.3 ii m和
0.05 um的氧化鋁拋光粉打磨光亮，再依次用蒸餾水，乙醇，蒸餾水超聲波清洗3min，清洗干凈后晾干；
[0056]b、將新配置的10 U L0.05mol/L的1，2_萘醌_4_磺酸鈉溶液滴涂在在步驟a得到的裸玻碳電極表面，自然晾干；
[0057]C、將10 V- L20mg/mL的酪氨酸酶和5 u L2.5mg/mL的戍二醒溶液一起滴涂在經(jīng)步驟b處理過的玻碳電極上，在4°C通氮?dú)庀铝栏?，得到?jīng)滴涂處理的玻碳電極；
[0058]d、將間苯二胺溶于0.05mol/L PH=6.5的磷酸緩沖液中得到濃度為0.05mol/L的間苯二胺溶液，通N215min除去間苯二胺溶液中的氧，然后將步驟c得到的經(jīng)滴涂處理的玻碳電極泡在所述0.05mol/L的間苯二胺溶液中然后在0.8V電壓下作用30s經(jīng)電化學(xué)方法聚合得到表面上覆蓋有一層聚間苯二胺薄膜的玻碳電極，即目標(biāo)電極，將制作好的電極貯存在4°C的磷酸緩沖液中24h以上再使用。
[0059]圖1?4為SEM表征圖，其中圖1是裸玻碳電極的SEM表征圖；圖2是步驟b得到的修飾NQS后的玻碳電極的SEM表征圖；圖3是步驟c得到的修飾NQS和酪氨酸酶后的玻碳電極的SEM表征圖；圖4是步驟d得到的聚合膜修飾后的玻碳電極的SEM表征圖；從圖3中我們可以清楚地看出NQS、Tyr被一層層修飾在玻碳電極上，圖4顯示電聚合的間二苯胺形成了網(wǎng)狀薄膜，有效地將NQS和Tyr包埋在內(nèi)，大量減少了其在溶液中的流失，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中的大量空隙又使農(nóng)藥能進(jìn)入與Tyr作用。
[0060]實(shí)施例2:—種有機(jī)磷農(nóng)藥快速檢測用生物傳感器
[0061]一種有機(jī)磷農(nóng)藥快速檢測用生物傳感器，稱之為GC-NQS-Tyr-1，3-DAB生物傳感器，該傳感器以飽和甘汞電極(SCE)為參比電極，鉬片電極為對電極，以實(shí)施例1制備的用聚間苯二胺固定有酪氨酸酶(Tyr)和底物(1，2_萘醌_4_磺酸鈉)的玻碳電極上作為工作電極，該工作電極用聚間苯二胺這種非導(dǎo)電聚合物將酪氨酸酶(Tyr)和底物(NQS)—起電聚合固定在玻碳電極上。
[0062]實(shí)施例3:—種有機(jī)磷農(nóng)藥快速檢測方法，
[0063]一種有機(jī)磷農(nóng)藥快速檢測方法，該方法將前述有機(jī)磷農(nóng)藥快速檢測用生物傳感器放入PH=6.5磷酸緩沖液中，利用計時電流法在電化學(xué)工作站上用電流-時間方法掃描，研究酪氨酸酶玻碳電極的電化學(xué)行為，包括以下步驟:
[0064]首先在未加有機(jī)磷農(nóng)藥之前測定空白曲線，是在30mL0.05mol/L的磷酸緩沖液(已通0215min)中進(jìn)行掃描，在E=+0.1OV下穩(wěn)定90s (此時，底物1，2-萘醌-4-磺酸鈉(NQS)變成 I, 2-萘二酚-4-磺酸鈉(H2NQS));在 E=-0.15V 下作用 15s (H2NQS 轉(zhuǎn)化為 NQS)；在 E=+0.1OV 下恢復(fù) 60s (NQS 轉(zhuǎn)化為 H2NQS)；
[0065]空白曲線測定好之后，加入5 U L的配置好的有機(jī)磷農(nóng)藥溶液，孵育Imin后進(jìn)行測定，按上述步驟進(jìn)行，記錄不同濃度有機(jī)磷農(nóng)藥對酪氨酸酶抑制的曲線。
[0066]所述有機(jī)磷農(nóng)藥選自表I所示的序號為I?5、8?9、11?15、17?26有機(jī)磷農(nóng)藥，優(yōu)選為滅菌磷、碘硫磷、二嗪磷、甲基氯吡硫磷等有機(jī)磷農(nóng)藥。
[0067]有機(jī)磷農(nóng)藥為滅菌磷時，實(shí)施例2得到的生物傳感器檢測滅菌磷的計時電流曲線如圖5所示，抑制劑濃度與抑制率的關(guān)系如圖6所示。
[0068]有機(jī)磷農(nóng)藥為碘硫磷時，實(shí)施例2得到的生物傳感器檢測滅菌磷的計時電流曲線如圖7所示，抑制劑濃度與抑制率的關(guān)系如圖8所示。
[0069]有機(jī)磷農(nóng)藥為二嗪磷時，實(shí)施例2得到的生物傳感器檢測滅菌磷的計時電流曲線如圖9所示，抑制劑濃度與抑制率的關(guān)系如圖10所示。
[0070]有機(jī)磷農(nóng)藥為甲基氯吡硫磷時，實(shí)施例2得到的生物傳感器檢測滅菌磷的計時電流曲線如圖11所示，抑制劑濃度與抑制率的關(guān)系如圖12所示。
[0071]由圖5、圖7、圖9和圖11看到加入農(nóng)藥越來越多時，響應(yīng)電流變小，說明滅菌磷、
碘硫磷、二嗪磷、甲基氯吡硫磷等有機(jī)磷農(nóng)藥抑制了酪氨酸酶使其催化H2NQS氧化的量減少，且抑制效果很好。
[0072]由圖6、圖8、圖10和圖12可知，該傳感器對滅菌磷、碘硫磷、二嗪磷、甲基氯吡硫磷等有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測線性范圍分別為7?50 ii M、3?20 ii M、5?50 ii M、8?50 ii M。理論上的檢測限可以定義為抑制率為10%時的所對應(yīng)的抑制劑濃度，因此，該傳感器對滅菌磷、碘硫磷、二嗪磷、甲基氯吡硫磷的檢測限分別為10 ii M、3.5 ii M、8 u M、9 u M。
[0073]實(shí)施例4:有機(jī)磷農(nóng)藥對酪氨酸酶抑制活性的測試
[0074]酪氨酸酶抑制率是評價二者之間抑制關(guān)系的重要指標(biāo)。酪氨酸酶催化氧化多巴胺的產(chǎn)物多巴醌在475nm有最大吸收峰，通過紫外-可見分光光度計測試?yán)野彼崦复呋趸喟桶樊a(chǎn)生多巴醌的量表示酪氨酸酶的催化活力。
[0075]具體操作如下:以0.5mg/mL L-DOPA為底物，在ImL0.05mol/L磷酸緩沖液(pH=6.8)的測活體系中，先加0.1mL含不同濃度的待測抑制劑(溶于DMSO中)于梨形管中，然后加0.1mL酪氨酸酶水溶液，用緩沖溶液補(bǔ)齊到0.6mL，再加0.4mL預(yù)先在30°C恒溫水浴保溫的底物溶液，立刻混勻，在30°C恒溫下測定Imin內(nèi)波長為475nm的吸光度值隨時間的增長直線，從直線斜率求得酶活力。酶的終質(zhì)量濃度為33.3mg/L, DMSO終體積分?jǐn)?shù)為1%。
[0076]有機(jī)磷農(nóng)藥對酶的抑制作用是以抑制率對濃度作圖，根據(jù)抑制曲線求得各物質(zhì)的IC50 (抑制率為50%時抑制劑的濃度)，結(jié)果如表I所示。
[0077]表128種有機(jī)磷農(nóng)藥對Tyr抑制作用的IC5tl值
【權(quán)利要求】
1.一種固定有酪氨酸酶和1，2-萘醌-4-磺酸鈉底物的玻碳電極的制備方法，其特征在于該方法包括以下步驟: a、將玻碳電極用氧化鋁拋光粉打磨光亮，清洗干凈后晾干； b、將新配置的10u L0.05mol/L的1，2-萘醌-4-磺酸鈉溶液滴涂在步驟a得到的裸玻碳電極表面，自然晾干； C、將10 ii L20mg/mL的酪氨酸酶和5 u L2.5mg/mL的戊二醛溶液一起滴涂在經(jīng)步驟b處理過的玻碳電極上，在4°C通氮?dú)庀铝栏?，得到?jīng)滴涂處理的玻碳電極； d、將非導(dǎo)電聚合物單體溶于0.05mol/L PH=6.5的磷酸緩沖液中得到濃度為0.05mol/L的非導(dǎo)電聚合物單體溶液，通N2除氧，然后將步驟c得到的經(jīng)滴涂處理的玻碳電極泡在0.05mol/L的非導(dǎo)電聚合物單體溶液中經(jīng)電化學(xué)方法聚合得到表面上覆蓋有一層非導(dǎo)電聚合物薄膜的玻碳電極，將制作好的目標(biāo)電極貯存在4°C的磷酸緩沖液中24h以上再使用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定有酪氨酸酶和1，2-萘醌-4-磺酸鈉底物的玻碳電極的制備方法，其特征在于，所述非導(dǎo)電聚合物單體為間苯二胺，所述非導(dǎo)電聚合物為聚間苯二胺。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的固定有酪氨酸酶和1，2-萘醌-4-磺酸鈉底物的玻碳電極的制備方法，其特征在于，所述電化學(xué)方法聚合是在0.8V電壓下作用30s。
4.一種有機(jī)磷農(nóng)藥快速檢測用生物傳感器，其特征在于，該傳感器以飽和甘汞電極為參比電極，鉬片電極為對電極，以權(quán)利要求1或2或3得到的固定有酪氨酸酶和1，2-萘醌-4-磺酸鈉底物的玻碳電極上作為工作電極。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的有機(jī)磷農(nóng)藥快速檢測用生物傳感器，其特征在于，所述有機(jī)磷農(nóng)藥選自滅菌磷、碘硫磷、二嗪磷、甲基氯吡硫磷中的任一種。
6.一種有機(jī)磷農(nóng)藥快速檢測方法，其特征在于該方法將權(quán)利要求4或5所述有機(jī)磷農(nóng)藥快速檢測用生物傳感器放入PH=6.5的磷酸緩沖液中，利用計時電流法在電化學(xué)工作站上用電流-時間方法掃描，研究酪氨酸酶玻碳電極的電化學(xué)行為，包括以下步驟:首先在未加有機(jī)磷農(nóng)藥之前測定空白曲線；空白曲線測定好之后，加入配置好的有機(jī)磷農(nóng)藥溶液，孵育Imin后進(jìn)行測定，記錄不同濃度有機(jī)磷農(nóng)藥對酪氨酸酶抑制的曲線。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的有機(jī)磷農(nóng)藥快速檢測方法，其特征在于所述在未加有機(jī)磷農(nóng)藥之前測定空白曲線是在30mL0.05mol/L的磷酸緩沖液中通0215min后進(jìn)行掃描，在E=+0.1OV 下穩(wěn)定 90s ;在 E=-0.15V 下作用 15s ;在 E=+0.1OV 下恢復(fù) 60s。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的有機(jī)磷農(nóng)藥快速檢測方法，其特征在于所述有機(jī)磷農(nóng)藥選自滅菌磷、碘硫磷、二嗪磷、甲基氯吡硫磷中的任一種。
【文檔編號】G01N27/48GK103675057SQ201310628678
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年11月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月29日
【發(fā)明者】潘文龍, 柳亞玲, 陳泳, 杜志云, 李正全, 朱黎明, 韋文蔚, 葉汝漢, 仇鎮(zhèn)武, 林晨, 尹沖 申請人:中國廣州分析測試中心