一種用于快速生化分析的集成式的微流控電化學(xué)生物傳感系統(tǒng)及其使用方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種用于快速生化分析的集成式的微流控電化學(xué)生物傳感系統(tǒng)及其使用方法，該系統(tǒng)包括：用于依次運(yùn)輸先導(dǎo)洗脫液，樣品溶液，樣品洗脫液，信號(hào)探針溶液，信號(hào)探針洗脫液以及電化學(xué)檢測(cè)緩沖溶液的連續(xù)進(jìn)樣單元；由一個(gè)或多個(gè)微通道網(wǎng)絡(luò)組成的微流控芯片，所述微流控芯片覆蓋在電極陣列上形成一個(gè)通道系統(tǒng)，所述電極陣列的表面上固定有與所述樣品溶液相互作用的捕獲探針，所述通道系統(tǒng)與所述連續(xù)進(jìn)樣單元連接；以及為所述連續(xù)進(jìn)樣單元提供動(dòng)力的動(dòng)力系統(tǒng)。本發(fā)明創(chuàng)造性地將平面電極陣列，微流控芯片技術(shù)以及連續(xù)進(jìn)樣單元三種技術(shù)結(jié)合在一起，提供了一種體積小、成本低、集成式的微流控電化學(xué)生物傳感系統(tǒng)，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】—種用于快速生化分析的集成式的微流控電化學(xué)生物傳感系統(tǒng)及其使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微流控電化學(xué)生物傳感系統(tǒng)領(lǐng)域，更具體地涉及一種用于快速生化分析的集成式的微流控電化學(xué)生物傳感系統(tǒng)及其使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002]電化學(xué)生物傳感器就是利用生物化學(xué)反應(yīng)所特有的專一性，選擇性地識(shí)別特定的待測(cè)物質(zhì)，并將其生化反應(yīng)轉(zhuǎn)換成電信號(hào)輸出的一種裝置。電化學(xué)檢測(cè)方法本身具有一些獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，包括:檢測(cè)快速、靈敏度高、選擇性高，儀器簡(jiǎn)便，易于微型化、集成化、且能耗低，適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等。但傳統(tǒng)的碳電極或金電極等三電極系統(tǒng)不僅分析通量低，成本也較高，難以滿足現(xiàn)階段的高通量和低成本檢測(cè)的要求。近來(lái)印刷技術(shù)、光刻技術(shù)的快速發(fā)展極大的促進(jìn)了高通量和一次性電極的開(kāi)發(fā)，但長(zhǎng)時(shí)間的樣品孵育和耗時(shí)、繁瑣的清洗步驟限制了這類(lèi)電化學(xué)生物傳感器進(jìn)一步的應(yīng)用。針對(duì)以上問(wèn)題，微流控芯片技術(shù)可予以有效解決。
[0003]微流控芯片分析是以分析化學(xué)和生物化學(xué)為基礎(chǔ)，以微機(jī)電加工技術(shù)為依托，以微通道網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)為特征，把試樣的采集、預(yù)處理、分離、反應(yīng)和檢測(cè)等部分集成在幾個(gè)平方厘米的范圍內(nèi)，從而快速、高效的完成樣品的處理和檢測(cè)。因微通道的深、寬均在微米級(jí)，故可有效的將待檢測(cè)的目標(biāo)物和傳感界面固定的捕獲探針限制在微米尺度范圍內(nèi)相互作用，大大提高了分子間的識(shí)別能力。
[0004]電極表面的快速分子識(shí)別是實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)高效電化學(xué)生物傳感的基礎(chǔ)。Soh等 A (Swensen, J.S.; Xiao, Y.; Ferguson, B.S.; Lubin, A.A.; Lai, R.Y.; Heeger, A.J.;Plaxco,K.W.;Soh，H.T.，Continuous, Rea1-Time Monitoring of Cocaine inUndiluted Blood Serum via a Microfluidic，Electrochemical Aptamer-BasedSensor.JACSj 2009，131，4262-4266)通過(guò)光刻技術(shù)制備了平面金電極，構(gòu)建微流控E-DNA傳感器。但光刻技術(shù)制備電極成本高，難以批量生產(chǎn)。另外，Rusling等人(Chikkaveeraiah, B.V.;Manij V.;Patel, V.;Gutkind, J.S.;Rusling, J.F., Microfluidicelectrochemical immunoarray for ultrasensitive detection of two cancerbiomarker proteins in serum.Biosens.Bioelectron., 2011, 26, 4477-4483)利用印刷電極陣列與微通道結(jié)構(gòu)在機(jī)械螺絲和有機(jī)玻璃夾具的固定下完成了芯片傳感器的可逆封合，雖然實(shí)現(xiàn)了超靈敏的標(biāo)志物檢測(cè)，但每次樣品測(cè)試均要重新組裝和拆卸傳感器件，并重復(fù)沿微通道插入對(duì)電極和參比電極，該工作量大，繁瑣。雖然有報(bào)道毛細(xì)作用力驅(qū)動(dòng)的單電極式微流控電化學(xué)傳感器，但該作用力無(wú)法一次完成多種溶液的輸送，也很難進(jìn)行多兀檢測(cè)(Lilleho j，P.B.; Wei, F.;Ho，C._M.，A self-pumping lab-on-a-chipfor rapid detection of botulinum toxin.Lab Chip,2010，10，2265-2270)。如何實(shí)現(xiàn)高效的分子識(shí)別和快速的完成多種溶液的傳遞依然是一個(gè)嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。近來(lái)，Sia等(Chin，C.D.; Laksanasopin, T.; Cheung, Y.K.; Steinmiller, D.; Linder, V.; Parsa,H.; Wang, J.; Moore, H.; Rouse, R.; Umviligihozo, G.; Karita, E.;Mwambarangwe, L.; Braunstein, S.L.; van de Wi jgert, J.; Sahabo, R.; Justman, J.E.; El-Sadrj W.; Siaj S.K.，Microfluidics—based diagnostics of infectious diseases in the developingworld.Nat.Med.，2011，17，1015-1019)通過(guò)引入氣體間隔的溶液區(qū)帶和微流控芯片完成了傳染性疾病的快速檢測(cè)，但該方法主要通過(guò)銀增強(qiáng)的信號(hào)來(lái)定性的分析了疾病情況，而臨床及現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)更多的需要定量的分析疾病標(biāo)志物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種用于快速生化分析的集成式的微流控電化學(xué)生物傳感系統(tǒng)及其使用方法，從而解決現(xiàn)有技術(shù)不能快速地完成多種溶液的傳遞，微流控芯片的微通道網(wǎng)絡(luò)層和電極陣列層需要借助輔助設(shè)備固定，并且無(wú)法實(shí)現(xiàn)定量分析疾病標(biāo)記物的缺陷，以及現(xiàn)有技術(shù)的電化學(xué)生物傳感系統(tǒng)僅限于光刻技術(shù)制備的平面電極陣列，造成成本較高的缺陷。
[0006]為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0007]提供一種用于快速生化分析的集成式的微流控電化學(xué)生物傳感系統(tǒng)，包括:用于依次運(yùn)輸先導(dǎo)洗脫液，樣品溶液，樣品洗脫液，信號(hào)探針溶液，信號(hào)探針洗脫液以及電化學(xué)檢測(cè)緩沖溶液的連續(xù)進(jìn)樣單元；由一個(gè)或多個(gè)微通道網(wǎng)絡(luò)組成的微流控芯片，所述微流控芯片覆蓋在電極陣列上形成一個(gè)通道系統(tǒng)，所述電極陣列的表面上固定有與所述樣品溶液相互作用的捕獲探針，所述通道系統(tǒng)與所述連續(xù)進(jìn)樣單元連接；以及為所述連續(xù)進(jìn)樣單元提供動(dòng)力的動(dòng)力系統(tǒng)。
[0008]其中，所述連續(xù)進(jìn)樣單元在動(dòng)力系統(tǒng)的作用下，將先導(dǎo)洗脫液，樣品溶液，樣品洗脫液，信號(hào)探針溶液，信號(hào)探針洗脫液以及電化學(xué)檢測(cè)緩沖溶液依次連續(xù)地通入所述微流控芯片的微通道網(wǎng)絡(luò)，并與固定在所述電極陣列表面的捕獲探針相互作用，產(chǎn)生可供電化學(xué)設(shè)備檢測(cè)的信號(hào)，一次性讀出不同捕獲探針修飾的電極陣列表面的電化學(xué)信號(hào)。
[0009]所述微流控芯片與電極陣列通過(guò)等離子體清洗以及加熱鍵合處理后形成無(wú)漏液的可逆或不可逆所述通道系統(tǒng)。
[0010]所述加熱鍵合處理的條件是37°C下恒溫30min以上。
[0011]所述電極陣列是由絲網(wǎng)印刷技術(shù)制備的碳電極陣列或金電極陣列，或者是在碳電極表面直接電化學(xué)沉積納米金屬顆粒制備的電極陣列或由光刻技術(shù)制備的平面電極陣列。
[0012]所述電極陣列表面固定的捕獲探針包括抗體、抗原、核酸或核酸適配體。
[0013]所述連續(xù)進(jìn)樣單元由具有貫穿通道的小管形成，所述先導(dǎo)洗脫液，樣品溶液，樣品洗脫液，信號(hào)探針溶液，信號(hào)探針洗脫液和電化學(xué)檢測(cè)緩沖溶液彼此之間通過(guò)空氣泡間隔依次通過(guò)所述貫穿通道通入所述微流控芯片的微通道網(wǎng)絡(luò)。
[0014]所述動(dòng)力系統(tǒng)由連接在微流控芯片的下游的注射泵或注射器形成，提供作為流體驅(qū)動(dòng)力的真空負(fù)壓，以實(shí)現(xiàn)連續(xù)進(jìn)樣單元內(nèi)不同功能溶液的自動(dòng)傳送。
[0015]還提供一種用于快速生化分析的集成式的微流控電化學(xué)生物傳感系統(tǒng)的使用方法，包括:提供如上所述的微流控電化學(xué)生物傳感系統(tǒng)；將動(dòng)力系統(tǒng)連接在所述微流控芯片的下游，通過(guò)所述連續(xù)進(jìn)樣單元將先導(dǎo)洗脫液，樣品溶液，樣品洗脫液，信號(hào)探針溶液，信號(hào)探針洗脫液和電化學(xué)檢測(cè)緩沖溶液依次連續(xù)地通入所述微流控芯片的微通道網(wǎng)絡(luò)，并與固定在所述電極陣列表面的捕獲探針相互作用，實(shí)現(xiàn)連續(xù)的捕獲和清洗，快速形成供檢測(cè)的電化學(xué)信號(hào)，通過(guò)電化學(xué)工作站一次性讀出不同捕獲探針修飾的電極陣列表面的電化學(xué)信號(hào)。
[0016]所述先導(dǎo)洗脫液，樣品溶液，樣品洗脫液，信號(hào)探針溶液，信號(hào)探針洗脫液和電化學(xué)檢測(cè)緩沖溶液之間依次由長(zhǎng)度為0.5cm以上的空氣泡間隔開(kāi)，防止交叉污染。
[0017]所述動(dòng)力系統(tǒng)由連接在微流控芯片的下游的注射泵或注射器形成，所述注射泵或注射器通過(guò)一段形變能力強(qiáng)的橡膠小管與所述微流控芯片的出口端連接形成真空負(fù)壓系統(tǒng)。
[0018]本發(fā)明創(chuàng)造性地將平面電極陣列，微流控芯片技術(shù)以及連續(xù)進(jìn)樣單元三種技術(shù)結(jié)合在一起形成了一種可同時(shí)檢測(cè)多種疾病標(biāo)志物的微尺度電化學(xué)傳感方法。電化學(xué)分析和微流控芯片實(shí)際上是屬于兩個(gè)不同的研究領(lǐng)域。電化學(xué)分析領(lǐng)域多強(qiáng)調(diào)電極界面的設(shè)計(jì)和調(diào)控，在樣品的操縱、連續(xù)進(jìn)樣或連續(xù)清洗等方面研究不多。而微流控領(lǐng)域則強(qiáng)調(diào)流體的可控操縱和芯片微通道的設(shè)計(jì)以匹配或滿足相應(yīng)的檢測(cè)手段。盡管集成電化學(xué)檢測(cè)的微流控芯片早有報(bào)道，但多集中在玻璃或硅基底的光刻平面微電極的基礎(chǔ)上，主要原因是這種光刻平面微電極能夠與芯片微通道相匹配，且易于鍵合。但是這種光刻技術(shù)制備電極成本高，難以批量生產(chǎn)。此外，這類(lèi)集成電化學(xué)檢測(cè)的微流控芯片主要靠毛細(xì)作用力或微泵提供動(dòng)力進(jìn)行多次繁瑣的進(jìn)樣和清洗程序。而本申請(qǐng)中的電極陣列則不僅適用已經(jīng)成功商業(yè)化的一類(lèi)宏觀的如塑料基底的印刷電極而言，而且還可擴(kuò)展到光刻技術(shù)制備的平面宏觀電極。我們成功將市場(chǎng)無(wú)窮大的印刷電極同新的微流控技術(shù)結(jié)合并集成一次性連續(xù)進(jìn)樣單元，具有明顯的創(chuàng)新和應(yīng)用前景。
[0019]本發(fā)明相對(duì)現(xiàn)有技術(shù)具有的有益效果如下:
[0020]I)可快速并一次性完成多種溶液的運(yùn)輸，使其依次流經(jīng)微尺度傳感界面，提高分子識(shí)別效率，操作簡(jiǎn)單，速度快，大大簡(jiǎn)化了電化學(xué)生物傳感器的操作步驟；
[0021]2)微流控芯片的微通道網(wǎng)絡(luò)和電極陣列層之間通過(guò)處理實(shí)現(xiàn)了無(wú)漏液的封接，無(wú)需任何輔助設(shè)備固定，降低了器件制備難度，提高了器件制備的重復(fù)性和穩(wěn)定性；
[0022]3)可實(shí)現(xiàn)多種不同目標(biāo)物的不同濃度的定量檢測(cè)，試劑消耗量少，分析速度快；
[0023]4)提供了一種體積小、成本低、集成式的微流控電化學(xué)生物傳感系統(tǒng)，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0024]圖1是根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例的微流控電化學(xué)生物傳感系統(tǒng)的立體結(jié)構(gòu)示意圖；
[0025]圖2是如圖1所示的微流控電化學(xué)生物傳感系統(tǒng)的剖面圖；
[0026]圖3是基于單個(gè)三電極體系的微流控電化學(xué)生物傳感器的形成的流程示意圖；
[0027]圖4是基于4個(gè)三電極體系的微流控電化學(xué)生物傳感器的形成的流程示意圖；
[0028]圖5是基于印刷電極陣列和聚二甲基硅氧烷微通道的微流控電化學(xué)生物傳感器的表面處理和鍵合過(guò)程示意圖；
[0029]圖6A和圖6B是單個(gè)三電極體系和微流控芯片的微通道網(wǎng)絡(luò)鍵合后檢測(cè)500ng/mLPSA的電流結(jié)果比較圖；[0030]圖7是不同濃度的人類(lèi)流感病毒HlNl裂解疫苗在單個(gè)三電極體系的微流控電化學(xué)生物傳感器上檢測(cè)的結(jié)果圖；
[0031]圖8是不同濃度的人類(lèi)前列腺癌標(biāo)志物PSA在如圖1所示的微流控電化學(xué)生物傳感系統(tǒng)的檢測(cè)的結(jié)果圖；
[0032]圖9是不同濃度的人類(lèi)肝癌標(biāo)志物AFP在如圖1所示的微流控電化學(xué)生物傳感系統(tǒng)的檢測(cè)的結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0033]以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而非用于限制本發(fā)明的范圍。
[0034]如圖1-圖2所示，是根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例的微流控電化學(xué)生物傳感系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括:用于運(yùn)輸不同功能溶液的連續(xù)進(jìn)樣單元1，由四個(gè)微通道網(wǎng)絡(luò)21組成的微流控芯片2，通過(guò)所述微流控芯片2覆蓋的電極陣列3，以及連接在微流控芯片2下游的動(dòng)力系統(tǒng)4。
[0035]其中，連續(xù)進(jìn)樣單元I由透明的塑料小管11形成，提供一貫穿通道供各種功能溶液依次通入微流控芯片2的微通道網(wǎng)絡(luò)21，各種功能溶液通過(guò)空氣泡13彼此間隔形成不同的功能溶液區(qū)帶12。優(yōu)選地，空氣泡13的長(zhǎng)度需保持在0.5厘米以上，以防止進(jìn)樣和上樣過(guò)程中因壓力的快速變化導(dǎo)致空氣泡13被擠壓或溶液的不連續(xù)分散以至前后溶液混合，形成交叉污染。
[0036]參見(jiàn)圖3-圖4，優(yōu)選地，微流控芯片2由四個(gè)蛇形微通道網(wǎng)絡(luò)21制成，電極陣列3由四個(gè)三電極體系的印刷電極組成，具體為工作電極31，對(duì)電極32，參比電極33，以及電極印刷銀導(dǎo)線34(參見(jiàn)圖1)。圖5示出了該微流控芯片2與電極陣列3的表面處理和鍵合過(guò)程。具體為:首先，同時(shí)對(duì)含有微通道網(wǎng)絡(luò)21的微流控芯片2 (由聚二甲基硅氧烷(PDMS)制成)和被PDMS框選擇性保護(hù)的電極陣列3進(jìn)行等離子體處理；之后，移除保護(hù)電極陣列的表面抗體活性的PDMS框，使PDMS通道層和電極陣列層對(duì)齊加熱鍵合。由于經(jīng)等離子體處理后的芯片表面和電極陣列表面均產(chǎn)生了大量的含氧官能團(tuán)，界面的含氧基團(tuán)可以發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)而形成不可逆的芯片鍵合，使得所述微流控芯片與電極陣列形成無(wú)漏液的可逆或不可逆系統(tǒng)，而無(wú)需機(jī)械螺絲和上下夾板任何外界的作用力。其中，所述加熱鍵合處理的條件優(yōu)選是37°C下恒溫30min以上。
[0037]動(dòng)力系統(tǒng)4作為連續(xù)進(jìn)樣單元I的動(dòng)力源連接于微流控芯片2的下游，本優(yōu)選實(shí)施例中選用一次性的注射器41，在使用時(shí)通過(guò)將注射器41的推柄拉至一定高度后用小木條或金屬棒固定，從而在整個(gè)流道中形成真空負(fù)壓，該負(fù)壓作為流體驅(qū)動(dòng)力進(jìn)而實(shí)現(xiàn)連續(xù)進(jìn)樣單元I中各種功能溶液區(qū)帶12的自動(dòng)傳送。為了保證真空負(fù)壓的順利形成，注射器41通過(guò)一段形變能力強(qiáng)且口徑匹配的活塞式橡膠小管42與微流控芯片2的出口端連接。其中，活塞式橡膠小管42設(shè)計(jì)有可調(diào)的閥門(mén)43，從而控制整個(gè)流道的開(kāi)和關(guān)。而注射器41與橡膠小管42，橡膠小管42與微流控芯片2的出口端之間進(jìn)一步通過(guò)合適的小管連接。
[0038]實(shí)施例1
[0039]本實(shí)施例是采用單個(gè)三電極單元和微通道網(wǎng)絡(luò)鍵合前后形成的微流控電化學(xué)生物傳感系統(tǒng)(圖3)用于人類(lèi)前列腺癌標(biāo)志物PSA的檢測(cè)。具體步驟如下:將20 u LTMB溶液(3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽)分別滴加在三電極表面(Normal)和覆蓋有PDMS的微通道內(nèi)(Channel)，然后將電極分別連接到電化學(xué)工作站進(jìn)行循環(huán)伏安檢測(cè)，獲得圖6A的
實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0040]通過(guò)ImL規(guī)格注射器連續(xù)手動(dòng)抽取辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素(avidin-HRP)、水、緩沖液(0.0lM 磷酸鹽，0.14M NaCl, 2.7mM KCl，pH7.2)、生物素標(biāo)記 PSA(biotin-PSA)和500ng/mL PSA溶液區(qū)帶，各溶液區(qū)帶之間間隔有0.5-lcm長(zhǎng)的空氣泡，其中各溶液區(qū)帶體積在1-20 y L ;分別將制備好的微流控芯片、連續(xù)進(jìn)樣單元、動(dòng)力系統(tǒng)連接成整體，注射泵的抽取流速調(diào)節(jié)到10-20 ii L/min,當(dāng)看到連續(xù)進(jìn)樣單元內(nèi)的溶液區(qū)帶開(kāi)始流向微流控芯片時(shí)，暫停抽取，快速調(diào)節(jié)流速到2-5y L/min。在溶液區(qū)帶連續(xù)流通的過(guò)程中，電極界面固定的PSA-Ab (單克隆抗體)依次結(jié)合樣品區(qū)帶中的500ng/mL PSA、10-20 u g/mL生物素標(biāo)記的二抗biotin-PSA,形成夾心結(jié)構(gòu)后與信號(hào)探針溶液區(qū)帶中的avidin-HRP偶聯(lián)。經(jīng)緩沖溶液和水洗脫掉未結(jié)合的探針復(fù)合物后，直接在進(jìn)樣口滴加IOuL TMB溶液，無(wú)動(dòng)力進(jìn)樣，將電極連接到電化學(xué)工作站進(jìn)行安培檢測(cè)，HRP酶催化TMB溶液中的H202循環(huán)放大電化學(xué)信號(hào)，獲得圖6B的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0041]實(shí)施例2
[0042]本實(shí)施例還是采用單個(gè)三電極單元和微通道網(wǎng)絡(luò)鍵合前后形成的微流控電化學(xué)生物傳感系統(tǒng)(圖3)用于人類(lèi)流感病毒HlNl裂解疫苗的檢測(cè)，步驟如下，通過(guò)ImL規(guī)格注射器連續(xù)手動(dòng)抽取H1N1-HRP、水、緩沖液(0.0lM磷酸鹽，0.14M NaCl,2.7mM KCl，pH7.2)、和一定濃度的HlNl裂解疫苗溶液區(qū)帶，各溶液區(qū)帶之間間隔有0.5-lcm長(zhǎng)的空氣泡，其中各溶液區(qū)帶體積在1-20 y L ;分別將制備好的微流控芯片、連續(xù)進(jìn)樣單元、動(dòng)力系統(tǒng)連接成整體，注射泵的抽取流速調(diào)節(jié)到10-20 ii L/min,當(dāng)看到傳送單元內(nèi)的溶液區(qū)帶開(kāi)始流向微流控芯片時(shí)，暫停抽取，快速調(diào)節(jié)流速到2-5 ii L/min。在溶液區(qū)帶連續(xù)流通的過(guò)程中，電極界面固定的H1N1-77 (H1N1抗體)依次結(jié)合樣品區(qū)帶中的0-500ng/mL HlNlUO u g/mLHRP標(biāo)記的二抗HRP-HlNl (探針溶液)，形成夾心結(jié)構(gòu)。經(jīng)緩沖溶液和水洗脫掉未結(jié)合的探針復(fù)合物后，直接在進(jìn)樣口滴加10 y L TMB溶液，無(wú)動(dòng)力進(jìn)樣，將電極連接到電化學(xué)工作站進(jìn)行安培檢測(cè)，HRP酶催化TMB溶液中的H202循環(huán)放大電化學(xué)信號(hào)，獲得圖7的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0043]實(shí)施例3
[0044]本實(shí)施例采用四個(gè)三電極單元和微通道網(wǎng)絡(luò)鍵合形成的微流控電化學(xué)生物傳感系統(tǒng)(圖4)用于人類(lèi)前列腺癌標(biāo)志物PSA和人類(lèi)肝癌標(biāo)志物AFP的同時(shí)檢測(cè)，步驟如下，通過(guò)ImL規(guī)格注射器連續(xù)手動(dòng)抽取avidin-HRP、水、緩沖液(0.0lM磷酸鹽，0.14M NaCl,
2.7mM KCl, pH7.2)、biotin-PSA 與 biotin-AFP 的混合物和一定濃度的 PSA 和 AFP 抗原混合物溶液區(qū)帶，區(qū)帶之間間隔有0.5-lcm長(zhǎng)的空氣泡，其中各溶液區(qū)帶體積在1-20 ;分別將制備好的微流控芯片、連續(xù)進(jìn)樣單元、動(dòng)力系統(tǒng)連接成整體，注射泵的抽取流速調(diào)節(jié)到10-20 u L/min,當(dāng)看到傳送單元內(nèi)的溶液區(qū)帶開(kāi)始流向微流控芯片時(shí),暫停抽取,快速調(diào)節(jié)流速到2-5 u L/min。在溶液區(qū)帶連續(xù)流通的過(guò)程中，電極界面固定的PSA-Ab和AFP-Ab(單克隆抗體)依次結(jié)合樣品區(qū)帶中的0-100ng/mLPSA和0_500ng/mLAFP、10-20 u g/mL生物素標(biāo)記的二抗biotin-PSA和12.5-25 u g/mL生物素標(biāo)記的二抗biotin-AFP,形成夾心結(jié)構(gòu)后與信號(hào)探針溶液區(qū)帶中的avidin-HRP偶聯(lián)。經(jīng)緩沖溶液和水洗脫掉未結(jié)合的探針復(fù)合物后，直接在進(jìn)樣口滴加20 ii L TMB溶液，無(wú)動(dòng)力進(jìn)樣，將電極連接到電化學(xué)工作站進(jìn)行安培檢測(cè)，HRP酶催化TMB溶液中的H202循環(huán)放大電化學(xué)信號(hào)，獲得圖8圖9的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0045]以上所述的，僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并非用以限定本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的上述實(shí)施例還可以做出各種變化。即凡是依據(jù)本發(fā)明申請(qǐng)的權(quán)利要求書(shū)及說(shuō)明書(shū)內(nèi)容所作的簡(jiǎn)單、等效變化與修飾，皆落入本發(fā)明專利的權(quán)利要求保護(hù)范圍。本發(fā)明未詳盡描述的均為常規(guī)技術(shù)內(nèi)容。
【權(quán)利要求】
1.一種用于快速生化分析的集成式的微流控電化學(xué)生物傳感系統(tǒng)，其特征在于，包括: 用于依次運(yùn)輸先導(dǎo)洗脫液，樣品溶液，樣品洗脫液，信號(hào)探針溶液，信號(hào)探針洗脫液以及電化學(xué)檢測(cè)緩沖溶液的連續(xù)進(jìn)樣單元； 由一個(gè)或多個(gè)微通道網(wǎng)絡(luò)組成的微流控芯片，所述微流控芯片覆蓋在電極陣列上形成一個(gè)通道系統(tǒng)，所述電極陣列的表面上固定有與所述樣品溶液相互作用的捕獲探針，所述通道系統(tǒng)與所述連續(xù)進(jìn)樣單元連接；以及 為所述連續(xù)進(jìn)樣單元提供動(dòng)力的動(dòng)力系統(tǒng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流控電化學(xué)生物傳感系統(tǒng)，其特征在于，所述微流控芯片與電極陣列通過(guò)等離子體清洗以及加熱鍵合處理后形成無(wú)漏液的可逆或不可逆的所述通道系統(tǒng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的微流控電化學(xué)生物傳感系統(tǒng)，其特征在于，所述加熱鍵合處理的條件是37°C下恒溫30min以上。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流控電化學(xué)生物傳感系統(tǒng)，其特征在于，所述電極陣列是由絲網(wǎng)印刷技術(shù)制備的碳電極陣列或金電極陣列，或者是在碳電極表面直接電化學(xué)沉積納米金屬顆粒制備的電極陣列或由光刻技術(shù)制備的平面電極陣列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流控電化學(xué)生物傳感系統(tǒng)，其特征在于，所述電極陣列表面固定的捕獲探針包括抗體、抗原、核酸或核酸適配體。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流控電化學(xué)生物傳感系統(tǒng)，其特征在于，所述連續(xù)進(jìn)樣單元由具有貫穿通道的小管形成，所述先導(dǎo)洗脫液，樣品溶液，樣品洗脫液，信號(hào)探針溶液，信號(hào)探針洗脫液和電化學(xué)檢測(cè)緩沖溶液彼此之間通過(guò)空氣泡間隔依次通過(guò)所述貫穿通道通入所述微流控芯片的微通道網(wǎng)絡(luò)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流控電化學(xué)生物傳感系統(tǒng)，其特征在于，所述動(dòng)力系統(tǒng)由連接在微流控芯片的下游的注射泵或注射器形成，提供作為流體驅(qū)動(dòng)力的真空負(fù)壓。
8.一種用于快速生化分析的集成式的微流控電化學(xué)生物傳感系統(tǒng)的使用方法，其特征在于，包括: 提供如權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)所述的微流控電化學(xué)生物傳感系統(tǒng)； 將動(dòng)力系統(tǒng)連接在所述微流控芯片的下游，通過(guò)所述連續(xù)進(jìn)樣單元將先導(dǎo)洗脫液，樣品溶液，樣品洗脫液，信號(hào)探針溶液，信號(hào)探針洗脫液和電化學(xué)檢測(cè)緩沖溶液依次連續(xù)地通入所述微流控芯片的微通道網(wǎng)絡(luò)，并與固定在所述電極陣列表面的捕獲探針相互作用，實(shí)現(xiàn)連續(xù)的捕獲和清洗，快速形成供檢測(cè)的電化學(xué)信號(hào)，通過(guò)電化學(xué)工作站一次性讀出不同捕獲探針修飾的電極陣列表面的電化學(xué)信號(hào)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的使用方法，其特征在于，所述先導(dǎo)洗脫液，樣品溶液，樣品洗脫液，信號(hào)探針溶液，信號(hào)探針洗脫液和電化學(xué)檢測(cè)緩沖溶液之間依次由長(zhǎng)度為0.5cm以上的空氣泡間隔開(kāi)，防止交叉污染。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的使用方法，其特征在于，所述動(dòng)力系統(tǒng)由連接在微流控芯片的下游的注射泵或注射器形成，所述注射泵或注射器通過(guò)一段形變能力強(qiáng)的橡膠小管與所述微流控芯片的出口端連接形成真空負(fù)壓系統(tǒng)。
【文檔編號(hào)】G01N27/48GK103616426SQ201310638228
【公開(kāi)日】2014年3月5日 申請(qǐng)日期:2013年12月2日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月2日
【發(fā)明者】樊春海, 楊帆, 左小磊, 黃慶 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所