氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)發(fā)酵液中有機(jī)酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)發(fā)酵液中有機(jī)酸的方法，屬于生物化學(xué)檢驗(yàn)測(cè)定【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明檢測(cè)方法步驟包括：（1）取發(fā)酵液，高速離心，分別收集細(xì)胞和細(xì)胞外液；（2）發(fā)酵液樣品制備：取步驟1）得到的上清液加入乙腈除去蛋白，渦旋振蕩，再離心收集上清液Ⅲ，加入內(nèi)標(biāo)物核糖醇溶液，室溫真空烘干，得到細(xì)胞外液樣品Ⅱ；（3）樣品衍生，加入糖衍生劑、氨基酸衍生劑；（4）氣相色譜-質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)采集。本發(fā)明具有樣品處理簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)有機(jī)酸時(shí)間短，靈敏度高，檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性高，可實(shí)現(xiàn)多個(gè)樣品制備等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)發(fā)酵液中有機(jī)酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物化學(xué)檢驗(yàn)測(cè)定【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及一種氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)發(fā)酵液中中有機(jī)酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]在利用氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)有機(jī)酸代謝物方面，目前已有相關(guān)技術(shù)報(bào)道，如專利201210046953.2，公布了一種氣相色譜一質(zhì)譜檢測(cè)尿有機(jī)酸的方法，包括如下步驟:(I)對(duì)待檢尿液樣本完成尿酶處理；(2)加入內(nèi)標(biāo)品，采用冷凍乙醇進(jìn)行沉淀蛋白的處理，將樣本吹干；(3)對(duì)上述樣本進(jìn)行甲基硅烷化衍生處理；(4)采用上述1-3的步驟處理標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)酸，得到標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)酸樣本；(5)采用氣相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)酸樣本和待檢尿液樣本進(jìn)行檢測(cè)；(6)以標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)酸樣本的檢測(cè)結(jié)果作為參比曲線，用常規(guī)算法對(duì)待檢尿液樣本的有機(jī)酸進(jìn)行定量。該專利發(fā)明主要應(yīng)用領(lǐng)域?yàn)槟驑訖z測(cè)，且該檢測(cè)方法僅局限于有機(jī)酸代謝物的檢測(cè)。
[0003]對(duì)于微生物胞內(nèi)、胞外代謝物的檢測(cè)研究，可以揭示微生物在發(fā)酵條件下的代謝規(guī)律，尤其是發(fā)酵條件對(duì)于微生物目標(biāo)產(chǎn)物的影響規(guī)律。掌握微生物的代謝規(guī)律可以不僅有利的促進(jìn)目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量提升，而且可確定菌體內(nèi)的代謝通量分布，進(jìn)而利用基因工程手段實(shí)現(xiàn)菌體內(nèi)代謝途徑的優(yōu)化與重構(gòu)，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物高效生物合成。
[0004]目前對(duì)于發(fā)酵液中的代謝物分析檢測(cè)方法局限用于特定某類物質(zhì)，不可實(shí)現(xiàn)多類代謝物同時(shí)檢測(cè)。由于發(fā)酵液中各成分含量復(fù)雜多樣，對(duì)于樣品的處理方法很關(guān)鍵，目前還沒(méi)有相關(guān)發(fā)酵液中、細(xì)胞外代謝物的系統(tǒng)處理檢測(cè)方法，使得開(kāi)發(fā)一種更為靈敏的、廣譜的、通用的發(fā)酵代謝物檢測(cè)方法，鑒定各種譜峰對(duì)映的化合物結(jié)構(gòu)，以及與其它虛擬模型的整合，成為微生物代謝組研究的熱點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)發(fā)酵液中有機(jī)酸的方法，彌補(bǔ)目前在微生物發(fā)酵中對(duì)代謝物系統(tǒng)檢測(cè)方法的空白，克服現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)干擾因素很多、操作繁瑣、測(cè)試成本高、靈敏度低、檢測(cè)范圍窄等缺點(diǎn)。
[0006]本發(fā)明的方案是通過(guò)這樣實(shí)現(xiàn)的:一種氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)發(fā)酵液中有機(jī)酸的方法，檢測(cè)方法步驟包括:
(1)取發(fā)酵液，高速離心，分別收集菌體和上清液I;
(2)發(fā)酵液樣品制備:取6(T350ul步驟I)得到的上清液I，在清液I中加入乙腈除去蛋白，上清液I與乙腈體積比為1:0.5^1.5，渦旋振蕩，再離心收集上清液III，加入內(nèi)標(biāo)物核糖醇溶液，上清液III體積與內(nèi)標(biāo)物核糖醇重量比例為5(T300ul:20 μ g，室溫真空烘干，得到細(xì)胞外液樣品II ；
(3)樣品衍生:在步驟2)得到的樣品II中，分別加入5(Tl50ul糖衍生劑，恒溫放置1.5~4h，再分別加入5(Tl50ul氨基酸衍生劑，恒溫放置過(guò)夜，衍生完畢，離心衍生后的樣品II，收集上清得到待測(cè)胞內(nèi)樣品II;
(4)利用氣相色譜-質(zhì)譜對(duì)步驟3)得到的待測(cè)胞內(nèi)樣品II，進(jìn)行分析和數(shù)據(jù)采集。
[0007]作為本發(fā)明的進(jìn)一步限定，所述菌體其取樣量為用冷甲醇溶解后生物量干重達(dá)
0.2^1.0g/ml ;所述的冷甲醇為經(jīng)過(guò)冷浴槽預(yù)冷至-40°C;所述低溫萃取為_(kāi)40°C至_50°C下萃取2~7h。
[0008]作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述糖衍生劑為0.r0.3mg甲氧胺鹽酸溶于IOml吡啶溶液中配制而得；所述氨基酸衍生劑為5(T200ul三甲基氯硅烷溶于IOml的三氟乙酰胺中。 [0009]作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述氣相色譜-質(zhì)譜其儀器分析條件為:氣相色譜:色譜柱為30 mX0.25 mm的HP-5MS或者DB-5MS毛細(xì)管柱，進(jìn)樣口溫度300°C，檢測(cè)器溫度250°C，柱箱升溫程序平衡時(shí)間3 min — 80°C維持Imin — 2V /min升溫至100°C— 15°C /min升溫至220°C— 30°C /min升溫至300°C— 300°C維持3 min,進(jìn)樣體積I y L ;質(zhì)譜:離子源EI，檢測(cè)器為四級(jí)桿，電離能70 eV，離子源表面溫度280°C。
[0010]作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，該方法應(yīng)用于檢測(cè)酵母菌、乳酸菌、梭菌、霉菌的生物發(fā)酵過(guò)程中的發(fā)酵液中的有機(jī)酸。
[0011]作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，其特征在于，所述有機(jī)酸為琥珀酸、蘋果酸、檸檬酸、丙酮酸、富馬酸。
[0012]本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著進(jìn)步是:(I)該方法可以檢測(cè)發(fā)酵液中中有機(jī)酸類物質(zhì)的檢測(cè)，不需要對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行多次復(fù)雜處理，節(jié)約時(shí)間和簡(jiǎn)化操作步驟，及時(shí)得到發(fā)酵過(guò)程中微生物代謝規(guī)律，分析胞內(nèi)代謝流量。(2)該方法采用冷甲醇萃取發(fā)酵液中代謝物法，其萃取效果優(yōu)良，獲得發(fā)酵液中較多代謝物種類，有利于代謝規(guī)律的分析。(3)樣品分析得到的色譜峰分析效果良好，可對(duì)琥珀酸、蘋果酸、檸檬酸、丙酮酸、富馬酸等有機(jī)酸實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。
【具體實(shí)施方式】
[0013]下面將通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明方法進(jìn)一步的描述，這些描述并不是對(duì)本
【發(fā)明內(nèi)容】
作進(jìn)一步的限定。
[0014]以下實(shí)施例中離心條件為:_4°C下10000 rpm離心10 min。
[0015]以下實(shí)施例中氣相色譜-質(zhì)譜其儀器分析條件為:氣相色譜:色譜柱為30mX0.25 mm的HP-5MS或者DB-5MS毛細(xì)管柱，進(jìn)樣口溫度300°C，檢測(cè)器溫度250°C，柱箱升溫程序平衡時(shí)間3 min — 80°C維持Imin — 2V /min升溫至100°C— 15°C /min升溫至2200C- 30°C /min升溫至300°C— 300°C維持3 min，進(jìn)樣體積I y L ;質(zhì)譜:離子源EI，檢測(cè)器為四級(jí)桿，電離能70 eV，離子源表面溫度280°C。
[0016]以下實(shí)施例皆可實(shí)現(xiàn)對(duì)琥珀酸、蘋果酸、檸檬酸、丙酮酸、富馬酸等有機(jī)酸進(jìn)行檢測(cè)。
[0017]實(shí)施例1
取霉菌發(fā)酵液。
[0018](I)細(xì)胞內(nèi)代謝物樣品制備:取5ml發(fā)酵液，離心得到菌體，用生理鹽水清洗菌體2次，-40°C冷甲醇溶解后生物量干重達(dá)0.2g/ml，超聲破碎至細(xì)胞裂解，得到裂解液，低溫萃取裂解液，低溫條件為:-40°C至-50°C下萃取4h，離心收集150ul萃取后裂解上清液I，加入內(nèi)標(biāo)物核糖醇溶液，裂解上清液I體積與內(nèi)標(biāo)物核糖醇重量比例為150ul:20y g，室溫真空烘干，得到細(xì)胞內(nèi)代謝物樣品I。
[0019](2)細(xì)胞外液樣品制備:取發(fā)酵液，離心得到上清液II，取300ul上清液II，在清液II中加入乙腈除去蛋白，上清液II與乙腈體積比為1: 1.2，渦旋振蕩，再離心收集得上清液III，加入內(nèi)標(biāo)物核糖醇溶液，上清液III體積與內(nèi)標(biāo)物核糖醇重量比例為IOOul:20yg，室溫真空烘干，得到細(xì)胞外液樣品II。
[0020](3)樣品衍生:在步驟I)和步驟2)得到的樣品I和樣品II中，分別加入IOOul糖衍生劑(糖衍生劑為0.1mg甲氧胺鹽酸溶于IOml吡啶溶液中配制而得)，恒溫放置1.5h，再分別加入IOOul氨基酸衍生劑(氨基酸衍生劑為IOOul三甲基氯硅烷溶于IOml的三氟乙酰胺中配制而得)，恒溫放置過(guò)夜，衍生完畢，分別離心衍生后的樣品I和樣品II，對(duì)應(yīng)收集各自上清得到待測(cè)胞內(nèi)樣品I和待測(cè)胞外樣品II。
[0021](4)按照氣相色譜-質(zhì)譜其儀器分析條件，對(duì)待測(cè)胞內(nèi)樣品I和待測(cè)胞外樣品II進(jìn)行分析和數(shù)據(jù)采集。
[0022]實(shí)施例2 取梭菌發(fā)酵液。
[0023](I)細(xì)胞內(nèi)代謝物樣品制備:取5ml發(fā)酵液，離心得到菌體，用生理鹽水清洗菌體3次，-40°C冷甲醇溶解后生物量干重達(dá)1.0g/ml，超聲破碎至細(xì)胞裂解，得到裂解液，低溫萃取裂解液，低溫條件為:-40°C至-50°C下萃取5h，離心收集IOOul萃取后裂解上清液I，力口入內(nèi)標(biāo)物核糖醇溶液，裂解上清液I體積與內(nèi)標(biāo)物核糖醇重量比例為IOOul: 20 μ g，室溫真空烘干，得到細(xì)胞內(nèi)代謝物樣品I。
[0024](2)細(xì)胞外液樣品制備:取發(fā)酵液，離心得到上清液II，取350ul上清液II，在清液II中加入乙腈除去蛋白，上清液II與乙腈體積比為1:0.7，渦旋振蕩，再離心收集得上清液III，加入內(nèi)標(biāo)物核糖醇溶液，上清液III體積與內(nèi)標(biāo)物核糖醇重量比例為200ul:20μ g，室溫真空烘干，得到細(xì)胞外液樣品II。
[0025](3)樣品衍生:在步驟I)和步驟2)得到的樣品I和樣品II中，分別加入50ul糖衍生劑(糖衍生劑為0.3mg甲氧胺鹽酸溶于IOml吡啶溶液中配制而得)，恒溫放置2.0h，再分別加入150ul氨基酸衍生劑(氨基酸衍生劑為150ul三甲基氯硅烷溶于IOml的三氟乙酰胺中配制而得)，恒溫放置過(guò)夜，衍生完畢，分別離心衍生后的樣品I和樣品II，對(duì)應(yīng)收集各自上清得到待測(cè)胞內(nèi)樣品I和待測(cè)胞外樣品II。
[0026](4)按照氣相色譜-質(zhì)譜其儀器分析條件，對(duì)待測(cè)胞內(nèi)樣品I和待測(cè)胞外樣品II進(jìn)行分析和數(shù)據(jù)采集。
[0027]實(shí)施例3 取酵母菌發(fā)酵液。
[0028](I)細(xì)胞內(nèi)代謝物樣品制備:取5ml發(fā)酵液，離心得到菌體，用生理鹽水清洗菌體3次，-40°C冷甲醇溶解后生物量干重達(dá)0.6g/ml，超聲破碎至細(xì)胞裂解，得到裂解液，低溫萃取裂解液，低溫條件為:-40°C至-50°C下萃取3h，離心收集200ul萃取后裂解上清液I，力口入內(nèi)標(biāo)物核糖醇溶液，裂解上清液I體積與內(nèi)標(biāo)物核糖醇重量比例為200ul:20y g，室溫真空烘干，得到細(xì)胞內(nèi)代謝物樣品I。
[0029](2)細(xì)胞外液樣品制備:取發(fā)酵液，離心得到上清液II，取60ul上清液II，在清液II中加入乙腈除去蛋白，上清液II與乙腈體積比為1: 1.5，渦旋振蕩，再離心收集得上清液III，加入內(nèi)標(biāo)物核糖醇溶液，上清液III體積與內(nèi)標(biāo)物核糖醇重量比例為50ul:20μ g，室溫真空烘干，得到細(xì)胞外液樣品II。
[0030](3)樣品衍生:在步驟I)和步驟2)得到的樣品I和樣品II中，分別加入150ul糖衍生劑(糖衍生劑為0.15mg甲氧胺鹽酸溶于IOml吡啶溶液中配制而得)，恒溫放置2.5h，再分別加入50ul氨基酸衍生劑(氨基酸衍生劑為200ul三甲基氯硅烷溶于IOml的三氟乙酰胺中配制而得)，恒溫放置過(guò)夜，衍生完畢，分別離心衍生后的樣品I和樣品II，對(duì)應(yīng)收集各自上清得到待測(cè)胞內(nèi)樣品I和待測(cè)胞外樣品II。
[0031](4)按照氣相色譜-質(zhì)譜其儀器分析條件，對(duì)待測(cè)胞內(nèi)樣品I和待測(cè)胞外樣品II進(jìn)行分析和數(shù)據(jù)采集。
[0032]實(shí)施例4 取乳酸菌發(fā)酵液。
[0033](I)細(xì)胞內(nèi)代謝物樣品制備:取5ml發(fā)酵液，離心得到菌體，用生理鹽水清洗菌體2次，-40°C冷甲醇溶解后生物量干重達(dá)0.8g/ml，超聲破碎至細(xì)胞裂解，得到裂解液，低溫萃取裂解液，低溫條件為:-40°C至-50°C下萃取2h，離心收集50ul萃取后裂解上清液I，加入內(nèi)標(biāo)物核糖醇溶液，裂解上清液I體積與內(nèi)標(biāo)物核糖醇重量比例為50ul:20y g，室溫真空烘干，得到細(xì)胞內(nèi)代謝物樣品I。
[0034](2)細(xì)胞外液樣品制備:取發(fā)酵液，離心得到上清液II，取200ul上清液II，在清液II中加入乙腈除去蛋白，上清液II與乙腈體積比為1: 1.0，渦旋振蕩，再離心收集得上清液III，加入內(nèi)標(biāo)物核糖醇溶液，上清液III體積與內(nèi)標(biāo)物核糖醇重量比例為150ul:20yg，室溫真空烘干，得到細(xì)胞外液樣品II。
[0035](3)樣品衍生:在步驟I)和步驟2)得到的樣品I和樣品II中，分別加入120ul糖衍生劑(糖衍生劑為0.2mg甲氧胺鹽酸溶于IOml吡啶溶液中配制而得)，恒溫放置3.0h，再分別加入80ul氨基酸衍生劑(氨基酸衍生劑為50ul三甲基氯硅烷溶于IOml的三氟乙酰胺中配制而得)，恒溫放置過(guò)夜，衍生完畢，分別離心衍生后的樣品I和樣品II，對(duì)應(yīng)收集各自上清得到待測(cè)胞內(nèi)樣品I和待測(cè)胞外樣品II。
[0036](4)按照氣相色譜-質(zhì)譜其儀器分析條件，對(duì)待測(cè)胞內(nèi)樣品I和待測(cè)胞外樣品II進(jìn)行分析和數(shù)據(jù)采集。
[0037]實(shí)施例5 取酵母菌發(fā)酵液。
[0038](I)細(xì)胞內(nèi)代謝物樣品制備:取5ml發(fā)酵液，離心得到菌體，用生理鹽水清洗菌體3次，-40°C冷甲醇溶解后生物量干重達(dá)0.5g/ml，超聲破碎至細(xì)胞裂解，得到裂解液，低溫萃取裂解液，低溫條件為:-40°C至-50°C下萃取3h，離心收集200ul萃取后裂解上清液I，力口入內(nèi)標(biāo)物核糖醇溶液，裂解上清液I體積與內(nèi)標(biāo)物核糖醇重量比例為150ul:20y g，室溫真空烘干，得到細(xì)胞內(nèi)代謝物樣品I。
[0039](2)細(xì)胞外液樣品制備:取發(fā)酵液，離心得到上清液II，取300ul上清液II，在清液
II中加入乙腈除去蛋白，上清液II與乙腈體積比為1:0.5，渦旋振蕩，再離心收集得上清液III，加入內(nèi)標(biāo)物核糖醇溶液，上清液III體積與內(nèi)標(biāo)物核糖醇重量比例為300ul:20μ g，室溫真空烘干，得到細(xì)胞外液樣品II。[0040](3)樣品衍生:在步驟I)和步驟2)得到的樣品I和樣品II中，分別加入IOOul糖衍生劑(糖衍生劑為0.2mg甲氧胺鹽酸溶于IOml吡啶溶液中配制而得)，恒溫放置4.0h，再分別加入120ul氨基酸衍生劑(氨基酸衍生劑為120ul三甲基氯硅烷溶于IOml的三氟乙酰胺中配制而得)，恒溫放置過(guò)夜，衍生完畢，分別離心衍生后的樣品I和樣品II，對(duì)應(yīng)收集各自上清得到待測(cè)胞內(nèi)樣品I和待測(cè)胞外樣品II。
[0041](4)按照氣相色譜-質(zhì)譜其儀器分析條件，對(duì)待測(cè)胞內(nèi)樣品I和待測(cè)胞外樣品II進(jìn)行分析和數(shù)據(jù)采集。
【權(quán)利要求】
1.一種氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)發(fā)酵液中有機(jī)酸的方法，其特征在于，檢測(cè)方法步驟包括: (1)取發(fā)酵液，高速離心，分別收集菌體和上清液I; (2)發(fā)酵液樣品制備:取6(T350ul步驟I)得到的上清液I，在清液I中加入乙腈除去蛋白，上清液I與乙腈體積比為1:0.5^1.5，渦旋振蕩，再離心收集上清液III，加入內(nèi)標(biāo)物核糖醇溶液，上清液III體積與內(nèi)標(biāo)物核糖醇重量比例為5(T300ul:20 y g，室溫真空烘干，得到細(xì)胞外液樣品II ； (3)樣品衍生:在步驟2)得到的樣品II中，分別加入5(Tl50ul糖衍生劑，恒溫放置1.5~4h，再分別加入5(Tl50ul氨基酸衍生劑，恒溫放置過(guò)夜，衍生完畢，離心衍生后的樣品II，收集上清得到待測(cè)胞內(nèi)樣品II ； (4)利用氣相色譜-質(zhì)譜對(duì)步驟3)得到的待測(cè)胞內(nèi)樣品II，進(jìn)行分析和數(shù)據(jù)采集。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)發(fā)酵液中有機(jī)酸的方法，其特征在于，所述菌體其取樣量為用冷甲醇溶解后生物量干重達(dá)0.2^1.0g/ml ;所述的冷甲醇為經(jīng)過(guò)冷浴槽預(yù)冷至_40°C ;所述低溫萃取為-40°C至-50°C下萃取2~7h。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)發(fā)酵液中有機(jī)酸的方法，其特征在于，所述糖衍生劑為0.r0.3mg甲氧胺鹽酸溶于IOml吡啶溶液中配制而得；所述氨基酸衍生劑為5(T200ul三甲基氯硅烷溶于IOml的三氟乙酰胺中。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)發(fā)酵液中有機(jī)酸的方法，其特征在于，所述氣相色譜-質(zhì)譜其儀器分析條件為:氣相色譜:色譜柱為30 mX0.25 mm的HP-5MS或者DB-5MS毛細(xì)管柱，進(jìn)樣口溫度300°C，檢測(cè)器溫度250°C，柱箱升溫程序平衡時(shí)間3min — 80°C維持 Imin — 2°C /min 升溫至 100°C— 15°C /min 升溫至 22CTC— 30°C /min 升溫至300°C— 300°C維持3 min，進(jìn)樣體積I y L ;質(zhì)譜:離子源EI，檢測(cè)器為四級(jí)桿，電離能70 eV，離子源表面溫度280°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述一種氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)發(fā)酵液中有機(jī)酸的方法，其特征在于，該方法應(yīng)用于檢測(cè)酵母菌、乳酸菌、梭菌、霉菌的生物發(fā)酵過(guò)程中的發(fā)酵液中的有機(jī)酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求廣2或4飛任一項(xiàng)所述的一種氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)發(fā)酵液中有機(jī)酸的方法，其特征在于，所述有機(jī)酸為琥珀酸、蘋果酸、檸檬酸、丙酮酸、富馬酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)發(fā)酵液中有機(jī)酸的方法，其特征在于，所述有機(jī)酸為琥珀酸、蘋果酸、檸檬酸、丙酮酸、富馬酸。
【文檔編號(hào)】G01N30/88GK103675176SQ201310648726
【公開(kāi)日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年12月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月5日
【發(fā)明者】陳東, 梁遠(yuǎn)雄 申請(qǐng)人:柳州聯(lián)?？萍加邢薰?br>