乙型肝炎表面抗體測(cè)定試劑盒以及檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種乙型肝炎表面抗體測(cè)定試劑盒，包括試劑M、試劑R以及校準(zhǔn)品，試劑M中組分包括鏈霉親和素包被磁微粒，鏈霉親和素包被磁微粒經(jīng)診斷試劑防腐劑處理；試劑R中的組分包括生物素化HBsAg、吖啶酯標(biāo)記的HBsAg、PB緩沖液以及診斷試劑防腐劑；對(duì)照組包括人源性乙肝表面抗體、新生牛血清以及診斷試劑防腐劑；生物素化HBsAg中的生物素和所述鏈霉親和素包被磁微粒中的鏈霉親和素形成生物素-親和素系統(tǒng)，生物素-親和素系統(tǒng)為試劑盒測(cè)定過程免疫反應(yīng)后分離系統(tǒng)，使得磁微粒具有統(tǒng)用性。本發(fā)明涉及的乙型肝炎表面抗體測(cè)定試劑盒，制備簡(jiǎn)單，使用方便，易于儲(chǔ)存。使用該試劑盒來(lái)的檢測(cè)方法是基于雙抗原化學(xué)發(fā)光原理，該方法靈敏度高、誤差小、安全快速。
【專利說(shuō)明】乙型肝炎表面抗體測(cè)定試劑盒以及檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及乙型肝炎診斷試劑盒，具有設(shè)計(jì)基于雙抗原化學(xué)發(fā)光原理的乙型肝炎表面抗體測(cè)定試劑盒及檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)感染引起的一種傳染性疾病。HBV可以通過血液和體液直接傳播，常見的傳播方式包括輸血、注射、傷口接觸、母嬰傳播等；常見的臨床癥狀有不適、發(fā)熱、黃疸、無(wú)癥狀肝炎、暴發(fā)性肝炎以及慢性肝炎等，慢性感染易發(fā)展成為肝癌，因此，檢測(cè)乙型肝炎的工作至關(guān)重要。
[0003]目前，常用的檢測(cè)方法是免疫學(xué)檢測(cè)，免疫學(xué)檢測(cè)時(shí)基于抗原和抗體的特異性反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)的一種手段，其可以利用同位素、酶、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)等對(duì)被檢測(cè)信號(hào)進(jìn)行放大和顯示，因此常被用于檢測(cè)蛋白質(zhì)，激素等微量生物活性物質(zhì)。免疫學(xué)檢測(cè)經(jīng)理了放射免疫檢測(cè)、酶聯(lián)免疫檢測(cè)以及光生物學(xué)標(biāo)記免疫檢測(cè)技術(shù)三個(gè)階段，使免疫學(xué)檢測(cè)向著敏感性、準(zhǔn)確性以及操作簡(jiǎn)捷性的方向發(fā)展。
[0004]化學(xué)發(fā)光免疫分析是近十年來(lái)在世界范圍內(nèi)發(fā)展非常迅速的非放射性免疫分析技術(shù)。檢測(cè)原理是以發(fā)光物質(zhì)作為信號(hào)放大系統(tǒng)并借助其發(fā)光強(qiáng)度直接測(cè)定免疫結(jié)合。該方法靈敏度高、檢測(cè)范圍寬，是免疫學(xué)檢測(cè)重要的發(fā)展方向。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種靈敏度高、誤差小、安全快速檢測(cè)的乙型肝炎表面抗體測(cè)定試劑盒及檢測(cè)方法。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案為:一種乙型肝炎表面抗體測(cè)定試劑盒，包括試劑M、試劑R以及校準(zhǔn)品，所述試劑M中組分包括鏈霉親和素包被磁微粒，所述鏈霉親和素包被磁微粒經(jīng)診斷試劑防腐劑處理；所述試劑R中的組分包括生物素化HBsAg、吖啶酯標(biāo)記的HBsAg、PB緩沖液以及診斷試劑防腐劑；所述對(duì)照組包括人源性乙肝表面抗體、新生牛血清以及診斷試劑防腐劑；所述生物素化HBsAg中的生物素和所述鏈霉親和素包被磁微粒中的鏈霉親和素形成生物素-親和素系統(tǒng)，所述生物素-親和素系統(tǒng)為試劑盒測(cè)定過程免疫反應(yīng)后分離系統(tǒng)，使得磁微粒具有統(tǒng)用性。
[0007]本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施例中，進(jìn)一步包括，所述鏈霉親和素包被磁微粒中的磁微粒是以四氧化三鐵為內(nèi)核表面包裹活性基團(tuán)的聚合物，所述磁微粒的直徑為1.5um。
[0008]本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施例中，進(jìn)一步包括，試劑R中所述PB緩沖液的濃度為0.1M，PH值為7.4。
[0009]本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施例中，進(jìn)一步包括，所述診斷試劑防腐劑為0.1%的Proclin300 防腐劑。
[0010]本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施例中，進(jìn)一步包括,所述試劑R為23ml,所述試劑M的量為3ml。[0011]本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施例中，進(jìn)一步包括，所述校準(zhǔn)品包括校準(zhǔn)品I和校準(zhǔn)品2兩組，所述校準(zhǔn)品I的量為0.5ml, Ant1-HBs濃度為15mIU/ml，所述校準(zhǔn)品2的量為0.5ml,Ant1-HBs 濃度為 150mIU/ml。
[0012]本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施例中，進(jìn)一步包括，一種使用該乙型肝炎表面抗體測(cè)定試劑盒的檢測(cè)方法，包括以下幾步:
[0013](I)在將待測(cè)樣品和含有生物素化HBsAg及吖啶酯標(biāo)記的HBsAg的試劑R進(jìn)行反應(yīng)，形成含有抗體-抗原-抗體夾心復(fù)合體的反應(yīng)液I ;
[0014](2)在反應(yīng)液I中加入含有鏈霉親和素包被磁微粒的試劑M,反應(yīng)液I中的復(fù)合體在生物素和親和素的相互作用下形成固相；
[0015](3)將步驟(2)中的反應(yīng)液I置于化學(xué)發(fā)光測(cè)定儀上進(jìn)行檢測(cè)，在磁場(chǎng)的檢測(cè)中的磁微粒將被吸附，通過洗滌液洗滌，將未結(jié)合物沖洗除去；然后，注入化學(xué)發(fā)光激發(fā)液I及化學(xué)發(fā)光激發(fā)液2，檢測(cè)其化學(xué)發(fā)光光子強(qiáng)度；產(chǎn)生的光強(qiáng)度與樣本內(nèi)乙型肝炎表面抗體濃度成正比。
[0016]本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施例中，進(jìn)一步包括，所述化學(xué)發(fā)光激發(fā)液I中含有過氧化氫，所述化學(xué)發(fā)光激發(fā)液2中含有氫氧化鈉，所述洗滌液含有磷酸鹽緩沖液。
[0017]本發(fā)明的解決了現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，具有以下有益效果:
[0018]1.本發(fā)明涉及的乙型肝炎表面抗體測(cè)定試劑盒，制備簡(jiǎn)單，使用方便，易于儲(chǔ)存，可用于定量測(cè)定人體血清(血漿)中乙型肝炎病毒表面抗體的濃度，用于判斷HBV感染恢復(fù)或者既往發(fā)生過HBV感染、HBV免疫。使用該試劑盒來(lái)的檢測(cè)方法是基于雙抗原化學(xué)發(fā)光原理，該方法靈敏度高、誤差小、安全快速。
【具體實(shí)施方式】
[0019]為了使本【技術(shù)領(lǐng)域】的人員更好地理解本發(fā)明，并使本發(fā)明的上述優(yōu)點(diǎn)能夠更加明顯易懂，下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。
[0020]本發(fā)明一種乙型肝炎表面抗體測(cè)定試劑盒，組要組成成分如下:
[0021]試劑R:每瓶23ml，內(nèi)含有生物素化HBsAg及吖啶酯標(biāo)記HBsAg，0.1MPH7.4的PB緩沖液，0.l%Proclin300診斷試劑防腐劑；吖唳酯標(biāo)記HBsAg是以吖唳酯通過二甲基亞胺偶聯(lián)HBsAg。
[0022]試劑M:每瓶3.0ml,內(nèi)含鏈霉親和素包被的磁微粒，經(jīng)0.l%Proclin300診斷試劑防腐劑防腐處理；其中，鏈霉親和素包被磁微粒中的磁微粒是以四氧化三鐵為內(nèi)核表面包裹活性基團(tuán)的聚合物，所述磁微粒的直徑為1.5um。
[0023]校準(zhǔn)品(Cal):本發(fā)明實(shí)施例中的校準(zhǔn)品分為I和2兩組，均內(nèi)含人源性的乙肝表面抗體，新生牛血清，0.l%Proclin300診斷試劑防腐劑；校準(zhǔn)品濃度如下:Call的近似濃度為 15.00mIU/ml, Cal2 的近似濃度為 150.00mIU/ml。
[0024]其中，生物素化HBsAg中的生物素和所述鏈霉親和素包被磁微粒中的鏈霉親和素形成生物素-親和素系統(tǒng)，所述生物素-親和素系統(tǒng)為試劑盒測(cè)定過程免疫反應(yīng)后分離系統(tǒng)，使得磁微粒具有統(tǒng)用性。
[0025]本發(fā)明的乙型肝炎表面抗體測(cè)定試劑盒用于測(cè)定人血清(血漿)中乙型肝炎表面抗體的濃度，乙型肝炎表面抗體(Ant1-HBs)是在人體感染HBV康復(fù)或接種乙肝疫苗后出現(xiàn)的，對(duì)乙型肝炎病毒具有保護(hù)性免疫作用，乙型肝炎表面抗體(Ant1-HBs)檢測(cè)可用于判斷HBV感染恢復(fù)或既往發(fā)生過HBV感染、HBV免疫，Ant1-HBs與HBsAg同時(shí)陽(yáng)性可能是由于不同乙肝亞型病毒先后感染或Ant1-HBs與HBsAg形成免疫復(fù)合物。
[0026]本發(fā)明使用該試劑盒的檢測(cè)原理是采用雙抗原化學(xué)發(fā)光原理，步驟如下:
[0027]第一步反應(yīng):將樣本和生物素化乙肝病毒表面抗原(HBsAg)及吖啶酯標(biāo)記的HBsAg進(jìn)行反應(yīng)，如果標(biāo)本中含有Ant1-HBs，將形成抗原-抗體-抗原夾心復(fù)合體。
[0028]第二步反應(yīng):加入鏈霉親和素包被的微粒，復(fù)合體在生物素和親和素相互作用下形成固相。
[0029]將反應(yīng)液置于一個(gè)磁場(chǎng)內(nèi)，檢測(cè)中的磁微粒將被吸附，通過洗滌，將未結(jié)合物沖洗除去；然后，注入化學(xué)發(fā)光激發(fā)液I及化學(xué)發(fā)光激發(fā)液2，檢測(cè)其化學(xué)發(fā)光光子強(qiáng)度；產(chǎn)生的光強(qiáng)度與樣本內(nèi)Ant1-HBs濃度成正比。樣本內(nèi)分析物的量由所儲(chǔ)存的多點(diǎn)校準(zhǔn)曲線來(lái)確定。
[0030]實(shí)施例1
[0031]本發(fā)明具體實(shí)施例中的具體實(shí)驗(yàn)步驟如下:
[0032]首先，要獲得待測(cè)樣品，即血清，按照常規(guī)應(yīng)用技術(shù)采集全血標(biāo)本，放置半小時(shí)以上使凝集，在3000rpm的轉(zhuǎn)速下離心10分鐘以上，使血清分離完全，血清中不含細(xì)胞成分；血漿用肝素鈉、EDTA-K3、枸櫞酸鈉或氟化鈉/草酸鉀抗凝。
[0033]然后，對(duì)該待測(cè)樣品使用乙型肝炎表面抗體測(cè)定試劑盒進(jìn)行檢測(cè):
[0034](I)在將待測(cè)樣品和含有生物素化HBsAg及吖啶酯標(biāo)記的HBsAg的試劑R進(jìn)行反應(yīng)，形成含有抗體-抗原-抗體夾心復(fù)合體的反應(yīng)液I ;
[0035](2)在反應(yīng)液I中加入含有鏈霉親和素包被磁微粒的試劑M,反應(yīng)液I中的復(fù)合體在生物素和親和素的相互作用下形成固相；生物素化HBsAg中的生物素和所述鏈霉親和素包被磁微粒中的鏈霉親和素形成生物素-親和素系統(tǒng)，所述生物素-親和素系統(tǒng)為試劑盒測(cè)定過程免疫反應(yīng)后分離系統(tǒng)，使得磁微粒具有統(tǒng)用性；
[0036](3)將步驟(2)中的反應(yīng)液I置于化學(xué)發(fā)光測(cè)定儀上進(jìn)行檢測(cè)，在磁場(chǎng)的檢測(cè)中的磁微粒將被吸附，通過洗滌液洗滌，將未結(jié)合物沖洗除去；然后，注入化學(xué)發(fā)光激發(fā)液I及化學(xué)發(fā)光激發(fā)液2，檢測(cè)其化學(xué)發(fā)光光子強(qiáng)度；產(chǎn)生的光強(qiáng)度與樣本內(nèi)乙型肝炎表面抗體濃度成正比。
[0037]其中，所述化學(xué)發(fā)光激發(fā)液I中含有過氧化氫，所述化學(xué)發(fā)光激發(fā)液2中含有氫氧化鈉，所述洗滌液含有磷酸鹽緩沖液。
[0038]在本發(fā)明的實(shí)施例中如果待測(cè)樣品是在24小時(shí)之內(nèi)使用，可于2_8°C下保存，如果需要超過24小時(shí)的長(zhǎng)期存放應(yīng)該保存在_20°C以下，并且避免樣品反復(fù)凍融。
[0039]本發(fā)明實(shí)施例中的化學(xué)發(fā)光測(cè)定儀是EVERESYS A1800 I類，在檢測(cè)時(shí)，將試劑裝載到化學(xué)發(fā)光測(cè)定儀試劑倉(cāng)上，并在軟件操作系統(tǒng)上確定裝載就試劑的名稱；試劑在裝載前，應(yīng)輕輕混勻，但禁止上下顛倒已打開的試劑；將檢測(cè)樣本裝載在樣本倉(cāng)中，并在軟件操作系統(tǒng)上確定樣本檢測(cè)項(xiàng)目；將反應(yīng)杯裝載滿，也可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況裝載相應(yīng)數(shù)量反應(yīng)杯；每次檢測(cè)樣本量需要50ul，考慮檢測(cè)系統(tǒng)死體積因素，應(yīng)確保樣本量在200ul以上，同時(shí)應(yīng)考慮樣本容器的死腔因素。
[0040]結(jié)果計(jì)算[0041]測(cè)定儀自動(dòng)計(jì)算得出每份標(biāo)本的測(cè)定濃度(單位為mIU/mL)。標(biāo)本的抗-HBs含量< 10mIU/mL判斷為抗-HBs無(wú)反應(yīng)性；標(biāo)本的抗-HBs含量≥10mIU/mL判斷為抗-HBs反應(yīng)性。
[0042]最低檢測(cè)限
[0043]使用上述的檢測(cè)方法，最低檢測(cè)限低于2mIU/mL，分析靈敏度被定義于區(qū)別零濃度的分析物最低檢測(cè)濃度。采用本檢測(cè)系統(tǒng)O校準(zhǔn)品的RLU均值與2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差之和對(duì)應(yīng)的濃度(n=20)。
[0044]檢測(cè)范圍
[0045]本發(fā)明的檢測(cè)方法的檢測(cè)范圍為7_500mIU/mL。
[0046]精密度
[0047]精密度依照美國(guó)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(NCCLS) EP5-A方案制定，對(duì)5份抗-HBs質(zhì)控品(其中三份血清，二份為校準(zhǔn)品)，采用同一批次試劑，每天不同時(shí)間各檢測(cè)一次，每次雙孔，共進(jìn)行20天，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表1所示。
[0048]表1實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0049]
【權(quán)利要求】
1.一種乙型肝炎表面抗體測(cè)定試劑盒，其特征在于，包括試劑Μ、試劑R以及校準(zhǔn)品，所述試劑M中組分包括鏈霉親和素包被磁微粒，所述鏈霉親和素包被磁微粒經(jīng)診斷試劑防腐劑處理；所述試劑R中的組分包括生物素化HBsAg、吖啶酯標(biāo)記的HBsAg、PB緩沖液以及診斷試劑防腐劑；所述對(duì)照組包括人源性乙肝表面抗體、新生牛血清以及診斷試劑防腐劑；所述生物素化HBsAg中的生物素和所述鏈霉親和素包被磁微粒中的鏈霉親和素形成生物素-親和素系統(tǒng)，所述生物素-親和素系統(tǒng)為試劑盒測(cè)定過程免疫反應(yīng)后分離系統(tǒng)，使得磁微粒具有統(tǒng)用性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙型肝炎表面抗體測(cè)定試劑盒，其特征在于，所述鏈霉親和素包被磁微粒中的磁微粒是以四氧化三鐵為內(nèi)核表面包裹活性基團(tuán)的聚合物，所述磁微粒的直徑為1.5um。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙型肝炎表面抗體測(cè)定試劑盒，其特征在于，試劑R中所述PB緩沖液的濃度為0.1M，pH值為7.4。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙型肝炎表面抗體測(cè)定試劑盒，其特征在于，所述診斷試劑防腐劑為0.1%的Proclin300防腐劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙型肝炎表面抗體測(cè)定試劑盒，其特征在于，所述試劑R為23ml，所述試劑M的量為3ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙型肝炎表面抗體測(cè)定試劑盒，其特征在于，所述校準(zhǔn)品包括校準(zhǔn)品I和校準(zhǔn)品2兩組，所述校準(zhǔn)品I的量為0.5ml, Ant1-HBs濃度為15 mIU/ml，所述校準(zhǔn)品2的量為0.5ml, Ant1-HBs濃度為150 mIU/ml。
7.一種使用權(quán)利要求1-6所述的乙型肝炎表面抗體測(cè)定試劑盒的檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下幾步: (1)在將待測(cè)樣品和含有生物素化HBsAg及吖啶酯標(biāo)記的HBsAg的試劑R進(jìn)行反應(yīng)，形成含有抗體-抗原-抗體夾心復(fù)合體的反應(yīng)液I ; (2)在反應(yīng)液I中加入含有鏈霉親和素包被磁微粒的試劑M，反應(yīng)液I中的復(fù)合體在生物素和親和素的相互作用下形成固相； (3)將步驟(2)中的反應(yīng)液I置于化學(xué)發(fā)光測(cè)定儀上進(jìn)行檢測(cè)，在磁場(chǎng)的檢測(cè)中的磁微粒將被吸附，通過洗滌液洗滌，將未結(jié)合物沖洗除去；然后，注入化學(xué)發(fā)光激發(fā)液I及化學(xué)發(fā)光激發(fā)液2,檢測(cè)其化學(xué)發(fā)光光子強(qiáng)度；產(chǎn)生的光強(qiáng)度與樣本內(nèi)乙型肝炎表面抗體濃度成正比。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的乙型肝炎表面抗體測(cè)定試劑盒的檢測(cè)方法，其特征在于，所述化學(xué)發(fā)光激發(fā)液I中含有過氧化氫，所述化學(xué)發(fā)光激發(fā)液2中含有氫氧化鈉，所述洗滌液含有磷酸鹽緩沖液。
【文檔編號(hào)】G01N21/76GK103616510SQ201310653654
【公開日】2014年3月5日 申請(qǐng)日期:2013年12月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月6日
【發(fā)明者】陳秀發(fā), 胡慶鋒, 常立峻, 徐海偉, 李勇 申請(qǐng)人:蘇州長(zhǎng)光華醫(yī)生物醫(yī)學(xué)工程有限公司