一種測(cè)定交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠中聚乙二醇?xì)埩袅康姆椒?br> 【專利摘要】本發(fā)明公開了一種交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠中聚乙二醇?xì)埩袅康臋z測(cè)方法，依據(jù)PEG與鋇離子和碘離子形成1∶1∶1的復(fù)合物的光密度與PEG的含量在535nm處呈線性關(guān)系的原理采用非常規(guī)溶劑建立了一種操作簡(jiǎn)單、快速、穩(wěn)定性好的交聯(lián)凝膠中微量PEG殘留量的檢測(cè)方法。該檢測(cè)方法在0-50.0μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，尤其可用于殘留量在2μg/mL以下的和大分子量的交聯(lián)劑檢測(cè)。本檢測(cè)方法不僅可用于PEG交聯(lián)的透明質(zhì)酸鈉凝膠中PEG殘留量的痕量檢測(cè)和凝膠產(chǎn)品的質(zhì)量控制，對(duì)PEG交聯(lián)的其它凝膠及含有PEG的其它液態(tài)樣品中PEG殘留量的檢測(cè)也有重要意義。
【專利說明】—種測(cè)定交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠中聚乙二醇?xì)埩袅康姆椒?br> [0001]
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及生物化學(xué)、藥物化學(xué)與藥物分析【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種測(cè)定交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠中聚乙二醇?xì)埩袅康姆椒ā?br> 【背景技術(shù)】
[0003]透明質(zhì)酸是廣泛存在于生物體中的一種天然保濕因子，Ig透明質(zhì)酸至少持水600g，透明質(zhì)酸是由雙糖單位D-葡萄糖醛酸與N-乙酰葡糖胺多次重復(fù)排列所組成的酸性大分子多糖，廣泛地應(yīng)用于化妝品、食品和醫(yī)藥領(lǐng)域，商品一般用其鈉鹽，即透明質(zhì)酸鈉(SH)。天然的透明質(zhì)酸鈉凝膠具有良好的生物相容性好，然而因其易被降解，在體內(nèi)存留時(shí)間短，限制其廣泛應(yīng)用。通過化學(xué)修飾制備交聯(lián)凝膠是目前提高或延長(zhǎng)其穩(wěn)定性的主要手段。目前制備交聯(lián)凝膠常用的方法是以1，4-丁二醇二縮水甘油基醚(I，4-butanediol diglycidyl ether , BDDE)、二乙烯基諷(Divinyl sulphone, DVS)、碳二亞胺(Biscarbodimide, EDC)等為交聯(lián)劑采用一定的工藝技術(shù)制成,但是這些交聯(lián)劑都有一定的刺激性和毒性，交聯(lián)劑在凝膠制品中的殘留量或含量各個(gè)國(guó)家都有嚴(yán)格的規(guī)定。聚乙二醇是一種被世界各國(guó)批準(zhǔn)的既可食用又可藥用的化合物，在醫(yī)藥領(lǐng)域，它不僅常作為口服制劑的輔料，還是一些注射劑常用的載體，無毒，具有良好的生物相容性且易被機(jī)體排出體外。用PEG做交聯(lián)劑制備交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠已引起人們的廣泛關(guān)注和高度重視，PEG交聯(lián)的透明質(zhì)酸鈉凝膠具有明顯的優(yōu)越性和廣闊的市場(chǎng)前景。
[0004]雖然PEG應(yīng)用廣泛，但無論是在食品還是在藥品中，PEG對(duì)機(jī)體來說都是一種外來的化合物，所以在相關(guān)產(chǎn)品中其含量或殘留量都有嚴(yán)格的限制，必須進(jìn)行檢測(cè)。目前國(guó)內(nèi)外見于報(bào)道的分析檢測(cè)PEG含量或殘留量的方法主要有紙色譜、薄層色譜、氣相色譜、高效液相色譜、分光光度法等，但這些方法大都是針對(duì)液態(tài)樣品如疫苗、尿液等液體中PEG的含量進(jìn)行檢測(cè)的，對(duì)于凝膠中PEG殘留量的檢測(cè)尚未見報(bào)道。而且在已報(bào)道的上述方法中，紙色譜的分離時(shí)間較長(zhǎng)，且同薄層色譜一樣，難以對(duì)PEG進(jìn)行精確定量。氣相色譜和高效液相色譜是對(duì)PEG進(jìn)行定量檢測(cè)的常用方法，然而氣相色譜所測(cè)定的PEG分子量較低，IOOODa為最高上限，且分子量大于500的PEG需進(jìn)行衍生化后再檢測(cè)，衍生步驟耗時(shí)且衍生物穩(wěn)定性不高。高效液相色譜可對(duì)PEG進(jìn)行分離和定量，大多數(shù)高效液相色譜方法使用的是示差折光檢測(cè)器，而這種方法由于靈敏度低應(yīng)用范圍也不普遍，而且液相色譜儀器設(shè)備投資大，并且所需試劑耗材昂貴。分光光度法測(cè)定PEG含量主要有D試劑法和氯化鋇法。由于D試劑法配制試劑過程繁瑣且不穩(wěn)定易降解，硝酸鉍價(jià)格昂貴，且該方法的最低檢測(cè)限偏高(大于2Pg/mL)而使其應(yīng)用越來越少。Childs于1975年首次建立了 PEG的氯化鋇檢測(cè)法，其基本原理為PEG與鋇離子和碘離子形成復(fù)合物(1:1:1 )，在535nm處的光密度值與PEG的含量呈線性關(guān)系進(jìn)行檢測(cè)，后經(jīng)B.Skoog和G.E.C.Sims及T.J.Snape改進(jìn),至今仍在應(yīng)用。然而B.Skoog報(bào)道的PEG的最低檢測(cè)限是5 Mg/mL,G.E.C.Sims和T.J.Snape的研究結(jié)果中PEG的含量低于2 l^g/mL時(shí)就檢測(cè)不到，而在醫(yī)學(xué)美容等領(lǐng)域相關(guān)交聯(lián)凝膠產(chǎn)品中的交聯(lián)劑的殘留量一般應(yīng)小于2呢/mL才算符合要求，目前還缺乏采用分光光度法檢測(cè)出凝膠中PEG600-20000殘留量小于2 l^g/mL的相關(guān)技術(shù)和方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明針對(duì)已有技術(shù)的不足，提供一種交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠中聚乙二醇?xì)埩袅康臏y(cè)定方法，通過提供一種凝膠樣品的前處理或預(yù)處理方法，再加上一種非常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作，建立了一種可簡(jiǎn)單、快速檢測(cè)交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉鈉凝膠中PEG殘留量(小于2呢/mL)的痕量分析方法。該方法對(duì)凝膠樣品進(jìn)行特殊的預(yù)處理，用95%或無水乙醇沉淀該凝膠，離心取上清液檢測(cè)其聚乙二醇?xì)埩袅?。依?jù)PEG與鋇離子和碘離子形成1:1:1的復(fù)合物的光密度與PEG的含量在535nm處呈線性關(guān)系的原理，檢測(cè)凝膠樣品中PEG的殘留量。該方法與其他方法相比，可以大大降低實(shí)驗(yàn)成本且靈敏度高，穩(wěn)定性好，簡(jiǎn)單安全，方便快捷。 [0006]該測(cè)定交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠中聚乙二醇?xì)埩袅康姆椒òㄒ韵鹿に嚥襟E:
(I)樣品預(yù)處理
交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠的樣品預(yù)處理:將PEG交聯(lián)的透明質(zhì)酸鈉凝膠用7-14倍體積的95%乙醇或無水乙醇醇沉多次，對(duì)所得沉淀干燥并粉碎，將部分粉碎后的顆?；蚍勰┰?08-124°C下復(fù)溶10-30min，精密稱取復(fù)溶后的凝膠1.0g，加入2 mL無水乙醇，密封，經(jīng)漩渦振蕩器振蕩，使凝膠沉淀，然后于5000-1800()r/min離心3_30min，取上清液待測(cè)；
非交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠的樣品預(yù)處理:將非交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠用7-14倍體積的95%乙醇或無水乙醇醇沉多次，對(duì)所得沉淀干燥并粉碎，將粉碎后的顆粒或粉末在108-124°C復(fù)溶10-30min,精密稱取復(fù)溶后的全部凝膠于1000mL燒杯內(nèi)，加入2倍體積(g:mL)無水乙醇，用玻璃棒攪拌使凝膠沉淀，然后將上清液分裝于IOOmL離心管中在5000-18000r/min離心3-30min,取上清液備用；
(2)PEG標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制PEG600-20000標(biāo)準(zhǔn)貯存液:精密稱取50mg的PEG600-20000，加入非交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠樣品經(jīng)預(yù)處理所制得的上清液中溶解，在IOOmL容量瓶中定容，于4°C冰箱保存?zhèn)溆?；PEG600-20000標(biāo)準(zhǔn)工作液:吸取PEG600-20000標(biāo)準(zhǔn)貯存液5mL于50mL容量瓶中，用非交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠樣品經(jīng)預(yù)處理所制得的上清液定容，質(zhì)量濃度為50|ag/mL ；
(3)氯化鋇溶液的配制
精確稱取5g氯化鋇，加蒸餾水定容至100ml，得到5%的氯化鋇溶液；
(4)碘液的配制
精確稱取碘化鉀2.0g和碘1.3g，加蒸餾水定容至100ml，得到0.05mol/L的碘液；
(5)PEG溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
分別取6-15組具有不同濃度為0,0.5、10.5,20.5,30.5,40.5 l^g/mL的PEG標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0ml,濃度范圍在0-50 ii g/ml之間，加入5ml蒸餾水，5%的氯化鋇溶液和碘液各50-1000 iil，反應(yīng)8-15min，于波長(zhǎng)535nm處測(cè)定光密度值；每個(gè)濃度做三個(gè)平行樣；以上加量可按比例增減；根據(jù)每組PEG濃度與測(cè)得的光密度值之間的關(guān)系，以PEG濃度為橫坐標(biāo)，光密度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；
(6)交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠中PEG殘留量的計(jì)算本發(fā)明的用于計(jì)算交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠中PEG殘留量的計(jì)算公式如下:
Y=0.0108X+0.2047 (R2=0.9994)
式中:X——PEG的質(zhì)量濃度(U g/ml)；
Y——碘-氯化鋇-PEG (1:1:1)復(fù)合物在535nm處的光密度值；
(7)交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠中PEG殘留量的測(cè)定方法步驟
按步驟(5)，取步驟(1)交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠樣品預(yù)處理中所得的上清液適量加入一定量的蒸餾水、氯化鋇溶液和碘液反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為15min以內(nèi)，于波長(zhǎng)535nm處測(cè)定光密度值，根據(jù)步驟(5)制作的PEG濃度與相應(yīng)光密度值之間的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)應(yīng)關(guān)系曲線或按步驟(6)的計(jì)算公式確定待測(cè)交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠中PEG殘留量。
[0007]所述步驟(1)中對(duì)交聯(lián)凝膠所進(jìn)行的預(yù)處理是用95%的乙醇醇沉交聯(lián)凝膠，用離心后所得到的上清液來檢測(cè)交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠中的PEG殘留量。
[0008]所述步驟(2)中所配制的PEG標(biāo)準(zhǔn)溶液的溶劑為步驟(Tl中非交聯(lián)凝膠經(jīng)與交聯(lián)凝
膠相同體積份數(shù)的95%乙醇醇沉得到的上清液，非交聯(lián)凝膠除了在制備過程中未加入交聯(lián)劑PEG外，其他步驟均相同，所以，所配制的PEG標(biāo)準(zhǔn)溶液與所要檢測(cè)殘留量的上清液除了PEG含量有所不同外，其他的組分都一樣。
[0009]所述步驟(5) PEG溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作中的零對(duì)照為步驟⑴中非交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉
凝膠經(jīng)95%乙醇醇沉并離心所得的上清液，且步驟(5)中標(biāo)準(zhǔn)PEG溶液要依次加入5ml蒸餾
水，5%的氯化鋇溶液和碘液，而零對(duì)照則是對(duì)非交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠經(jīng)95%乙醇醇沉并離心所得的上清液補(bǔ)加蒸餾水至體積與標(biāo)準(zhǔn)PEG溶液梯度系列相等。
[0010]所述方法測(cè)定光密度值的最佳時(shí)間為1Omin。
[0011]所述方法反應(yīng)時(shí)加入氯化鋇溶液和碘液的最佳量為250ul。
[0012]本發(fā)明的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)是制作標(biāo)準(zhǔn)曲線所用的PEG600-20000的標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制與常規(guī)方法不同，常規(guī)方法是用蒸餾水作為溶劑溶解PEG600-20000配制成一定濃度的溶液，再加入不同比例的蒸餾水稀釋成所需要的濃度梯度，而本研究所用的配制PEG600-20000的標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法則是用非交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠醇沉后的上清液作為溶劑溶解PEG600-20000配制成一定濃度的溶液，再加入不同比例的上清液稀釋成所需要的濃度梯度。除了非交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠醇沉后上清液中不含PEG600-20000，所用的非交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠的上清液與樣品檢測(cè)時(shí)交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠上清液的組成成分一致，盡可能多的排除了影響檢測(cè)結(jié)果的干擾因子，與傳統(tǒng)方法中用蒸餾水來配制標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法是不同的。
[0013]另外本發(fā)明的空白對(duì)照也與常規(guī)方法不同，常規(guī)方法中空白對(duì)照為蒸餾水，最后步驟要加入顯色劑氯化鋇和碘液，而本發(fā)明所用方法的空白對(duì)照則是為非交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠醇沉后的上清液，在最后步驟不加顯色劑，用蒸餾水替代顯色劑。本方法的具體操作是用非交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠醇沉上清液加入5.5mL蒸餾水后的溶液作為空白對(duì)照，與傳統(tǒng)方法中的空白對(duì)照為蒸餾水中加入顯色劑的溶液是不同的，此類方法對(duì)于測(cè)量PEG含量較高的溶液是合適的，對(duì)于PEG含量較低的樣品則難以檢測(cè)。因?yàn)楸痉椒ǖ目瞻讓?duì)照未加入顯色劑，所以可以在PEG濃度較低(≤2ug/mL)的情況下可得到理想的光密度值。因此，本發(fā)明的方法可用于較低PEG殘留量(≤2ug/mL)的檢測(cè)，可直接用于PEG交聯(lián)的凝膠產(chǎn)品生產(chǎn)過程中PEG殘留量的痕量檢測(cè)和凝膠產(chǎn)品的質(zhì)量控制。
[0014]本發(fā)明的有益效果是:
本發(fā)明經(jīng)過長(zhǎng)期試驗(yàn)探索之后，終于找到一種凝膠樣品的前處理或預(yù)處理方法，通過一種非常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作，建立了一種可簡(jiǎn)單、快速檢測(cè)交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉鈉凝膠中PEG殘留量(小于2呢/mL)的痕量分析方法。本檢測(cè)方法可為PEG交聯(lián)的透明質(zhì)酸鈉凝膠中PEG殘留量的痕量檢測(cè)和凝膠產(chǎn)品的質(zhì)量控制奠定基礎(chǔ)，對(duì)PEG交聯(lián)的其它凝膠及含有PEG的其它液態(tài)樣品中PEG殘留量的檢測(cè)有一定的參考價(jià)值，對(duì)凝膠制品生產(chǎn)過程中其它交聯(lián)劑的微量檢測(cè)和產(chǎn)品質(zhì)量控制也具有借鑒作用。
[0015]同時(shí)，本發(fā)明通過醇沉技術(shù)以醇沉后的上清液來檢測(cè)凝膠樣品中的交聯(lián)劑殘留量，既對(duì)原樣品無任何污染或破壞，又可對(duì)原樣品進(jìn)行進(jìn)一步的精制，通過檢測(cè)后的凝膠樣品醇沉物通過一定的制膠技術(shù)還可再次做成凝膠，具有一舉多得的效果。
[0016]本發(fā)明用氯化鋇和碘液作為顯色劑，PEG與鋇離子和碘離子(1:1:1)所生成復(fù)合物在535nm的光密度值與PEG的濃度在較寬范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。該法不需要昂貴的儀器，大大節(jié)省了實(shí)驗(yàn)成本，簡(jiǎn)單方便，便于大規(guī)模推廣應(yīng)用。
【具體實(shí)施方式】
[0017]以下詳細(xì)介紹本發(fā)明的實(shí)施例。
[0018]實(shí)施例1:
主要儀器:FA1204B型電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-1FD潔凈工作臺(tái)，蘇凈安泰有限公司；722N型可見分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；TGL-16C型菲恰爾離心機(jī)，上海菲恰爾分析儀器有限公司；渦旋振蕩儀，北方同正有限公司；移液器，德國(guó)Eppendorf公司；
CL)樣品預(yù)處理
交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠的樣品預(yù)處理:將制備的交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠用14倍體積的95%乙醇醇沉多次，對(duì)所得沉淀干燥并粉碎，將部分粉碎后的顆?；蚍勰┰?21°C復(fù)溶20min，精密稱取復(fù)溶后的凝膠1.0g，加入2 mL無水乙醇，密封，經(jīng)漩渦振蕩器振蕩，使凝膠沉淀，然后于10000r/min離心15min，取上清液待測(cè)；
非交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠的樣品預(yù)處理:將制備的非交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠用14倍體積的95%乙醇醇沉多次，對(duì)所得沉淀干燥并粉碎，將粉碎后的顆?；蚍勰┰?21°C復(fù)溶20min，精密稱取復(fù)溶后的全部凝膠于1000mL燒杯內(nèi)，加入2倍體積(g:mL)無水乙醇，用玻璃棒攪拌使凝膠沉淀，然后將上清液分裝于IOOmL離心管中在10000r/min離心15min，取上清液備用；
(2)PEG標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 PEG20000標(biāo)準(zhǔn)貯存液:精密稱取50mg的PEG20000，加入非交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠的樣品經(jīng)預(yù)處理所制得的上清液中溶解，在IOOmL容量瓶中定容，于4°C冰箱保存?zhèn)溆茫?br> PEG20000標(biāo)準(zhǔn)工作液:吸取PEG20000標(biāo)準(zhǔn)貯存液5mL于50mL容量瓶中，用非交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠的樣品經(jīng)預(yù)處理所制得的上清液定容，質(zhì)量濃度為50|ag/mL ；
(3)氯化鋇溶液的配制
精確稱取5g氯化鋇，加蒸餾水定容至100ml，得到5%的氯化鋇溶液；
(4)碘液的配制
精確稱取碘化鉀2.0g和碘1.3g，加蒸餾水定容至100ml，得到0.05mol/L的碘液；
(5)PEG溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
分別取6組具有不同濃度為0、0.5,10.5,20.5,30.5,40.5 l^g/mL的PEG標(biāo)準(zhǔn)溶液
1.0ml，濃度范圍在0-50 ii g/ml之間，加入5ml蒸餾水，5%的氯化鋇溶液和碘液各250 yl，反應(yīng)15min，于波長(zhǎng)535nm處測(cè)定光密度值；每個(gè)濃度做三個(gè)平行樣；以上加量可按比例增減；根據(jù)每組PEG濃度與測(cè)得的光密度值之間的關(guān)系，以PEG濃度為橫坐標(biāo)，光密度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；
(6)交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠中PEG殘留量的計(jì)算
本發(fā)明的用于計(jì)算交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠中PEG殘留量的計(jì)算公式如下:
Y=0.0108X+0.2047 (R2=0.9994)
式中:X——PEG的質(zhì)量濃度(U g/ml)；
Y——碘-氯化鋇-PEG (1:1:1)復(fù)合物在535nm處的光密度值；
(7)交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠中PEG殘留量的測(cè)定方法步驟
按步驟(5)，取步驟(1)交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠樣品預(yù)處理中所得的上清液適量加入蒸餾水、氯化鋇溶液和碘液反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為15min以內(nèi)，于波長(zhǎng)535nm處測(cè)定光密度值，根據(jù)步驟(5)制作的PEG濃度與相應(yīng)光密度值之間的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)應(yīng)關(guān)系曲線或按步驟(6)的計(jì)算公式確定待測(cè)交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠中PEG殘留量。
[0019]實(shí)施例2:
主要儀器:FA1204B型電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-1FD潔凈工作臺(tái)，蘇凈安泰有限公司；722N型可見分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；TGL-16C型菲恰爾離心機(jī)，上海菲恰爾分析儀器有限公司；渦旋振蕩儀，北方同正有限公司；移液器，德國(guó)Eppendorf公司；
(I)樣品預(yù)處理
交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠的樣品預(yù)處理:將制備的交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠用7倍體積的無水乙醇醇沉多次，對(duì)所得沉淀干燥并粉碎，將部分粉碎后的顆粒或粉末在108°C復(fù)溶30min，精密稱取復(fù)溶后的凝膠1.0g，加入2 mL無水乙醇，密封，經(jīng)漩渦振蕩器振蕩，使凝膠沉淀，然后于5000r/min離心30min，取上清液待測(cè)；
非交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠的樣品預(yù)處理:將制備的非交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠用7倍體積的無水乙醇醇沉多次，對(duì)所得沉淀干燥并粉碎，將粉碎后的顆?；蚍勰┰?08°C復(fù)溶30min，精密稱取復(fù)溶后的全部凝膠于1000mL燒杯內(nèi)，加入2倍體積(g:mL)無水乙醇，用玻璃棒攪拌使凝膠沉淀，然后將上清液分裝于IOOmL離心管中在5000r/min離心30min，取上清液備用；
(?:) PEG標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
PEG600標(biāo)準(zhǔn)貯存液:精密稱取50mg的PEG600，加入非交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠的樣品經(jīng)預(yù)處理所制得的上清液中溶解，在IOOmL容量瓶中定容，于4°C冰箱保存?zhèn)溆茫?br> PEG600標(biāo)準(zhǔn)工作液:吸取PEG600標(biāo)準(zhǔn)貯存液5mL于50mL容量瓶中，用非交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠的樣品經(jīng)預(yù)處理所制得的上清液定容，質(zhì)量濃度為50|ag/mL ；
(3)氯化鋇溶液的配制
精確稱取5g氯化鋇，加蒸餾水定容至100ml，得到5%的氯化鋇溶液；
(4)碘液的配制
精確稱取碘化鉀2.0g和碘1.3g，加蒸餾水定容至100ml，得到0.05mol/L的碘液；
(5)PEG溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
分別取15組具有不同濃度為0、0.5,10.5,20.5,30.5,40.5 l^g/mL的PEG標(biāo)準(zhǔn)溶液
1.0ml，濃度范圍在0-50 u g/ml之間，加入5ml蒸餾水，5%的氯化鋇溶液和碘液各50 yl，反應(yīng)8min，于波長(zhǎng)535nm處測(cè)定光密度值；每個(gè)濃度做三個(gè)平行樣；以上加量可按比例增減；根據(jù)每組PEG濃度與測(cè)得的光密 度值之間的關(guān)系，以PEG濃度為橫坐標(biāo)，光密度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；
(6)交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠中PEG殘留量的計(jì)算
本發(fā)明的用于計(jì)算交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠中PEG殘留量的計(jì)算公式如下:
Y=0.0108X+0.2047 (R2=0.9994)
式中:X——PEG的質(zhì)量濃度(U g/ml)；
Y——碘-氯化鋇-PEG (1:1:1)復(fù)合物在535nm處的光密度值；
(7)交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠中PEG殘留量的測(cè)定方法步驟
按步驟(5)，取步驟(1)交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠樣品預(yù)處理中所得的上清液適量加入蒸餾水、氯化鋇溶液和碘液反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為15min以內(nèi)，于波長(zhǎng)535nm處測(cè)定光密度值，根據(jù)步驟(5)制作的PEG濃度與相應(yīng)光密度值之間的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)應(yīng)關(guān)系曲線或按步驟(6)的計(jì)算公式確定待測(cè)交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠中PEG殘留量。
[0020]實(shí)施例3:
主要儀器:FA1204B型電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-1FD潔凈工作臺(tái)，蘇凈安泰有限公司；722N型可見分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；TGL-16C型菲恰爾離心機(jī)，上海菲恰爾分析儀器有限公司；渦旋振蕩儀，北方同正有限公司；移液器，德國(guó)Eppendorf公司；
(I)樣品預(yù)處理交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠的樣品預(yù)處理:將制備的交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠用10倍體積的95%乙醇醇沉多次，對(duì)所得沉淀干燥并粉碎，將部分粉碎后的顆粒或粉末在110°C復(fù)溶18min，精密稱取復(fù)溶后的凝膠1.0g，加入2 mL無水乙醇，密封，經(jīng)漩渦振蕩器振蕩，使凝膠沉淀，然后于15000r/min離心5min,取上清液待測(cè)；
非交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠的樣品預(yù)處理:將制備的非交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠用10倍體積的95%乙醇醇沉多次，對(duì)所得沉淀干燥并粉碎，將粉碎后的顆?；蚍勰┰?10°C復(fù)溶18min，精密稱取復(fù)溶后的全部凝膠于1000mL燒杯內(nèi)，加入2倍體積(g:mL)無水乙醇，用玻璃棒攪拌使凝膠沉淀，然后將上清液分裝于IOOmL離心管中在15000r/min離心5min，取上清液備用；
(2)PEG標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
PEG2000標(biāo)準(zhǔn)貯存液:精密稱取50mg的PEG2000，加入非交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠的樣品經(jīng)預(yù)處理所制得的上清液中溶解，在IOOmL容量瓶中定容，于4°C冰箱保存?zhèn)溆茫?br> PEG2000標(biāo)準(zhǔn)工作液:吸取PEG2000標(biāo)準(zhǔn)貯存液5mL于50mL容量瓶中，用非交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠的樣品經(jīng)預(yù)處理所制得的上清液定容，質(zhì)量濃度為50|ag/mL ；
(3)氯化鋇溶液的配制
精確稱取5g氯化鋇，加蒸餾水定容至100ml，得到5%的氯化鋇溶液；
(4)碘液的配制
精確稱取碘化鉀2.0g和碘1.3g，加蒸餾水定容至100ml，得到0.05mol/L的碘液；
(T)PEG溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
分別取10組具有不同濃度為0,0.5,10.5,20.5,30.5,40.5 l^g/mL的PEG標(biāo)準(zhǔn)溶液
1.0ml，濃度范圍在0-50 u g/ml之間，加入5ml蒸餾水，5%的氯化鋇溶液和碘液各1000 U 1，反應(yīng)9min，于波長(zhǎng)535nm處測(cè)定光密度值；每個(gè)濃度做三個(gè)平行樣；以上加量可按比例增減；根據(jù)每組PEG濃度與測(cè)得的光密度值之間的關(guān)系，以PEG濃度為橫坐標(biāo)，光密度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；
(6)交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠中PEG殘留量的計(jì)算
本發(fā)明的用于計(jì)算交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠中PEG殘留量的計(jì)算公式如下:
Y=0.0108X+0.2047 (R2=0.9994)
式中:X——PEG的質(zhì)量濃度(U g/ml)；
Y——碘-氯化鋇-PEG (1:1:1)復(fù)合物在535nm處的光密度值；
(7)交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠中PEG殘留量的測(cè)定方法步驟
按步驟(5)，取步驟(1)交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠樣品預(yù)處理中所得的上清液適量加入蒸餾水、氯化鋇溶液和碘液反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為15min以內(nèi)，于波長(zhǎng)535nm處測(cè)定光密度值，根據(jù)步驟(5)制作的PEG濃度與相應(yīng)光密度值之間的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)應(yīng)關(guān)系曲線或按步驟(6)的計(jì)算公式確定待測(cè)交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠中PEG殘留量。
[0021]實(shí)施例4:·主要儀器:FA1204B型電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-1FD潔凈工作臺(tái)，蘇凈安泰有限公司；722N型可見分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；TGL-16C型菲恰爾離心機(jī)，上海菲恰爾分析儀器有限公司；渦旋振蕩儀，北方同正有限公司；移液器，德國(guó)Eppendorf公司；
(I)樣品預(yù)處理
交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠的樣品預(yù)處理:將制備的交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠用12倍體積的無水乙醇醇沉多次，對(duì)所得沉淀干燥并粉碎，將部分粉碎后的顆?；蚍勰┰?15°C復(fù)溶25min，精密稱取復(fù)溶后的凝膠1.0g，加入2 mL無水乙醇，密封，經(jīng)漩渦振蕩器振蕩，使凝膠沉淀，然后于8000r/min離心25min，取上清液待測(cè)；
非交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠的樣品預(yù)處理:將制備的非交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠用10倍體積的無水乙醇醇沉多次，對(duì)所得沉淀干燥并粉碎，將粉碎后的顆?；蚍勰┰?15°C復(fù)溶25min,精密稱取復(fù)溶后的全部凝膠于1000mL燒杯內(nèi)，加入2倍體積(g:mL)無水乙醇,用玻璃棒攪拌使凝膠沉淀，然后將上清液分裝于IOOmL離心管中在8000r/min離心25min，取上清液備用；
(2)PEG標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
PEG8000標(biāo)準(zhǔn)貯存液:精密稱取50mg的PEG8000，加入非交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠的樣品經(jīng)預(yù)處理所制得的上清液中溶解，在IOOmL容量瓶中定容，于4°C冰箱保存?zhèn)溆茫?br> PEG8000標(biāo)準(zhǔn)工作液:吸取PEG8000標(biāo)準(zhǔn)貯存液5mL于50mL容量瓶中，用非交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠的樣品經(jīng)預(yù)處理所制得的上清液定容，質(zhì)量濃度為50|ag/mL ；
G)氯化鋇溶液的配制
精確稱取5g氯化鋇，加蒸餾水定容至100ml，得到5%的氯化鋇溶液；
(4)碘液的配制
精確稱取碘化鉀2.0g和碘1.3g，加蒸餾水定容至100ml，得到0.05mol/L的碘液；
(5)PEG溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
分別取11組具有不同濃度的PEG標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0ml，濃度范圍在0-50 u g/ml之間，加入5ml蒸餾水，5%的氯化鋇溶液和碘液各500 yl，反應(yīng)llmin，于波長(zhǎng)535nm處測(cè)定光密度值；每個(gè)濃度做三個(gè)平行樣；以上加量可按比例增減；根據(jù)每組PEG濃度與測(cè)得的光密度值之間的關(guān)系，以PEG濃度為橫坐標(biāo)，光密度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；
(6)交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠中PEG殘留量的計(jì)算
本發(fā)明的 用于計(jì)算交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠中PEG殘留量的計(jì)算公式如下:
Y=0.0108X+0.2047 (R2=0.9994)
式中:X——PEG的質(zhì)量濃度(U g/ml)；
Y——碘-氯化鋇-PEG (1:1:1)復(fù)合物在535nm處的光密度值；
(7)交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠中PEG殘留量的測(cè)定方法步驟 按步驟(5)，取步驟(I)交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠樣品預(yù)處理中所得的上清液適量加入蒸餾水、氯化鋇溶液和碘液反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為15min以內(nèi)，于波長(zhǎng)535nm處測(cè)定光密度值，根據(jù)步驟(5)制作的PEG濃度與相應(yīng)光密度值之間的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)應(yīng)關(guān)系曲線或按步驟(6)的計(jì)算公式確定待測(cè)交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠中PEG殘留量。
[0022]實(shí)施例5:
主要儀器:FA1204B型電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-1FD潔凈工作臺(tái)，蘇凈安泰有限公司；722N型可見分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；TGL-16C型菲恰爾離心機(jī)，上海菲恰爾分析儀器有限公司；渦旋振蕩儀，北方同正有限公司；移液器，德國(guó)Eppendorf公司；
(I)樣品預(yù)處理
交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠的樣品預(yù)處理:將制備的交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠用9倍體積的95%乙醇醇沉多次，對(duì)所得沉淀干燥并粉碎，將部分粉碎后的顆?；蚍勰┰?20°C復(fù)溶19min，精密稱取復(fù)溶后的凝膠1.0g，加入2 mL無水乙醇，密封，經(jīng)漩渦振蕩器振蕩，使凝膠沉淀，然后于12000r/min離心lOmin，取上清液待測(cè)；
非交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠的樣品預(yù)處理:將制備的非交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠用9倍體積的95%乙醇醇沉多次，對(duì)所得沉淀干燥并粉碎，將粉碎后的顆粒或粉末在120°C復(fù)溶19min，精密稱取復(fù)溶后的全部凝膠于IOOOmL燒杯內(nèi)，加入2倍體積(g:mL)無水乙醇，用玻璃棒攪拌使凝膠沉淀，然后將上清液分裝于IOOmL離心管中在12000r/min離心lOmin，取上清液備用；
(2)PEG標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
PEG10000標(biāo)準(zhǔn)貯存液:精密稱取50mg的PEG10000，加入非交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠的樣品經(jīng)預(yù)處理所制得的上清液中溶解，在IOOmL容量瓶中定容，于4°C冰箱保存?zhèn)溆茫?br> PEG10000標(biāo)準(zhǔn)工作液:吸取PEG10000標(biāo)準(zhǔn)貯存液5mL于50mL容量瓶中，用非交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠的樣品經(jīng)預(yù)處理所制得的上清液定容，質(zhì)量濃度為50|ag/mL ；
(3)氯化鋇溶液的配制
精確稱取5g氯化鋇，加蒸餾水定容至100ml，得到5%的氯化鋇溶液；
(4+)碘液的配制
精確稱取碘化鉀2.0g和碘1.3g，加蒸餾水定容至100ml，得到0.05mol/L的碘液；
(5.1 PEG溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
分別取13組具有不同濃度的PEG標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0ml，濃度范圍在0-50 u g/ml之間，加入5ml蒸餾水，5%的氯化鋇溶液和碘液各750 yl，反應(yīng)13min，于波長(zhǎng)535nm處測(cè)定光密度值；每個(gè)濃度做三個(gè)平行樣；以上加量可按比例增減；根據(jù)每組PEG濃度與測(cè)得的光密度值之間的關(guān)系，以PEG濃度為橫坐標(biāo)，光密度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；
(6)交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠中PEG殘留量的計(jì)算本發(fā)明的用于計(jì)算交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠中PEG殘留量的計(jì)算公式如下:
Y=0.0108X+0.2047 (R2=0.9994)
式中:X——PEG的質(zhì)量濃度(U g/ml)；
Y——碘-氯化鋇-PEG (1:1:1)復(fù)合物在535nm處的光密度值；
(7)交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠中PEG殘留量的測(cè)定方法步驟
按步驟(5)，取步驟(1)交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠樣品預(yù)處理中所得的上清液適量加入蒸餾水、氯化鋇溶液和碘液反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為15min以內(nèi)，于波長(zhǎng)535nm處測(cè)定光密度值，根據(jù)步驟(5)制作的PEG濃度與相應(yīng)光密度值之間的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)應(yīng)關(guān)系曲線或按步驟(6)的計(jì)算公式確定待測(cè)交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠中PEG殘留量。
[0023] 實(shí)施例6:
主要儀器:FA1204B型電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-1FD潔凈工作臺(tái)，蘇凈安泰有限公司；722N型可見分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；TGL-16C型菲恰爾離心機(jī)，上海菲恰爾分析儀器有限公司；渦旋振蕩儀，北方同正有限公司；移液器，德國(guó)Eppendorf公司；
(T〗樣品預(yù)處理
交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠的樣品預(yù)處理:將制備的交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠用13倍體積的無水乙醇醇沉多次，對(duì)所得沉淀干燥并粉碎，將部分粉碎后的顆?；蚍勰┰?24°C復(fù)溶lOmin，精密稱取復(fù)溶后的凝膠1.0g，加入2 mL無水乙醇，密封，經(jīng)漩渦振蕩器振蕩，使凝膠沉淀，然后于18000r/min離心3min，取上清液待測(cè)；
非交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠的樣品預(yù)處理:將制備的非交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠用13倍體積的95%乙醇醇沉多次，對(duì)所得沉淀干燥并粉碎，將粉碎后的顆粒或粉末在124°C復(fù)溶lOmin，精密稱取復(fù)溶后的全部凝膠于1000mL燒杯內(nèi)，加入2倍體積(g:mL)無水乙醇，用玻璃棒攪拌使凝膠沉淀，然后將上清液分裝于IOOmL離心管中在18000r/min離心3min，取上清液備用；
⑵PEG標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
PEG16000標(biāo)準(zhǔn)貯存液:精密稱取50mg的PEG16000，加入非交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠的樣品經(jīng)預(yù)處理所制得的上清液中溶解，在IOOmL容量瓶中定容，于4°C冰箱保存?zhèn)溆茫? PEG16000標(biāo)準(zhǔn)工作液:吸取PEG16000標(biāo)準(zhǔn)貯存液5mL于50mL容量瓶中，用非交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠的樣品經(jīng)預(yù)處理所制得的上清液定容，質(zhì)量濃度為50|ag/mL ；
(3)氯化鋇溶液的配制
精確稱取5g氯化鋇，加蒸餾水定容至100ml，得到5%的氯化鋇溶液；
(T)碘液的配制
精確稱取碘化鉀2.0g和碘1.3g，加蒸餾水定容至100ml，得到0.05mol/L的碘液；
(5)PEG溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作分別取9組具有不同濃度的PEG標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0ml，濃度范圍在0_50 μ g/ml之間，加入5ml蒸餾水，5%的氯化鋇溶液和碘液各200 μ 1，反應(yīng)lOmin，于波長(zhǎng)535nm處測(cè)定光密度值；每個(gè)濃度做三個(gè)平行樣；以上加量可按比例增減；根據(jù)每組PEG濃度與測(cè)得的光密度值之間的關(guān)系，以PEG濃度為橫坐標(biāo)，光密度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；
(6)交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠中PEG殘留量的計(jì)算
本發(fā)明的用于計(jì)算交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠中PEG殘留量的計(jì)算公式如下:
Y=0.0108X+0.2047 (R2=0.9994)
式中:X——PEG的質(zhì)量濃度(μ g/ml)； Y——碘-氯化鋇-PEG (1:1:1)復(fù)合物在535nm處的光密度值；
(7)交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠中PEG殘留量的測(cè)定方法步驟
按步驟(5)，取步驟(1)交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠樣品預(yù)處理中所得的上清液適量加入蒸餾水、氯化鋇溶液和碘液反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為15min以內(nèi)，于波長(zhǎng)535nm處測(cè)定光密度值，根據(jù)步驟(5)制作的PEG濃度與相應(yīng)光密度值之間的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)應(yīng)關(guān)系曲線或按步驟(6)的計(jì)算公式確定待測(cè)交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠中PEG殘留量。
[0024] 本發(fā)明不限于上述操作，所有在本發(fā)明的實(shí)質(zhì)范圍內(nèi)作出的變化、改型、添加或替換，都應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種測(cè)定交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠中聚乙二醇?xì)埩袅康姆椒?，包括以下工藝步驟: (I)樣品預(yù)處理 交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠的樣品預(yù)處理:將PEG交聯(lián)的透明質(zhì)酸鈉凝膠用7-14倍體積的95%乙醇或無水乙醇醇沉多次，對(duì)所得沉淀干燥并粉碎，將部分粉碎后的顆?；蚍勰┰?08-124°C下復(fù)溶10-30min，精密稱取復(fù)溶后的凝膠1.0g，加入2 mL無水乙醇，密封，經(jīng)漩渦振蕩器振蕩，使凝膠沉淀，然后于5000-1800()r/min離心3_30min，取上清液待測(cè)； 非交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠的樣品預(yù)處理:將非交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠用7-14倍體積的95%乙醇或無水乙醇醇沉多次，對(duì)所得沉淀干燥并粉碎，將粉碎后的顆粒或粉末在108-124°C復(fù)溶10-30min,精密稱取復(fù)溶后的全部凝膠于1000mL燒杯內(nèi)，加入2倍體積(g:mL)無水乙醇，用玻璃棒攪拌使凝膠沉淀，然后將上清液分裝于IOOmL離心管中在5000-18000r/min離心3-30min,取上清液備用； (2)PEG標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 PEG600-20000標(biāo)準(zhǔn)貯存液:精密稱取50mg的PEG600-20000，加入非交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠樣品經(jīng)預(yù)處理所制得的上清液中溶解，在IOOmL容量瓶中定容，于4°C冰箱保存?zhèn)溆茫? PEG600-20000標(biāo)準(zhǔn)工作液:吸取PEG600-20000標(biāo)準(zhǔn)貯存液5mL于50mL容量瓶中，用非交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠樣品經(jīng)預(yù)處理所制得的上清液定容，質(zhì)量濃度為50|ag/mL ； (3)氯化鋇溶液的配制 精確稱取5g氯化鋇，加蒸餾水定容至100ml，得到5%的氯化鋇溶液； (4)碘液的配制 精確稱取碘化鉀2.0g和碘1.3g，加蒸餾水定容至100ml，得到0.05mol/L的碘液； (5)PEG溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 分別取6-15組具有不同濃度為0,0.5、10.5,20.5,30.5,40.5 l^g/mL的PEG標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0ml,濃度范圍在0-50ii g/ml之間，加入5ml蒸餾水，5%的氯化鋇溶液和碘液各50-1000 iil，反應(yīng)8-15min，于波長(zhǎng)535nm處測(cè)定光密度值；每個(gè)濃度做三個(gè)平行樣；以上加量可按比例增減；根據(jù)每組PEG濃度與測(cè)得的光密度值之間的關(guān)系，以PEG濃度為橫坐標(biāo)，光密度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線； (6)交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠中PEG殘留量的計(jì)算 本發(fā)明的用于計(jì)算交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠中PEG殘留量的計(jì)算公式如下:
Y=0.0108X+0.2047 (R2=0.9994) 式中:X——PEG的質(zhì)量濃度(U g/ml)； Y——碘-氯化鋇-PEG (1:1:1)復(fù)合物在535nm處的光密度值； (7)交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠中PEG殘留量的測(cè)定方法步驟 按步驟(5)，取步驟(1)交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠樣品預(yù)處理中所得的上清液適量加入一定量的蒸餾水、氯化鋇溶液和碘液反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為15min以內(nèi)，于波長(zhǎng)535nm處測(cè)定光密度值，根據(jù)步驟(5)制作的PEG濃度與相應(yīng)光密度值之間的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)應(yīng)關(guān)系曲線或按步驟(6)的計(jì)算公式確定待測(cè)交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠中PEG殘留量。
2.據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠中聚乙二醇?xì)埩袅康姆椒?，其特征?所述步驟0)中對(duì)交聯(lián)凝膠所進(jìn)行的預(yù)處理是用95%的乙醇或無水乙醇醇沉交聯(lián)凝膠，用離心后所得到的上清液來檢測(cè)交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠中的PEG殘留量。
3.據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠中聚乙二醇?xì)埩袅康姆椒?，其特征?所述步驟?中所配制的PEG標(biāo)準(zhǔn)溶液的溶劑為步驟—V中非交聯(lián)凝膠經(jīng)與交聯(lián)凝膠相同體積份數(shù)的95%乙醇或無水乙醇醇沉得到的上清液，非交聯(lián)凝膠除了在制備過程中未加入交聯(lián)劑PEG外，其他步驟均相同，所以，所配制的PEG標(biāo)準(zhǔn)溶液與所要檢測(cè)殘留量的上清液除了 PEG含量有所不同外，其他的組分都一樣。
4.據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠中聚乙二醇?xì)埩袅康姆椒?，其特征?所述步驟5: PEG溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作中的空白對(duì)照為步驟1:中非交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠經(jīng)95%乙醇或無水乙醇醇沉并離心所得的上清液，但步驟?中標(biāo)準(zhǔn)PEG溶液要依次加入5ml蒸餾水，5%的氯化鋇溶液和碘液，而空白對(duì)照則是對(duì)非交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠經(jīng)95%乙醇醇沉并離心所得的上清液補(bǔ)加蒸餾水至體積與標(biāo)準(zhǔn)PEG溶液梯度系列相等。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠中聚乙二醇?xì)埩袅康姆椒ǎ涮卣魇?所述的可測(cè)定的PEG的分子`量范圍為600-20000Da。
【文檔編號(hào)】G01N1/28GK103630536SQ201310657504
【公開日】2014年3月12日 申請(qǐng)日期:2013年12月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月9日
【發(fā)明者】趙永亮, 王衛(wèi)國(guó), 王化鵬, 孟甜甜, 丁金聚, 彎家立, 賈柯, 張鵬, 穆甲俊, 陶宜辰 申請(qǐng)人:河南工業(yè)大學(xué), 趙永亮