金黃色葡萄球菌疫苗成品的解離及含量測定方法和檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術領域】，提供了一種疫苗成品的解離及抗原含量測定的方法和檢測試劑盒。該方法能夠?qū)崿F(xiàn)蛋白抗原與佐劑的快速完全解離，同時對疫苗成品中的復雜抗原進行定量檢測，解決了疫苗研發(fā)中抗原解離和成品抗原含量測定中存在的問題。
【專利說明】金黃色葡萄球菌疫苗成品的解離及含量測定方法和檢測試劑盒
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術領域】，涉及疫苗成品的解離及抗原含量測定方法。
【背景技術】
[0002]金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, SA),以下簡稱金葡菌,有“嗜肉菌”的別稱。作為革蘭氏陽性菌的代表，它是引起醫(yī)院感染和社區(qū)感染的一種重要致病菌。感染以急性、化膿性炎癥為特征，局部感染可引起皮膚和軟組織等的化膿性感染，經(jīng)久不愈；全身感染可導致骨髓炎、膿毒性關節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、肺炎、膿毒血癥等嚴重感染及并發(fā)癥，死亡率高達20%。同時，金葡菌的外毒素還可引起食物中毒、燙傷樣皮膚綜合征和中毒性休克綜合征等全身致死性感染。因此，加強對金葡菌感染的免疫防治研究，研制安全、有效的新型金葡菌基因工程疫苗將對有效控制金葡菌耐藥性蔓延和臨床金葡菌廣泛感染具有重要的戰(zhàn)略及現(xiàn)實意義。
[0003]隨著抗生素長期、廣泛地使用，細菌耐藥性問題日益突出，作為典型代表的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)自 1961 年被首次發(fā)現(xiàn)至今，目前已成為全球ICU病房、術后感染、燒傷、戰(zhàn)創(chuàng)傷等感染率最高的醫(yī)院內(nèi)感染病原菌之一。同時，因其致病性強、傳播途徑廣泛、易暴發(fā)流行，且呈多重耐藥性發(fā)展而成為臨床上治療的難點，被稱為“第一超級細菌”。
[0004]本發(fā)明人采用反向疫苗學技術，成功的從金黃色葡萄球菌ATCC國際標準株MRSA252中篩選到了疫苗候選抗原，這些抗原包括H1、mSEB、SpA5和MntC。將這些蛋白抗原在組氣fe緩沖液的存在下與憐fe招佐劑吸附后制備成的疫苗成品免疫動物后，保護率在85%以上，有效性遠遠高于國內(nèi)外同類產(chǎn)品研究水平。
[0005]在重組蛋白類疫苗的研發(fā)中，蛋白抗原與佐劑吸附后的穩(wěn)定性也是必須的檢測指標，這就需要準確測定疫苗成品中的抗原含量。而疫苗成品多是抗原蛋白與佐劑吸附后的膠體狀復合物，如何采用適當?shù)姆椒ㄗ尩鞍卓乖c佐劑完全解離且不破壞抗原的性質(zhì)，是需要重點解決的難題。目前的報道中，有采用檸檬酸鈉、鹽酸胍等方法將蛋白與佐劑解離的方法，但普遍存在解離不完全，解離時間偏長等問題。同時，如果要測定蛋白類疫苗成品中抗原的含量，常采用的方法是將抗原與佐劑解離后，采用SDS-PAGE、ELISA或者HPLC等方法鑒定。但本發(fā)明的重組金黃色葡萄球菌疫苗抗原成分復雜，而且其中幾個蛋白質(zhì)的分子量接近，采用SDS-PAGE法測定時分子量相近的蛋白容易疊加在一起，采用HPLC測定時也存在幾個峰融合的現(xiàn)象，不容易準確定量測定。采用ELISA測定需要相應的四個蛋白的單抗，研發(fā)成本提高，周期延長。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]鑒于上述存在的具體問題，本發(fā)明提供一種快速有效解離疫苗成品并檢測抗原含量的方法。[0007]本發(fā)明的方法包括以下步驟:
[0008](I)將解離液與疫苗溶液以0.5~2:1的體積比混合；其中所述解離液是
1.5-2.5M的碳酸鈉溶液；優(yōu)選地，所述解離液的濃度是2M,與疫苗溶液的體積比是1:1;
[0009](2)測定抗原含量；優(yōu)選地，使用針對不同抗原的抗血清，對不同濃度的抗原標準品及成品解離后樣品同時進行蛋白質(zhì)印跡檢測，通過酶學反應的顯色，結(jié)合灰度掃描儀對各條帶進行灰度掃描，建立標準曲線，得到灰度值與抗原濃度之間的關系，通過回歸方程求得成品中所含抗原的含量。
[0010]優(yōu)選地，所述疫苗成品中包含抗原和佐劑。
[0011]優(yōu)選地，所述疫苗成品中包含多種抗原，如2、3、4、5、6種抗原。
[0012]在另一方面，本發(fā)明提供一種用于本發(fā)明方法的試劑盒，所述試劑盒包括:解離液和抗原含量測定試劑。優(yōu)選地，所述解離液是1.5-2.5M的碳酸鈉溶液；進一步優(yōu)選地，所述解離液是2M的碳酸鈉溶液；所述抗原含量測定試劑是蛋白質(zhì)印跡檢測試劑。
[0013]通過該方法能夠?qū)崿F(xiàn)蛋白抗原與佐劑的快速完全解離，同時對疫苗成品中的復雜抗原進行定量檢測，解決了疫苗研發(fā)中在抗原解離和成品抗原含量測定的問題。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1、實施例1的蛋白抗原與佐劑的解離時間的確定…為蛋白質(zhì)分子量標準，1、2和3分別為解離10、20和30min結(jié)果。
[0015]圖2、本發(fā)明的解離方法與其它解離方法的比較:M為蛋白質(zhì)分子量標準，1、2、3和4分別為檸檬酸鈉、鹽酸胍、檸檬酸和`碳酸鈉解離法。
[0016]圖3、實施例2的蛋白質(zhì)印跡檢測疫苗抗原的結(jié)果。
[0017]圖4、實施例2的四種抗原標準品濃度與灰度值的標準曲線。
【具體實施方式】
[0018]經(jīng)過多方面的摸索，發(fā)明人采用碳酸鈉成功實現(xiàn)了蛋白抗原與佐劑的成功解離問題，整個過程在IOmin內(nèi)完成。同時，在抗原含量測定方面，采用四種抗原的兔抗血清，對不同濃度的抗原標準品及成品解離后樣品同時進行蛋白質(zhì)印跡檢測，通過酶學反應的顯色，結(jié)合灰度掃描儀對各條帶進行灰度掃描，建立標準曲線，得到灰度值與抗原濃度之間的關系，通過回歸方程求得成品中所含抗原的含量。該方法操作簡便，重復性好，可以實現(xiàn)疫苗成品抗原含量的定量檢測。
[0019]以下實施例所使用的抗原蛋白與各種試劑如下:
[0020]I)實驗材料
[0021]重組金黃色葡萄球菌疫苗四種抗原原液，四種抗原分別為SpA5 (SEQ ID N0.1)、MntC (SEQ ID N0.2)、mSEB (SEQ ID N0.3)和 HI (SEQ ID N0.4)，各蛋白原液濃度為 50 μ g/ml ；
[0022]上述的四組分重組金黃色葡萄球菌疫苗成品，其中各組分濃度為50 μ g/ml ；
[0023]分別針對四種抗原的兔多抗血清:采用重組金黃色葡萄球菌疫苗成品按照D0，D14，D21的免疫程序免疫新西蘭大耳白兔三次，末次免疫后14天采血所得。
[0024]2)實驗儀器[0025]純水儀(ELGA)、電子天平(Mettler Toledo)、灌膠模具(B10RAD)、蛋白凝膠成像儀(BIORAD)、電泳裝置(BIORAD)、半干膠轉(zhuǎn)移儀(BIORAD)
[0026]3)實驗試劑
[0027]三羥甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸、甲醇、氯化鈉、鹽酸、吐溫20、脫脂奶粉、DAB顯色液試劑盒、30%丙烯酰胺、過硫酸銨、1.5MTris-HCl (pH8.8)、10%SDS、10%過硫酸銨、TEMEDU.0MTris-HCl (pH6.8)、5X蛋白上樣緩沖液，PVDF膜(Milipore)，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG 二抗(BD公司)。
[0028]4)試劑配制
[0029]解離液:2M碳酸鈉；
[0030]電轉(zhuǎn)緩沖液:稱取Tris3.03g與甘氨酸14.41g，200ml甲醇，加水定容至1L，4°C保存；
[0031]10XTBS緩沖液:稱取Tris24.228g與氯化鈉87.75g，加適量水溶解，用鹽酸將pH值至7.5，加水稀釋至1L，4°C保存；
[0032]TBST洗滌液:將10XTBS緩沖液稀釋成I XTBS緩沖液，加入0.5%吐溫20，配成IXTBST洗滌液；
[0033]10X SDS-PAGE電泳緩沖液:稱取Tris3.03g與甘氨酸14.41g，SDSlg，加雙蒸水溶解，定容至IL ；
[0034]5X 蛋白上樣緩沖液:250mM Tris-HCl (pH6.8),10% (ff/V)SDS,0.5% (W/V)溴酚藍、50% (V/V)甘油、5% (W/V)P-巰基乙醇；
[0035]封閉液:5%(w/v)脫脂奶粉溶于IOOmmoI/L TTBS (Tris (pH7.5)，吐溫 200.1%(ν/V), NaCl0.9% (w/v))。
[0036]實施例1:蛋白抗原與佐劑的解離時間的確定
[0037]以重組金黃色葡萄球菌疫苗為例，取疫苗成品一支，取其中的疫苗成品600μ L在5000rpm下常溫離心lOmin，吸棄上清300 μ L后加入300 μ L的解離液(2Μ Na2CO3),常溫混懸處理，震蕩時間分別為10min、20min和30min，靜置5min后取上清40 μ L加入10 μ L的5Χ蛋白上樣緩沖液進行SDS-PAGE電泳。結(jié)果如圖1所示:解離時間為10min、20min和30min后，電泳結(jié)果各個條帶粗細很相似，從上往下依次為HI (48.2kDa)，MntC (32.9kDa)，SpA5 (32.7kDa)和mSEB (28.lkDa)，解離情況和時間沒有明顯差別，因此確定最終的解離時間為IOmin。
[0038]實施例2:本發(fā)明解離方法與其它解離方法的比較
[0039]本發(fā)明解離方法采用實施例1中的解離方法，解離時間為lOmin。采用的對照方法與上面的解離操作一致，只是加入的解離液的配方和解離時間不一樣。對照方法有三種，具體如下:①IM的檸檬酸鈉，常溫解離Ih 2M鹽酸胍，常溫過夜解離0.1M的檸檬酸，常溫解離lh。結(jié)果如圖2所示:與對照方法相比，碳酸鈉解離后的抗原蛋白電泳條帶明顯比其它方法明顯，說明其解離更為完全。更為重要的是，本發(fā)明方法的解離時間更短，方便操作。這些結(jié)果表明，本發(fā)明的方案與現(xiàn)有報道的方法相比更有優(yōu)勢。
[0040]實施例2:疫苗成品抗原含量的測定
[0041]方法:
[0042]電泳樣品的制備:取適量抗原原液，用雙蒸水稀釋至濃度分別為10yg/mL、30 μ g/mL>50 μ g/mL>70 μ g/mL>90 μ g/mL,加入5X蛋白上樣緩沖液至蛋白上樣緩沖液濃度為1X，100°C加熱5分鐘。同時取疫苗成品一支，混勻后吸取600yL與1.5mL EP管中，5000rpm離心lOmin，吸取上清300 μ L去掉，加入2Μ的Na2CO3溶液300 μ L并混勻，待溶液清亮后離心取適量上清，加入5Χ蛋白上樣緩沖液，100°C加熱5分鐘。
[0043]SDS-PAGE電泳:各濃度抗原上樣量均為20 μ I，將電壓調(diào)至80ν電泳約20分鐘，將電壓調(diào)至160ν電泳至溴酚藍離玻璃板邊緣約0.5ml處停止電泳。
[0044]轉(zhuǎn)膜:將2塊濾紙塊用電轉(zhuǎn)緩沖液浸透，PVDF膜I張用甲醇浸濕，用半干膠轉(zhuǎn)移儀進行轉(zhuǎn)移，電壓20V，轉(zhuǎn)膜20分鐘。
[0045]印跡反應:轉(zhuǎn)膜后取出PVDF膜，用TBST洗滌液，洗膜3次，每次10分鐘。將PVDF膜置于封閉液中，4°C封閉過夜。取出PVDF膜，用TBST洗滌液，洗膜3次，每次10分鐘。用IXTBS緩沖液將自制一抗(兔多抗)稀釋5000倍，將封閉完成的PVDF膜置于一抗中37°C孵育I小時。取出PVDF膜，用TBST洗滌液，洗膜3次，每次10分鐘。用I X TBS緩沖液將辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗稀釋5000倍，將PVDF膜置于二抗中37°C孵育40分鐘。取出PVDF膜，用TBST洗滌液，洗膜4次，每次10分鐘。按照DAB顯色液試劑盒說明書進行顯色，顯色程度適當時水洗終止反應。結(jié)果判定:抗原標準品結(jié)果應呈現(xiàn)明顯漸粗色帶，采用蛋白凝膠成像儀對其進行灰度掃描，建立標準曲線，求得疫苗成品中所含各種抗原的含量。
[0046]結(jié)果:
[0047]米用不同濃度(10μ g/ml, 30 μ g/ml, 50 μ g/ml, 70 μ g/ml, 90 μ g/ml)的抗原標準品作為對照，進行蛋白質(zhì)印跡檢測，結(jié)果如圖3所示，通過與不同抗原制備的兔多抗均能發(fā)生明顯的顯色反應，在相應的分子量位置出現(xiàn)明顯的顯色帶。隨著各種抗原濃度的增加，條帶的大小呈現(xiàn)出明顯的梯度。
[0048]通過凝膠成像儀對各個條帶進行灰度值掃描，得到表1結(jié)果。同時根據(jù)灰度值與抗原濃度的對應關系制備標準曲線，得到圖4的結(jié)果，結(jié)果表明:不同抗原標準品蛋白質(zhì)印跡條帶灰度值與其濃度之間存在明顯的直線相關，相關系數(shù)R2值均在0.98以上，可用于疫苗成品中抗原含量的測定。
[0049]表1:不同抗原標準品蛋白質(zhì)印跡條帶灰度值掃描結(jié)果
【權利要求】
1.一種疫苗成品的解離及抗原含量測定的方法，包括: (1)將解離液與疫苗溶液以0.5?2:1的體積比混合，其中所述解離液是1.5-2.5M的碳酸鈉溶液； (2)測定疫苗成品中抗原含量。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，所述測定疫苗成品中抗原含量的過程為:使用針對不同抗原的抗血清，對不同濃度的抗原標準品及成品解離后樣品同時進行蛋白質(zhì)印跡檢測，通過酶學反應的顯色，結(jié)合灰度掃描儀對各條帶進行灰度掃描，建立標準曲線，得到灰度值與抗原濃度之間的關系，通過回歸方程求得成品中所含抗原的含量。
3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，所述解離液的濃度是2M，與疫苗溶液的體積比是1:1。
4.根據(jù)權利要求1-3任一項所述的方法，其中，所述疫苗成品中包含抗原和佐劑。
5.根據(jù)權利要求4所述的方法，其中所述疫苗成品中包含多種抗原。
6.一種用于如權利要求1-5任一項所述的疫苗成品的解離及抗原含量測定方法的試劑盒，包括解離液和抗原含量測定試劑，其中所述解離液是1.5-2.5M的碳酸鈉溶液。
7.根據(jù)權利要求6所述的試劑盒，其中，所述抗原含量測定試劑是蛋白質(zhì)印跡檢測試劑。
8.根據(jù)權利要求6所述的試劑盒，其中，所述解離液是1.5-2.5M的碳酸鈉溶液。
【文檔編號】G01N33/15GK103698175SQ201310664290
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月9日 優(yōu)先權日:2013年12月9日
【發(fā)明者】章金勇, 趙莉群, 蔡昌芝, 董衍東, 鄒全明, 曾浩, 紀永軍 申請人:重慶原倫生物科技有限公司, 中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學