一種中華鱉脂肪酸分析方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及水生生物、分析化學(xué)領(lǐng)域，具體說(shuō)的是一種通過(guò)（氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜）GC-MS結(jié)合保留指數(shù)分離鑒定中華鱉體內(nèi)脂肪酸的組成的方法。分離中華鱉脂肪組織，并對(duì)其中脂肪酸提取、衍生制備成脂肪酸甲酯。其分離鑒定方法為：將中華鱉脂肪酸甲酯溶與正己烷中，用GC-MS分析，達(dá)到分離的目的，根據(jù)不同脂肪酸甲酯的保留時(shí)間計(jì)算其保留指數(shù)，質(zhì)譜庫(kù)搜庫(kù)同時(shí)結(jié)合保留指數(shù)定性，面積歸一化法計(jì)算各脂肪酸甲酯的相對(duì)含量，達(dá)到準(zhǔn)確、快速分析中華鱉脂肪酸組成的目的。本發(fā)明的特點(diǎn)：充分利用質(zhì)譜庫(kù)搜庫(kù)結(jié)合保留指數(shù)定性的方法，可準(zhǔn)確的鑒定中華鱉體內(nèi)脂肪酸的組成，尤其是操作簡(jiǎn)便，結(jié)果比質(zhì)譜庫(kù)搜庫(kù)的方法更準(zhǔn)確。
【專利說(shuō)明】一種中華鱉脂肪酸分析方法
[0001]【技術(shù)領(lǐng)域】:本分明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，特別涉及采用氣相色譜質(zhì)譜結(jié)合保留指數(shù)法進(jìn)行中華鱉脂肪酸分析的方法。
[0002]【背景技術(shù)】:
中華鱉隸屬爬行綱、龜鱉目、鱉科、鱉屬，廣泛分布于我國(guó)除新疆、西藏，青海以外的其他省份，為我國(guó)名貴的水生爬行動(dòng)物。中華鱉肉質(zhì)細(xì)嫩、營(yíng)養(yǎng)豐富、高蛋白，備受?chē)?guó)內(nèi)外消費(fèi)者的青睞。中華鱉除了營(yíng)養(yǎng)美味外，還具有較高的藥用價(jià)值。據(jù)《名醫(yī)別錄》記載，鱉性味甘，平，有滋陰補(bǔ)腎，清退虛熱的功效，鱉甲、鱉血更具有治療陰虛以及補(bǔ)血的藥用功效，為食療佳品。中華鱉脂肪中富含EPA、DHA等不飽和脂肪酸，具有抗癌、促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育、增強(qiáng)記憶力等功效，臨床上已被用于治療高血壓、糖尿病等疾病。白晶等采用超臨界C02萃取技術(shù)，利用低溫濃縮工藝從中華鱉油中提取到DHA和EPA，得到中華鱉油中EPA+DHA的含量為26.39%0L1-Hsun Chang等用超臨界C02法從中華鱉脂肪酸中提取不飽和脂肪酸，Chen-HueiHuang等發(fā)現(xiàn)中華鱉自身可以合成18個(gè)碳以下的脂肪酸，但是不能合成高不飽和度的脂肪酸，同時(shí)發(fā)現(xiàn)中華鱉體內(nèi)不飽和脂肪酸占總脂肪酸的70%以上。通過(guò)分析中華鱉脂肪中脂肪酸的組成尤其是不飽和脂肪酸的組成，為中華鱉脂肪的合理利用提供依據(jù)。
[0003]氣相色譜質(zhì)譜(GC-MS)結(jié)合質(zhì)譜譜庫(kù)檢索方法是將組分的質(zhì)譜峰與質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)圖譜進(jìn)行匹配比對(duì)，以匹配度高的化合物作為鑒定結(jié)果，已被廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物脂肪酸的分析。由于脂肪酸種類較多，從結(jié)構(gòu)上分類主要有直鏈脂肪酸、支鏈脂肪酸和復(fù)雜形勢(shì)的脂肪酸三種類型，脂肪酸的鏈長(zhǎng)、雙鍵位置和數(shù)量以及取代基團(tuán)不同均會(huì)導(dǎo)致分離的不準(zhǔn)確，尤其是長(zhǎng)鏈脂肪酸結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜經(jīng)常會(huì)有同分異構(gòu)體存在，以及受分離度和色譜條件變化等因素的影響，會(huì)使脂肪酸的質(zhì)譜圖檢索結(jié)果出現(xiàn)偏差，使得難以準(zhǔn)確定性，甚至出現(xiàn)錯(cuò)誤。為提高鑒定的準(zhǔn)確性，采用保留指數(shù)和質(zhì)譜檢索相結(jié)合的改良方法可顯著越來(lái)越多地應(yīng)用于定性定量分析中。采用液-液萃取法從中華鱉脂肪中提取脂肪酸并進(jìn)行甲酯化衍生，然后通過(guò)氣相色譜質(zhì)譜(GC-MS)譜庫(kù)檢索結(jié)合保留指數(shù)，對(duì)中華鱉的脂肪酸進(jìn)行定性定量分析，以鑒別中華鱉脂肪中的脂肪酸組成。
[0004]
【發(fā)明內(nèi)容】
:
本發(fā)明氣相色譜質(zhì)譜結(jié)合保留指數(shù)分析方法分析中華鱉脂肪，得到了其精確地脂肪酸總離子流色譜圖、相應(yīng)的質(zhì)譜圖和保留指數(shù)。通過(guò)比較脂肪酸甲酯的質(zhì)譜譜庫(kù)結(jié)構(gòu)和相應(yīng)的保留指數(shù)，可以對(duì)中華鱉脂肪酸進(jìn)行定性分析。
[0005]本發(fā)明的方法包括以下步驟:一種中華鱉脂肪酸分析方法，包括以下步驟:
(1)中華鱉宰殺后取脂肪組織10g，-18 °C保存；
(2)稱取甲魚(yú)脂肪Ig，碾碎后放入10 mL玻璃試管中，加入10 mL提取液，混勻后密封浸提24 h;提取完成后，用不含脂肪的濾紙過(guò)濾，再加入5 mL提取液沖洗殘?jiān)?次濾液合并保存；所述提取液為體積比為2:1的氯仿:甲醇；
(3)取脂肪提取液5mL，加入3 mL 10% KOH甲醇溶液，混勻后，置于80 1:水浴反應(yīng)Ih;室溫冷卻后，加入3 mL 14% BF3甲醇溶液(v/v)混勻后，于50 1:水浴反應(yīng)10 min ;冷卻后，加入3 mL正己烷，震蕩渦旋，室溫靜置過(guò)夜；取上層正己烷層至進(jìn)樣小瓶，-18 °C冷凍，待GC-MS分析； (4)將進(jìn)樣瓶中的脂肪酸甲酯進(jìn)行氣相色譜質(zhì)譜分析，色譜條件:色譜柱為安捷倫DB-5MS石英毛細(xì)管柱30.0 mX0.25 mmX0.25 μ m ;載氣為高純氦氣；流速I(mǎi) mL/min ;程序升溫:60 °C保持I min,以10 V /min升至160 °C并保持4 min,以5°C /min升至260 V并保持5min,以5 °C/min升至280 °C并保持I min ;分流比20:1 ;進(jìn)樣量I μ L ;質(zhì)譜條件=EI離子源；電子能量70 eV ;離子源溫度220 V ;進(jìn)樣口溫度240°C，質(zhì)量掃描范圍:m/z 40~600 ;溶劑切除時(shí)間2.5 min。
[0006]在進(jìn)行氣相色譜質(zhì)譜分析之后，還包括對(duì)分析的脂肪酸甲酯計(jì)算保留指數(shù)進(jìn)行計(jì)算的步驟:
(1)將正構(gòu)烷烴混合標(biāo)準(zhǔn)品(C8-C40)以脂肪酸甲酯分析的條件進(jìn)行氣相色譜質(zhì)譜分
析；
(2)記錄每個(gè)正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間；采用保留指數(shù)的線性升溫公式:i?/ = 100?+100^^計(jì)算各組分的RI值，其中^,、、和t(n+1)分別為被分析組分和碳原
in In
子數(shù)處于η和η+1之間的正構(gòu)烷烴混標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品的流出峰保留時(shí)間(min)；
(3)根據(jù)http://webbook.nist.gov/chemistry/搜索文獻(xiàn)得相應(yīng)色譜柱各脂肪酸甲酯的保留指數(shù)RI，結(jié)合質(zhì)譜庫(kù)檢索，同時(shí)運(yùn)用面積歸一化法計(jì)算各脂肪酸的相對(duì)百分含量。
[0007]本發(fā)明的方法不僅可以打破常規(guī)的氣相色譜質(zhì)譜定性的局限，減少因?yàn)橘|(zhì)譜庫(kù)不全或相似度接近對(duì)中華鱉脂肪酸分析帶來(lái)的誤差，同時(shí)為其他生物的脂肪酸分析鑒定提供方便、準(zhǔn)確的定性方法，而且還能夠應(yīng)用該方法鑒定其他氣相色譜質(zhì)譜難以準(zhǔn)確定性的物質(zhì)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0008]圖1中華鱉脂肪酸甲酯總離子流圖 【具體實(shí)施方式】:
以下提供本發(fā)明一種中華鱉脂肪酸分析方法的【具體實(shí)施方式】。
[0009]實(shí)施例1
采用本發(fā)明方法分析了鄱陽(yáng)湖中華鱉脂肪酸的組成，隨機(jī)抽取健康鄱陽(yáng)湖中華鱉一只，體重約500g，宰殺后取其四肢周?chē)窘M織冷凍備用。
[0010]脂肪提取:稱取中華鱉脂肪I g，碾碎后放入10 mL玻璃試管中，加入10 mL提取液(氯仿:甲醇=2:1，v/v)，混勻后密封浸提24 h。提取完成后，用不含脂肪的濾紙過(guò)濾，再加入5 mL提取液沖洗殘?jiān)?次濾液合并保存。
[0011]脂肪酸甲酯化:取上述脂肪提取液5 mL，加入3 mL 10% KOH甲醇溶液(v/v)，混勻后,置于80 °(:水浴反應(yīng)I h。室溫冷卻后,加入3 mL 14% BF3甲醇溶液(v/v),混勻后，于50 1:水浴反應(yīng)10 min。冷卻后，加入3 mL正己烷，震蕩渦旋，室溫靜置過(guò)夜。取上層正己烷層至進(jìn)樣小瓶，-18 °C冷凍，GC-MS分析。
[0012]氣相色譜質(zhì)譜儀器條件如下:GC/MS為QP2010型，是島津公司的產(chǎn)品
色譜條件:色譜柱為安捷倫DB-5MS石英毛細(xì)管柱(30.0 mX0.25 mmX0.25 μ m);載氣為高純氦氣；流速I(mǎi) mL/min ;程序升溫:60 °C保持I min,以10 V /min升至160。(!'并保持4 min,以5°C /min升至260 °C并保持5min,以5 °C /min升至280 °C并保持I min ；分流比20:1;進(jìn)樣量I yL。
[0013]質(zhì)譜條件:EI離子源；電子能量70 eV;離子源溫度220 °C;進(jìn)樣口溫度240°C，質(zhì)量掃描范圍:m/z 40~600 ;溶劑切除時(shí)間2.5 min。
[0014]采用保留指數(shù)的線性升溫公式:
【權(quán)利要求】
1.一種中華鱉脂肪酸分析方法，包括以下步驟: (1)中華鱉宰殺后取脂肪組織10g，-18 °C保存； (2)稱取甲魚(yú)脂肪Ig，碾碎后放入10 mL玻璃試管中，加入10 mL提取液，混勻后密封浸提24 h ; 提取完成后，用不含脂肪的濾紙過(guò)濾，再加入5 mL提取液沖洗殘?jiān)?次濾液合并保存；所述提取液為體積比為2:1的氯仿:甲醇； (3)取脂肪提取液5mL，加入3 mL 10% KOH甲醇溶液，混勻后，置于80 1:水浴反應(yīng)Ih;室溫冷卻后，加入3 mL 14% BF3甲醇溶液(v/v)混勻后，于50 1:水浴反應(yīng)10 min ;冷卻后，加入3 mL正己烷，震蕩渦旋，室溫靜置過(guò)夜；取上層正己烷層至進(jìn)樣小瓶，-18 °C冷凍，待GC-MS分析； (4)將進(jìn)樣瓶中的脂肪酸甲酯進(jìn)行氣相色譜質(zhì)譜分析，色譜條件:色譜柱為安捷倫DB-5MS石英毛細(xì)管柱30.0 mX0.25 mmX0.25 μ m ;載氣為高純氦氣；流速I(mǎi) mL/min ;程序升溫:60 °C保持I min,以10 V /min升至160 °C并保持4 min,以5°C /min升至260 V并保持5min,以5 °C/min升至280 °C并保持I min ;分流比20:1 ;進(jìn)樣量I μ L ;質(zhì)譜條件=EI離子源；電子能量70 eV ;離子源溫度220 V ;進(jìn)樣口溫度240°C，質(zhì)量掃描范圍:m/z 40~600 ;溶劑切除時(shí)間2.5 min。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:在進(jìn)行氣相色譜質(zhì)譜分析之后，還包括對(duì)分析的脂肪酸甲酯計(jì)算保留指數(shù)進(jìn)行計(jì)算的步驟: (1)將正構(gòu)烷烴混合標(biāo)準(zhǔn)品C8-C40以脂肪酸甲酯分析的條件進(jìn)行氣相色譜質(zhì)譜分析； (2)記錄每個(gè)正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間；采用保留指數(shù)的線性升溫公式:i?/ = 10Cte+100^^計(jì)算各組分的RI值，其中:tx、tjP t(n+1)分別為被分析組分和碳原子數(shù)處于η和η+1之間的正構(gòu)烷烴混標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品的流出峰保留時(shí)間(min)； (3)根據(jù)http://webbook.nist.gov/chemistry/搜索文獻(xiàn)得相應(yīng)色譜柱各脂肪酸甲酯的保留指數(shù)RI，結(jié)合質(zhì)譜庫(kù)檢索，同時(shí)運(yùn)用面積歸一化法計(jì)算各脂肪酸的相對(duì)百分含量。
【文檔編號(hào)】G01N30/06GK103675136SQ201310668383
【公開(kāi)日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年12月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月11日
【發(fā)明者】焦豐龍, 洪一江, 魏遠(yuǎn)隆, 王軍花, 盛軍慶, 王誠(chéng)遠(yuǎn), 侯喜洋 申請(qǐng)人:南昌大學(xué)