用于檢測細(xì)菌的陣列式多重電化學(xué)恒溫?cái)U(kuò)增芯片及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于電化學(xué)檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，具體為一種用于細(xì)菌檢測的陣列式多重電化學(xué)的恒溫?cái)U(kuò)增芯片及其制備方法。該芯片由激光刻蝕的ITO玻璃電極基底和聚二甲基硅氧烷微芯片組成。以ITO玻璃和聚二甲基硅氧烷為材料，通過激光刻蝕和微加工技術(shù)制備而成。該芯片空間陣列有序排列，利用擴(kuò)增信號的空間區(qū)分來實(shí)現(xiàn)多重核酸目標(biāo)物的同時(shí)檢測；每個(gè)擴(kuò)增池中分別含有一套三電極體系：工作電極、對電極、參比電極，通過與外界多通道電化學(xué)工作站相連接，并進(jìn)行LAMP恒溫反應(yīng)，進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測；通過對實(shí)時(shí)曲線圖進(jìn)行數(shù)據(jù)處理得到定量分析結(jié)果。該芯片制作簡單，操作方便，易于大規(guī)模制備，為LAMP方法實(shí)現(xiàn)臨床多種病原體同時(shí)定量檢測提供了有效方案。
【專利說明】用于檢測細(xì)菌的陣列式多重電化學(xué)恒溫?cái)U(kuò)增芯片及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于電化學(xué)檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種陣列式多電化學(xué)恒溫?cái)U(kuò)增芯片及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]上呼吸道感染，是指發(fā)生在呼吸道的急性感染，包括普通感冒、流行性感冒、鼻咽炎、咽扁桃腺炎及喉炎等，多呈自限性，但發(fā)生率較高。感染的病原體80%是病毒，其次為細(xì)菌。而78%的病人被診斷服用對病毒無效的抗生素，這將嚴(yán)重導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。臨床上診斷一般通過血清學(xué)和細(xì)菌培養(yǎng)的方法診斷，靈敏度較低，耗時(shí)長。因此，及時(shí)定性定量檢測引起感冒的細(xì)菌，對于臨床上對癥下藥及判斷疾病程度有重大意義。
[0003]環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增(Loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)最早由日本科學(xué)家發(fā)明，該及時(shí)具有靈敏度高、特異性好、反應(yīng)速度快、反應(yīng)條件簡單等優(yōu)點(diǎn)，經(jīng)過近10年的學(xué)術(shù)研究，現(xiàn)以各種檢測試劑盒的形式進(jìn)入市場。但是LAMP反應(yīng)的定量分析需要昂貴精密的儀器，設(shè)備精良的實(shí)驗(yàn)室和受過專門訓(xùn)練的技術(shù)人員。這對于及時(shí)診斷，尤其是在經(jīng)濟(jì)不發(fā)達(dá)的地區(qū)的診斷是不適用的。電化學(xué)微陣列技術(shù)，集合了微流控技術(shù)和電化學(xué)方法，利用了微流控技術(shù)在微米尺度下層流效應(yīng)、表面張力效應(yīng)、毛細(xì)管效應(yīng)的大幅度增強(qiáng)，和電化學(xué)儀器經(jīng)濟(jì)易得，便于操作的優(yōu)點(diǎn)。傳統(tǒng)的電極制備方法包括電極印刷，電鍍，電沉積技術(shù)，但電鍍和電沉積技術(shù)較為繁瑣，不易于商品化，印刷電極導(dǎo)電性和重現(xiàn)性一般。而激光刻蝕銦錫氧化物(indium tin oxide, ITO)玻璃電極，利用激光精準(zhǔn)的刻蝕出電極，既保留了印刷電極的價(jià)格低廉，易于大規(guī)模制作的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)改善其缺點(diǎn)，做到導(dǎo)電性，重現(xiàn)性好，能根據(jù)個(gè)人意圖設(shè)計(jì)任何圖案的目的。該技術(shù)將對電化學(xué)、生命科學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用于細(xì)菌檢測的陣列式多重電化學(xué)恒溫?cái)U(kuò)增芯片及其制備方法。
[0005]本發(fā)明提供的用于細(xì)菌檢測的陣列式多重電化學(xué)恒溫?cái)U(kuò)增芯片，它由激光刻蝕的ITO玻璃電極基底和聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane，PDMS)微芯片構(gòu)成。見附圖1所示。其中，ITO玻璃電極，由多個(gè)單獨(dú)陣列獨(dú)立構(gòu)成，每個(gè)陣列均由三電極體系組成，陣列數(shù)量可依據(jù)模板檢測物的需求設(shè)計(jì)，如三重，五重，八重等等，不受限制。電化學(xué)信號通過加入電化學(xué)活性分子亞甲基藍(lán)來檢測，其與LAMP反應(yīng)中不斷生成的雙鏈DNA有相互作用，在不同反應(yīng)階段有不同作用，并有多通道電化學(xué)工作站進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測，從而達(dá)到多重實(shí)時(shí)檢測的目的。
[0006]本發(fā)明還提供上述擴(kuò)增芯片的制備方法，其具體步驟為:
a.1TO玻璃電極基底的制備:電極是可以任何形狀，由激光精準(zhǔn)的刻蝕在一定大小的ITO玻璃上，只要刻蝕圖案的地方是導(dǎo)電的。它可以包括若干個(gè)單獨(dú)的工作電極，若干個(gè)對電極相，互連接形成一個(gè)大環(huán)，并引出電化學(xué)池，以便與外部導(dǎo)線連接；所有的參比電極匯集到中間形成一個(gè)圓，并沉積Ag/AgCl ；
b.1TO玻璃電極的預(yù)處理:將刻蝕好的IT0玻璃電極依次用蒸餾水、無水乙醇及二次蒸餾水超聲清洗干凈，待用；
c.PDMS芯片的構(gòu)造:包括有若干個(gè)圓形擴(kuò)增池，每個(gè)通道分別有加樣孔、排液孔，所有擴(kuò)增池都互相隔離，不受干擾；
d.芯片模板的制作:利用微加工技術(shù)(如MEMS、光刻等)，制作芯片模板，模板結(jié)構(gòu)與上述PDMS芯片構(gòu)造相對應(yīng)，模板材料可以為硅材料；
e.芯片澆注，脫氣和固化:將二甲基硅氧烷和固化劑混合均勻后，傾倒于芯片模板上，真空脫氣，固化，分別開若干個(gè)加樣孔、排液孔，將芯片裁減成相應(yīng)的形狀；
f.通過等離子處理，將處理好的IT0玻璃電極與PDMS芯片鍵合；
g.將鍵合的芯片用導(dǎo)電銀膠連接導(dǎo)線，晾干后，使用萬能膠再次固定。
[0007]本發(fā)明提供的上述擴(kuò)增芯片可直接用于細(xì)菌DNA的電化學(xué)檢測；其檢測方法如下:
將所述芯片的工作電極、對電極和參比電極與多通道電化學(xué)工作站相連接，組成多個(gè)三電極系統(tǒng)；將配置好的適量LAMP反應(yīng)混合液從加樣孔加入,LAMP反應(yīng)混合液中含一定量的亞甲基藍(lán)溶液，一定量細(xì)菌裂解液和LAMP反應(yīng)試劑；將芯片置于恒溫加熱板上加熱，當(dāng)溫度達(dá)到63°C時(shí)，開始電化學(xué)測量；在一定電位范圍內(nèi)進(jìn)行方波伏安法掃描，每隔1分鐘測量一次，得到實(shí)時(shí)檢測數(shù)據(jù)；處理所得結(jié)果，得到不同濃度細(xì)菌的時(shí)間與濃度的對數(shù)的線性關(guān)系曲線，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法對臨床樣本進(jìn)行分析檢測。
[0008]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)如下:
(1)本發(fā)明利用了 ΙΤ0刻蝕電極的優(yōu)點(diǎn)，可由激光精準(zhǔn)刻蝕出任意電極圖案，不僅避免了復(fù)雜的電沉積、電鍍等復(fù)雜的工藝流程，還保留了印刷電極大批量生產(chǎn)，成本低的優(yōu)點(diǎn)，其導(dǎo)電性和重現(xiàn)性優(yōu)異。
[0009](2)本發(fā)明利用LAMP技術(shù)恒溫?cái)U(kuò)增的優(yōu)點(diǎn)，并結(jié)合電化學(xué)工作站成本低，簡單，易操作等優(yōu)點(diǎn)，避免了使用昂貴的實(shí)驗(yàn)器材，非常有利于LAMP方法在基層的推廣和應(yīng)用。
[0010](3)利用電化學(xué)工作站多通道檢測的優(yōu)點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)多重檢測，以便快速鑒定多重病原體。
[0011](4)從加樣到得到定量檢測結(jié)果，不超過lh，簡單快速。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1為陣列式多重電化學(xué)恒溫?cái)U(kuò)增芯片圖示。其中，上部分為擴(kuò)增芯片實(shí)物圖，下部分為ΙΤ0刻蝕玻璃電極基底結(jié)構(gòu)示意圖。
[0013]圖2為引起呼吸道感染的肺結(jié)核桿菌(a-e，2.8X105, 2.8Χ104,…，2.8Χ101copies/ μ L)的時(shí)間-電流微分曲線圖。其中，右圖為細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)溶液的時(shí)間-log(濃度)曲線圖。
[0014]圖3為引起呼吸道感染的流感嗜血桿菌(a-e，1.7 X105, 1.7 Χ104,…，1.7Χ101 copies/ μ L)的時(shí)間-電流微分曲線圖。其中，右圖為細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)溶液的時(shí)間-log (濃度)曲線圖。
[0015]圖4為引起呼吸道感染的肺炎克雷伯菌(a-e，1.6X105, 1.6Χ104,…，1.6Χ101 copies/ μ L)的時(shí)間-電流微分曲線圖。其中，右圖為細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)溶液的時(shí)間-log (濃度)曲線圖。
[0016]圖中標(biāo)號:1為擴(kuò)增池，2為加樣孔,3為排液孔,4為工作電極,5為對電極,6為參比電極。
【具體實(shí)施方式】
[0017]下面結(jié)合具體實(shí)例對本發(fā)明做進(jìn)一步描述，但具體實(shí)例并不對本發(fā)明做任何限定。
實(shí)施例
[0018]利用此陣列式多重電化學(xué)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)平臺，開發(fā)了一款八通道的，肺結(jié)核桿菌，流感嗜血桿菌，肺炎克雷伯菌分型的陣列式多重電化學(xué)恒溫?cái)U(kuò)增芯片。
[0019]本實(shí)施例中的用于細(xì)菌檢測的陣列式多重電化學(xué)恒溫?cái)U(kuò)增芯片的制備步驟如下:
(1)ΙΤ0玻璃電極基底的制備:由激光精準(zhǔn)的刻蝕在4cm寬，1mm厚的ΙΤ0玻璃上刻蝕出八卦陣形狀的陣列式電極，只有刻蝕圖案的地方是導(dǎo)電的。它包括八個(gè)單獨(dú)的工作電極，一個(gè)對電極相互連接形成一個(gè)大環(huán)，并引出電化學(xué)池以便與外部導(dǎo)線連接。所有的參比電極匯集到中間形成一個(gè)圓，并沉積Ag/AgCl ;將刻蝕好的ΙΤ0玻璃電極依次用蒸餾水、無水乙醇及二次蒸餾水超聲清洗干凈，待用；
(2)PDMS芯片的制備:它包括若八個(gè)圓形擴(kuò)增池，每個(gè)通道分別有加樣孔、排液孔。所有擴(kuò)增池都互相隔離，不受干擾；利用微加工技術(shù)(MEMS、光刻等)的方法制作芯片模板，模板結(jié)構(gòu)與上述PDMS芯片構(gòu)造相對應(yīng)，|旲板材料可以為娃材料；將二甲基硅氧烷和固化劑燒氧基硅烷按質(zhì)量比5-12:1混合均勻后，小心傾倒于芯片模板上，真空脫氣30min后80°C固化2h，分別開若干個(gè)加樣孔，排液孔和；將芯片裁減成八邊形；
(3)用于細(xì)菌檢測的陣列式多重電化學(xué)恒溫?cái)U(kuò)增芯片的制備:通過等離子處理，將上述處理好的ΙΤ0玻璃電極與PDMS芯片永久鍵合；將鍵合的芯片用導(dǎo)電銀膠連接導(dǎo)線，過夜晾干后，使用萬能膠再次固定。
[0020]本實(shí)施例的電化學(xué)監(jiān)測
在6個(gè)擴(kuò)增池中兩兩分別加入含有1.6 μ L的三種細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)樣本和10 μ Μ亞甲基藍(lán)的LAMP反應(yīng)液20 μ L，其中含10 μ Μ亞甲基藍(lán)溶液；另外兩個(gè)擴(kuò)增池中不含細(xì)菌樣本，作為空白對照。封閉反應(yīng)孔，相應(yīng)電極與八通道電化學(xué)工作站的導(dǎo)線相連，并將芯片置于恒溫加熱板上加熱，當(dāng)溫度達(dá)到63°C時(shí)，開始電化學(xué)測量；從-0.6 V到-0.1 V的電位范圍內(nèi)進(jìn)行方波伏安法掃描，每隔1分鐘測量一次，得到實(shí)時(shí)檢測數(shù)據(jù)；處理所得結(jié)果，得到三組不同濃度細(xì)菌的時(shí)間與濃度的對數(shù)的線性關(guān)系曲線，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法對臨床樣本進(jìn)行分析檢測，如圖2、圖3和圖4所示。肺結(jié)核桿菌(a-e，2.8X105，2.8 X104,…，2.8Χ101copies/ μ L),流感嗜血桿菌(a_e, 1.7X ΙΟ5, 1.7X ΙΟ4,…，1.7X 101 copies/ μ L),肺炎克雷伯菌(a-e，1.6X 105, 1.6X 104,…，L 6X 101 copies/ μ L)的線性方程分別為 yl=-4.62x+45.930 ；yl=-6.95962x+51.928; y3=-6.26595x+44.8908，線性相關(guān)系數(shù)分別為，rl= 0.9917; r2=0.9944; r3=0.9943 ;檢測限分別為 28 copies/ μ L, 17 copies/ μ L,16 copies/ μ L。
[0021]本發(fā)明通過陣列式微流控芯片與電化學(xué)方法相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)多種細(xì)菌的LAMP信號實(shí)時(shí)檢測，改善了 LAMP反應(yīng)需要精密昂貴儀器的現(xiàn)狀，非常有利于LAMP方法在基層的推廣和應(yīng)用。通過激光刻蝕ΙΤ0玻璃制備電極的方法，避免了復(fù)雜的電沉積、電鍍等復(fù)雜的工藝流程，同時(shí)可以根據(jù)需要實(shí)現(xiàn)芯片上擴(kuò)增池的任意多重空間陣列排布。該芯片結(jié)構(gòu)模式理論上具有無限的可擴(kuò)展性，可以根據(jù)實(shí)際需求完成任意多重的LAMP有效擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)多靶點(diǎn)的快速定量檢測，從而滿足臨床任意多種病原體或遺傳性疾病的快速診斷。
【權(quán)利要求】
1.一種用于細(xì)菌檢測的陣列式多重電化學(xué)恒溫?cái)U(kuò)增芯片，其特征在于由激光刻蝕的ITO玻璃電極基底和聚二甲基硅氧烷(PDMS)微芯片構(gòu)成；其中，ITO玻璃電極由多個(gè)單獨(dú)陣列獨(dú)立構(gòu)成，每個(gè)陣列均由三電極體系組成，陣列數(shù)量依據(jù)模板檢測物的需求設(shè)計(jì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于細(xì)菌檢測的陣列式多重電化學(xué)恒溫?cái)U(kuò)增芯片，其特征在于所述電極為任何形狀，由激光精準(zhǔn)的刻蝕在一定大小的ITO玻璃上，刻蝕圖案的地方導(dǎo)電；它包括若干個(gè)單獨(dú)的工作電極，若干個(gè)對電極相，互連接形成一個(gè)大環(huán)，并引出電化學(xué)池，以便與外部導(dǎo)線連接；所有的參比電極匯集到中間形成一個(gè)圓，并沉積Ag/AgCl。
3.—種如權(quán)利要求1或2所述的用于細(xì)菌檢測的陣列式多重電化學(xué)恒溫?cái)U(kuò)增芯片的制備方法，其特征在于具體步驟為: a.1TO玻璃電極基底的制備:電極為任何形狀，由激光精準(zhǔn)的刻蝕在一定大小的ITO玻璃上，刻蝕圖案的地方導(dǎo)電；它包括若干個(gè)單獨(dú)的工作電極，若干個(gè)對電極相，互連接形成一個(gè)大環(huán)，并引出電化學(xué)池，以便與外部導(dǎo)線連接；所有的參比電極匯集到中間形成一個(gè)圓，并沉積Ag/AgCl ； b.1TO玻璃電極的預(yù)處理:將刻蝕好的ITO玻璃電極依次用蒸餾水、無水乙醇及二次蒸餾水超聲清洗干凈，待用； c.PDMS芯片的制備:PDMS芯片包括有若干個(gè)圓形擴(kuò)增池，每個(gè)通道分別有加樣孔、排液孔，所有擴(kuò)增池都互相隔離，不受干擾； d.芯片模板的制作:利用微加工技術(shù)制作芯片模板，模板結(jié)構(gòu)與上述PDMS芯片構(gòu)造相對應(yīng)，模板材料為硅材料； e.芯片澆注，脫氣和固化:將二甲基硅氧烷和固化劑混合均勻后，傾倒于芯片模板上，真空脫氣，固化，分別開若干個(gè)加樣孔、排液孔，將芯片裁減成相應(yīng)的形狀； f.通過等離子處理，將處理好的ITO玻璃電極與PDMS芯片鍵合； g.將鍵合的芯片用導(dǎo)電銀膠連接導(dǎo)線，晾干后，使用萬能膠再次固定。
4.如權(quán)利要求1或2所述的陣列式多重電化學(xué)恒溫?cái)U(kuò)增芯片在細(xì)菌DNA電化學(xué)檢測中的應(yīng)用，其特征在于具體步驟如下: 將所述芯片的工作電極、對電極和參比電極與多通道電化學(xué)工作站相連接，組成多個(gè)三電極系統(tǒng)；將配置好的LAMP反應(yīng)混合液從加樣孔加入，LAMP反應(yīng)混合液中含一定量亞甲基藍(lán)溶液、細(xì)菌裂解液和LAMP反應(yīng)試劑；將芯片置于恒溫加熱板上加熱，當(dāng)溫度達(dá)到63°C時(shí)，開始電化學(xué)測量；在一定電位范圍內(nèi)進(jìn)行方波伏安法掃描，每隔I分鐘測量一次，得到實(shí)時(shí)檢測數(shù)據(jù)；處理所得結(jié)果，得到不同濃度細(xì)菌的時(shí)間與濃度的對數(shù)的線性關(guān)系曲線，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法對臨床樣本進(jìn)行分析檢測。
【文檔編號】G01N27/30GK103645229SQ201310676222
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月12日
【發(fā)明者】孔繼烈, 羅娟 申請人:復(fù)旦大學(xué)