一種檢測丙肝核心抗原的標記物及試劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及丙肝檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種檢測丙肝核心抗原的標記物，含有摩爾比為20∶1的辣根過氧化物酶與L-賴氨酸羧甲基半胱氨酸聚合物。一種檢測丙肝核心抗原的試劑，含有上述的檢測丙肝核心抗原的標記物。還含有緩沖體系和顯色劑。以L-賴氨酸羧甲基半胱氨酸聚合物為載體使抗體與HRP連接在一起，反應(yīng)信號可通過連接的HRP催化底物系統(tǒng)而體現(xiàn)，因此，檢測的靈敏度大幅提高。利用該方法將HCV核心抗原單克隆抗體與HRP偶聯(lián)，進而增加抗體與HRP的比率，增加檢測的靈敏度，有效縮短檢測的窗口期。
【專利說明】—種檢測丙肝核心抗原的標記物及試劑
[0001]【技術(shù)領(lǐng)域】
本發(fā)明涉及丙肝檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種檢測丙肝核心抗原的標記物，還涉及一種檢測丙肝核心抗原的試劑。
[0002]【背景技術(shù)】
丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(HCV)感染引起的一種重要的傳染病，主要通過血液傳播。多數(shù)HCV感染并無癥狀，感染丙肝病毒后形成慢性感染機率高，多數(shù)患者會發(fā)展成肝硬化、肝癌。為此，感病后早檢出丙肝病毒感染，及時有效的阻斷HCV的傳播是非常重要的。
[0003]檢測丙型肝炎病毒(!fepatitis C virus，HCV)核心抗原可以直觀地反映出HCV的感染狀況，并有效縮短HCV感染的檢測窗口期。但由于人在感染后，核心抗原在血液中存在的時間短且含量低，采用高靈敏的方法檢測來提高準確性。
[0004]在免疫分析方法中，抗原或抗體標記物不僅決定免疫分析方法的分類，而且也決定免疫分析的靈敏度及特異性。傳統(tǒng)的標記物為辣根過氧化物酶(HRP)標記抗原或抗體，應(yīng)用酶上的氨基、巰基或糖蛋白上的羥基作為交聯(lián)基團，通過過碘酸鈉將抗原或抗體與酶直接連接在一起。抗原抗體反應(yīng)信號通過HRP催化底物來顯現(xiàn)。一般I個抗原或抗體分子上僅能連接I~2個HRP分子，檢測靈敏度低。
[0005]
【發(fā)明內(nèi)容】

為了解決以上現(xiàn)有技術(shù)中存在的抗原或抗體標記物靈敏度及特異性差的問題，本發(fā)明提供了一種增加檢測的靈敏度、有效縮短檢測的窗口期的檢測丙肝核心抗原的標記物。
[0006]本發(fā)明還提供了含有上述標記物的檢測丙肝核心抗原的試劑。
[0007]本發(fā)明是通過以下措施實現(xiàn)的:
一種檢測丙肝核心抗原的標記物，含有摩爾比為20: I的辣根過氧化物酶與L-賴氨酸羧甲基半胱氨酸聚合物。
[0008]所述的標記物，通過以下步驟得到的:
(O經(jīng)活化的辣根過氧化物酶，與L-賴氨酸羧甲基半胱氨酸聚合物混合，室溫條件下反應(yīng)2-2.5h,經(jīng)封閉液處理后分離未連接的辣根過氧化物酶,收集第I洗脫峰,為L-賴氨酸羧甲基半胱氨酸與HRP的結(jié)合物，加入10%體積的IOmg / mL EMCS (3- (N-嗎啡啉)丙磺酸鈉鹽)，室溫反應(yīng)2.5h洗脫得結(jié)合物；
(2)取純化的單抗，調(diào)整濃度至5.0mg/mL，每毫升中加入6.0mg β -巰基乙胺，37°C保溫90min，并洗脫還原，將還原的抗體與結(jié)合物按照質(zhì)量比1:1的比例混合，4°C避光反應(yīng)24h，洗脫，收集第I峰，即得。
[0009]所述的標記物,優(yōu)選步驟(2)中洗脫為過Superdex 200分子篩層析柱。
[0010]一種檢測丙肝核心抗原的試劑，含有上述的檢測丙肝核心抗原的標記物。
[0011]所述的試劑，還含有緩沖體系和顯色劑。
[0012]目前，HCV核心抗原檢測是診斷HCV感染的新方法，與HCV抗體檢測比較，能縮短HCV檢測的窗口期，但由于HCV出現(xiàn)在血清中有一定的時限，且含量低，因此需要靈敏度較高的檢測方法。標記物為免疫檢測中的重要成分，本研究在HCV檢測中抗原、抗體不變的情況下，通過改進標記物進而提高了檢測的靈敏度。本研究的標記物也可應(yīng)用于其他免疫檢測中，如果與靈敏度更高的化學發(fā)光或免疫熒光法結(jié)合，則可以檢測更微量的物質(zhì)。
[0013]本研究所制備的聚合物標記物的每個標記物上可連接多個抗體分子，同時在HRP的外圍或多聚多肽上連接數(shù)個抗體分子。采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法檢測丙型肝炎病毒核心抗原，配以陰陽對照以及顯色劑等試劑，定性檢測人血清樣品中丙型肝炎病毒核心抗原。該系統(tǒng)驗證結(jié)論的同時，具有耗時短、試劑穩(wěn)定性好、無污染等優(yōu)點。
[0014]本發(fā)明的有益效果:
以L-賴氨酸羧甲基半胱氨酸聚合物為載體使抗體與HRP連接在一起，反應(yīng)信號可通過連接的HRP催化底物系統(tǒng)而體現(xiàn)，因此，檢測的靈敏度大幅提高。利用該方法將HCV核心抗原單克隆抗體與HRP偶聯(lián)，進而增加抗體與HRP的比率，增加檢測的靈敏度，有效縮短檢測的窗口期。
【具體實施方式】
[0015]為了更好的理解本發(fā)明，下面結(jié)合具體實施例來進一步說明。
[0016]實施例1:
一種檢測丙肝核心抗原的標記物，是通過以下步驟得到的:
(1)活化的辣根過氧化物酶HRP，與L-賴氨酸羧甲基半胱氨酸聚合物按照20:1的摩爾比混合，室溫條件下反應(yīng)2h，經(jīng)封閉液處理后分離未連接的HRP，收集第I洗脫峰，為L-賴氨酸羧甲基半胱氨酸與HRP的結(jié)合物，加入10%體積的IOmg / mLEMCS，室溫反應(yīng)2.5h洗脫得到結(jié)合物；· (2)純化的單抗，調(diào)整濃度至5.0mg/mL,每毫升中加入6.0mg β -巰基乙胺，37°C保溫90min洗脫還原，將還原的抗體與結(jié)合物按照質(zhì)量比1:1的比例混合，4°C避光反應(yīng)24h，過Superdex 200分子篩層析柱洗脫，收集第一峰，即得。
[0017]對比實施例1:過碘酸鈉法得到的標記物
應(yīng)用傳統(tǒng)的配比配方及濃度，HRP:1gG按照摩爾比5:1加入到標記抗體中，經(jīng)pH值調(diào)整、封閉等步驟后分離純化酶標抗體。
[0018]靈敏度檢測試驗
1、血清的處理及保存
為保證實驗的準確性，降低干擾，血清的處理及保存嚴格按以下操作執(zhí)行(I)血清在操作過程中避免任何細胞刺激，使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，收集血液后，1000Xg離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離；(2)細胞上清液---1OOOXg離心10分鐘去除顆粒和聚合物；(3)如果樣品不立即使用，應(yīng)將其分成小部分-70°C保存，避免反復(fù)冷凍；如果血清中大量顆粒，檢測前先離心或過濾，不要在37°C或更高的溫度加熱解凍，應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
[0019]2、采用兩種標記物以ELISA法檢測HCV核心抗原
2.1實驗方法
將兩種標記物稀釋成ELISA工作液(含HRP 500ng/mL)，用相同的酶標板及檢測系統(tǒng)分別進行檢測。檢測之前，首先對人血清樣本進行預(yù)處理，將預(yù)處理好的血清樣本和HCV核心抗原加入含有抗HCV核心抗原抗體的微孔中，每個小孔加入樣本液ΙΟΟμ L，37°C反應(yīng)I小時；用稀釋過的清洗液洗板5次后，分別加入100 μ L兩種標記物，37°C條件下反應(yīng)半小時；清洗一次后加入底物，顯色10 min，測定450 nm下各孔的吸光值。
[0020]結(jié)果判定:Cutoff值=陰性樣本平均值X2.1。
[0021]2.2兩種標記物檢測靈敏度的比較
將HCV核心抗原系列稀釋，每次檢測10孔，分別檢測3次，計算A450值的平均值及標準差(s)，按公式x+2s得到的Al值與系列稀釋抗原的A值進行比較，其高于Al值的HCV核心抗原最低稀釋度為檢測的靈敏度。
[0022]過碘酸鈉法標記物的最低檢測限為10.0pg/mL，本發(fā)明標記物的最低檢測限為
2.0pg/mL,見表 1。
[0023]表1兩種標記物靈敏度測定的平均值
【權(quán)利要求】
1.一種檢測丙肝核心抗原的標記物，其特征在于含有摩爾比為20: I的辣根過氧化物酶與L-賴氨酸羧甲基半胱氨酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的標記物，其特征是通過以下步驟得到的: (O經(jīng)活化的辣根過氧化物酶，與L-賴氨酸羧甲基半胱氨酸混合，室溫條件下反應(yīng)2-2.5h，經(jīng)封閉液處理后分離未連接的辣根過氧化物酶，收集第I洗脫峰，為L-賴氨酸羧甲基半胱氨酸與辣根過氧化物酶的結(jié)合物，加入10%體積的IOmg / mL 3- (N-嗎啡啉)丙磺酸鈉鹽，室溫反應(yīng)2.5h洗脫得結(jié)合物； (2)取純化的單抗，調(diào)整濃度至5.0mg/mL，每毫升中加入6.0mg β -巰基乙胺，37°C保溫90min，并洗脫還原，將還原的抗體與結(jié)合物按照質(zhì)量比1:1的比例混合，4°C避光反應(yīng)24h，洗脫，收集第I峰，即得。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的標記物，其特征在于步驟(2)中洗脫為過分子篩層析柱洗脫。
4.一種檢測丙肝核心抗原的試劑，其特征在于含有權(quán)利要求1-3中任一項所述的檢測丙肝核心抗原的標記物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑，其特征在于還含有緩沖體系和顯色劑。
【文檔編號】G01N33/576GK103675280SQ201310690679
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月17日
【發(fā)明者】甘宜梧, 葉麗華, 譚柏清 申請人:山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司